The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

<ol>
	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

هنا، وصفنا بروتوكولين، والتي يمكن استخدامها للبروتينات التي تحتوي على ثيول زوجين لamine- او الخرز البوليسترين المعدلة الكربوكسيل، على التوالي. نظرا لسهولة هذا الإجراء، ثيول-أمين اقتران هو الأفضل، ولكن اعتمادا على مواصفات حبة المطلوب (قطر، خصائص مضان)، واستخدام الخرز functionalized أمين قد لا يكون ممكنا وقمنا بالتالي تضمن البروتوكول الذي سيتم تحويل الكربوكسيل - إلى شاردة أمين لإعطاء الباحث أكبر قدر ممكن من المرونة في اختيار سقالة. على الرغم من أن كلا ثيول-أمين وثيول-الكربوكسيل عمل اقتران لأي السيستين التي تحتوي على البروتين، واقتران الاتجاه (أي الشلل في البروتين لكل من N-محطة، ومحاكاة سطح الشاشة) يتطلب البروتين دون بقايا السيستين، التي يتم إنتاجها كما الانصهار GST البروتين، أو التي تحتوي على واحدة محطة بقايا السيستين الذي عرضته موقع الموجهة الطفرات. إذا ما تم احتواء متعددة cysteines رد الفعلداخل البروتين، وهذا سوف يؤدي إلى الشلل العشوائي الذي قد يعرقل وظيفة البروتين. العديد من adhesins البكتيرية لا تحتوي على cysteines بشكل طبيعي. بالنسبة للآخرين، وهذه قد يمكن إزالتها عن طريق موقع موجه الطفرات، على الرغم من أن ذلك يتطلب فحوصات مكثفة لضمان الاحتفاظ بنية الأصلي وظيفة في متحولة. لGST البروتينات الانصهار، والنقاء GST-العلامة جانب لحبات يمكن أن تستخدم لمراقبة سلبية مناسبة. باستخدام الخرز وفكت كعنصر تحكم ينبغي تجنبها، وهذه غالبا ما يكون الميل العالي لتتجمع معا أو الانضمام إلى خلايا غير وجه التحديد. نسخة مبسطة من بروتوكول 1.2، فقط باستخدام EDC، ويمكن استخدامها للبروتينات الزوجين الخرز البوليمر functionalized الكربوكسيل، ولكن في هذه الحالة اقتران تتم عن طريق الأمينات الأولية في البروتين، وبالتالي لا يضمن اقتران الاتجاه. TCEP كعامل مختزل يجب عدم استبدال غيرها من عوامل خفض المتاحة تجاريا والتي يشيع استخدامها، مثل dithiothreitol (DTT) أو 2-المركابتويثانول (BME)، كما التجولات الواردة في داخلها سوف تتنافس مع البروتين اقتران في خطوة اقتران ثيول maleimide. PBS يمكن استبدال مع مخازن أخرى، ولكن مع الاعتبارات التالية: قد لا يحتوي على المخازن الأمينات الأولية (حتى مخازن تريس التي تحتوي على ليست مناسبة). استخدام المخازن التي تحتوي على (&lt;10MM) تركيزات منخفضة جدا الملح يؤدي إلى تراكمها وحبة كما ينبغي تجنبها. نقاء البروتين هو أيضا عامل مهم للنظر خلال هذا الإجراء، والحصول على بيانات ذات جودة عالية، وينبغي أن تستخدم بروتينات نقية. نحن بشكل روتيني تنقية البروتينات في خطوات متعددة، بما في ذلك على الأقل خطوة تنقية تقارب والترشيح هلام، ولكن يحدث في بعض الحالات التبادل الأيوني اللوني كخطوة ثالثة. ونتيجة لذلك نقاء البروتينات المستخدمة لاقتران هو عادة 90٪ أو أعلى، كما تقرره SDS-PAGE. فمن المستحسن لتحديد تركيزات البروتين سواء في خليط التفاعل الأولي وكذلك من الالبريد طاف بعد الانتهاء رد فعل. هذا سوف يساعد على تحديد تركيز واضح من البروتين بالإضافة حبة، وبالتالي كثافة اقتران. وتحديد كل من القيم أيضا تسمح حساب كفاءة اقتران. يمكن أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند إعداد الحل البروتين الأولي في التفاعلات اللاحقة، لتحقيق التركيز واقتران النهائية الكثافة المطلوبة. هي مناسبة برادفورد كاشف ولا سيما لتحديد تركيز البروتين قبل وبعد رد فعل اقتران، لأن أيا من المواد في رد فعل يتداخل مع تشكيل الصبغة المعقدة في التراكيز المستخدمة. إذا تركيزات البروتين أقل لاستخدامه، قد يكون هذا الأسلوب لتحل محلها طريقة الكشف أكثر حساسية، ولكن الاهتمام يجب أن يدفع ذلك إلى حقيقة أن لديها لتكون متوافقة مع المواد الواردة في رد فعل اقتران. ويوصى أيضا إلى استخدام الطازجة الكواشف والتعامل مع المواد الكيميائية مسحوق مع الرعاية (على سبيل المثال، مخزن<html> في حاوية مغلقة واستخدام الخرز السيليكا، لتجنب الكواشف رسم الرطوبة) منذ نوعية الكواشف سوف تؤثر على كفاءة اقتران. اذا كانت كفاءة اقتران أقل مما كان متوقعا، والعلاجات المحتملة تشمل زيادة تركيزات حبة والبروتين الأولية. إذا كان يتم استخدام تركيزات أعلى، وتركيز الكواشف اقتران لابد من زيادة نسبيا لضمان زيادة المولي كافية. تعديل تركيزات حبة / البروتين وعادة ما يكون خطوة أفضل نحو التحسين بدلا من زيادة أوقات رد الفعل. منذ بروتوكولات للحبة اقتران تستغرق وقتا طويلا، ونحن عادة إعداد دفعة كبيرة من المواد. aliquots من تعليق يمكن تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل وتخزينه في -20 درجة مئوية لعدة أشهر. لا ينبغي أن refrozen قسامات إذابة ويجب أن تبقى في 4 درجات مئوية وتستخدم في غضون 1-2 أيام. ومع ذلك، فإن هذا سوف تختلف مع طبيعة واستقرار بروتين يستخدم كما يجب اختبارها على دفعة صغيرة في البداية. الصورة = &quot;jove_content&quot;&gt; adhesins حبة الديناميكي يمكن استخدامها في العديد من التطبيقات، كما هو مبين أدناه. ووصف هذا البروتوكول مقايسة يستخدم عادة لقياس تثبيط للخلايا ملزمة وبوساطة العوامل المسببة للأمراض البكتيرية في الخلايا المضيفة. يتم إجراء الفحص عادة لقياس قدرة MAMs يقترن حبة لمنع تنافسية إصابة الخلايا الظهارية هيلا مع البحر التي تنقلها الأغذية الممرض الضمة نظيرة الحالة للدم، وذلك باستخدام إما انخفاضا في التصاق البكتيريا الى الخلايا المضيفة أو تخفيض السمية الخلوية كما للقراءة خارج . في كلتا الحالتين، وإعداد المقايسات والمنافسة تتبع نفس البروتوكول. اعتمادا على قراءات، سلالات مختلفة من V. تستخدم نظيرة الحالة للدم: سلالة السامة للخلايا يستخدم POR1 لقياس السمية الخلوية، في حين تم استخدام نوع غير السامة للخلايا POR2 لقياس التصاق البكتيريا، منذ موت الخلايا والخلايا المفرزة يهدد الإجراء لقياس البكتيريا المرفقة. في البداية، تعوضأقيمت التجارب tition لتكون بمثابة خطوة حكيمة بروتوكول، حيث كانت الخلايا المضيفة الأولى المحتضنة مسبقا مع حبات قبل إضافة البكتيريا. لV. نظيرة الحالة للدم والمواصفات حبة المستخدمة (2 ميكرومتر الخرز بالإضافة إلى MAM7)، وكلاهما الخرز والبكتيريا ويمكن أن يضاف في نفس الوقت دون تغييرات في السمية الخلوية الناتجة عن ذلك. بمعنى آخر، في هذا الإعداد التجريبية، والخرز تكومبيتي البكتيريا عن الخلية المضيفة ملزمة. اعتمادا على هندسة الأنواع البكتيرية وحبة المستخدمة، قد تكون هناك أسباب وجيهة للحفاظ على التصاق حبة والعدوى البكتيرية كما خطوتين منفصلتين. على سبيل المثال، لتصيب الخلايا مع البكتيريا غير متحركة، لوحات وطرد عادة بعد إضافة وسائل الإعلام العدوى. ومع ذلك، ينبغي تجنب الطرد المركزي لوحات تحتوي على تعليق حبة، لأن هذا يؤدي إلى التوزيع غير المتكافئ للغاية من الخرز على طبقة الخلايا. إذا كان يتم استخدام أحجام الجسيمات الصغيرة، والخرز يستغرق وقتا أطول لتسوية على سطح الخلية، وفي هذه الحالة سووينبغي أن يسمح الوقت fficient لمرفق حبة مسبق للعدوى. عند استخدام التصاق البكتيريا باعتباره تلا، يجب أخذ العينات في نقاط زمنية حيث لا تلف الخلايا المضيفة بشكل كبير من سلالة تصيب، وانفصال الخلايا وتحلل ويمكن أن تمس الكمي من البكتيريا المرفقة. بدلا من تعداد التصاق البكتيريا بواسطة الطلاء التخفيف، قد بدلا من معالجتها عينات للتصوير (الشكل 5). في هذه الحالة، يجب أن المصنف الخلايا زراعة الأنسجة على زلات غطاء زجاجي، وليس مباشرة في الآبار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الخرز والبكتيريا الفلورسنت معربا عن بروتين فلوري، جنبا إلى جنب مع علامات الخلية المضيفة عدوى محددة. على سبيل المثال، يتم تصوير التجارب المنافسة عادة باستخدام أحمر فلوري رودامين-phalloidin وصمة عار على الخلايا المضيفة الأكتين الهيكل الخلوي وتقييم التغيرات المورفولوجية الناتجة عن العدوى، جنبا إلى جنب مع الخرز الأزرق الفلورسنت والفلورسنتالأخضر (GFP التعبير عن أو SYTO18 الملون) البكتيريا. وهناك مجموعة من adhesins يقترن حبة، بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية FnBPA، العقدية المقيحة F1 FUD والضمة نظيرة الحالة للدم MAM، وقد استخدمت كمواد المحاكاة البيولوجية لدراسة التصاق، التصاق تثبيط ومساهمة الانضمام إلى بوساطة الممرض سمية الخلايا 1 و 7 و 8. واحدة من مزايا استخدام هذا النهج هو سهولة التصور الأحداث المرفق، منذ الخرز البوليمر استخدام السقالات متوفرة في مجموعة واسعة من الألوان (على سبيل المثال، أزرق، أحمر فلوري والأزرق والأخضر والبرتقالي). وهكذا، ووضع العلامات البروتين المباشر، والتي قد تتداخل مع وظيفة، يمكن تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، سطح يقلد اقتران العرض متعددي من adhesins على سطح البكتيرية، مما يعكس التشكل أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية بالمقارنة مع بروتينات قابلة للذوبان. بالمقارنة مع الدراسات التي تستخدم البكتيريا سليمة أو البكترياالمسوخ القاعدة ونهج حبة تلتف المشاكل المرتبطة نمو البكتيريا. على سبيل المثال، وعلى المدى الطويل (على سبيل المثال، O / N) غالبا ما يثير الشبهة دراسات التصاق البكتيريا إلى الخلايا باستخدام البكتيريا سليمة استضافة الظواهر المصاحبة نمو البكتيريا - تحمض استنزاف متوسطة النمو والمغذيات تؤثر سلبا على الخلايا المضيفة، وتكرار البكتيرية يضر في نهاية المطاف جودة التصوير. وفي الآونة الأخيرة، وقد تم تمديد استخدام adhesins يقترن حبة لتشمل استخدامهم كأدوات للالتنقيات تقارب من المضيف الخلوية العوامل التي تدخل في عمليات المصب من التصاق البكتيريا الإشارة. V. نظيرة الحالة للدم MAM7، عن طريق ملزمة لالأحماض الفسفاتيديك في غشاء الخلية المضيفة، وموجبات تفعيل RhoA والأكتين إعادة ترتيب 1 و 3. ويجري استخدام الخرز يقترن MAM لتنقية وتحديد البروتينات المشاركة في منصات الإشارات تجميعها نتيجة لخلية MAM-المضيفة ربط. منذ الخرز يمكنبسهولة يمكن فصلها من طاف بواسطة خطوة الطرد المركزي قصيرة، ويقترن البروتين من الفائدة تساهميا، وهذا هو وسيلة جيدة لتحقيق الانفصال عن البروتينات الملوثة وإثراء مجمعات البروتين ذات الصلة، والتي يمكن استخدامها لتطبيقات المصب مثل البروتينات أو ويسترن النشاف.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

وV. نظيرة الحالة للدم adhesin MAM7 يحتوي على سبعة جنبا إلى جنب إدخال خلية الثدييات (MCE) المجالات المعنية تقديرا لمستقبلات سطح المضيف. كنا الخرز البوليسترين بالإضافة إلى المؤتلف، شظايا النقاء تشمل إما كافة المجالات سبعة جنبا إلى جنب MCE (MAM7) أو فقط المجال MCE الأول (MAM1) لاختبار قدرة هذه المواد على المنافسة مع V. نظيرة الحالة للدم للخلية المضيفة ملزمة وفعالية الناتجة من هذه المواد ومثبطات التصاق. أصيب خلايا هيلا مع V. تم تقييم نظيرة الحالة للدم سلالة POR1، والسمية الخلوية الناتجة عن العدوى في المختبر بعد 4 ساعات (الشكل 3). أسفرت علاج خلايا هيلا مع 0.1٪ تريتون X-100 (مراقبة تحلل الإيجابية) في كامل تحلل الخلايا، والخلايا غير المصابة عرض مستويات منخفضة جدا للخلايا. أدى في المختبر إصابة الخلايا غير المعالجة مع POR1 في مستويات عالية جدا من تحلل الخلية، وهذا كان مستعمل من قبل MAM7 المشتركupled الخرز ولكن ليس MAM1 جانب أو الخرز ضبط بالإضافة GST (الشكل 3). <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> الشكل 3. توصيف الضمة نظيرة الحالة للدم يسببها السمية الخلوية في الخلايا الظهارية خلال فحوصات المنافسة. وعولج الخلايا مع V. نظيرة الحالة للدم (نائب الرئيس)، المشار إليها بالرمز (+)، أو أي بكتيريا (-) في وجود مختلف الكيانات المتنافسة (. شركات) كما هو مبين. وشملت هذه إما لم شركات. (-)، الخرز MAM7 (MAM7)، الخرز MAM1 (MAM1) أو حبات السيطرة GST (GST). والضوابط، تم علاج الخلايا إما مع تريتون X-100 (تريتون، ومراقبة تحلل)، أو ترك غير مصاب (uninf). وقد تم قياس الإفراج LDH بعد 4 ساعات كما هو موضح في الباب 3، والنتائج تطبيع لضوابط تريتون (100٪) والفراغات (0٪) كما هو موضح أعلاه. النتائج هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة من التجارب ثلاث نسخ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> تعداد V. كشفت نظيرة الحالة للدم تعلق إما خلايا هيلا غير المعالجة، أو الخلايا المحتضنة مع MAM7-، MAM1-، أو حبات السيطرة GST، أن MAM7 الخرز ولكن ليس MAM1- او الخرز السيطرة GST- تكومبيتي V. نظيرة الحالة للدم لمرفق لاستضافة مستقبلات سطح الخلية (الشكل 4). <img alt="الرقم 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> الرقم 4. توصيف التصاق البكتيريا خلال التجارب المنافسة. أصيب خلايا هيلا مع V. نظيرة الحالة للدم POR2 (نائب الرئيس +)، في غياب (-) أو وجود الكيانات المتنافسة على النحو التالي: الخرز MAM7 (MAM7)، الخرز MAM1 (MAM1) أو حبات السيطرة GST (GST) (شركات). وقد تم قياس التصاق البكتيريا بعد 1 ساعة، كما<html> هو موضح في القسم 3. النتائج هي وسائل ± ووزارة شؤون المرأة من التجارب ثلاث نسخ. يعني (FLTR في كفو / مل) هي 2.3010 6، 5 1.5310، 2.0510 6، 6 2.1210. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> Adhesins بالإضافة إلى fluorophore المسمى حبات يؤدي إلى توليد المواد التي تحاكي التصاق البكتيريا إلى الخلايا المضيفة وهي أدوات قوية للتصوير الخلوي (الشكل 5). باستخدام MAM7 جانب الخرز الأزرق الفلورسنت، ونحن اتسمت بها عملية الحجز MAM7 بوساطة الخلايا الظهارية. أدى الحجز على MAM7 الخلايا المضيفة في الأكتين إعادة ترتيب وتشكيل ألياف الإجهاد، والتي كانت المشترك تصور باستخدام رودامين-phalloidin إلى وصمة عار لF-الأكتين (الشكل 5B). _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; الرقم 5. إعداد واستخدام fluorophore المسمى الخرز الجزيئية الحيوية لأغراض التصوير. (A) إيقاف الفلورسنت الخرز بيوميمتيك الزرقاء (أنبوب المناسب، 10X الأسهم) والعازلة التحكم (أنبوب الأيسر). (ب) مرفق من الخرز MAM7 بالإضافة إلى هيلا النتائج الخلايا في إعادة ترتيب الأكتين وتكوين ألياف الإجهاد. تم تصوير الألياف مرفق من الخرز الأزرق الفلورسنت وأدى التوتر الأكتين (الحمراء، ملطخة رودامين-phalloidin) بواسطة المجهر. بار، 10 ميكرون. تم تكييف الصور في لوحة B من ليم وآخرون. (1) وتتكرر تحت رخصة المشاع الإبداعي العزو. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions at JoVE.com

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

المواد الجزيئية الحيوية لوصف التفاعلات البكتيريا في استضافة

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

biomimetic-materials-to-characterize-bacteria-host-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.1K Views.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

Video: Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

استخدام مضاد للفيروسات، γ الإنزيم المرتبط الفحص Immunospot لوصف الرواية تي خلية الحواتم من فيروس الورم الحليمي البشري

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

التصوير InlC إفراز المعنية بالتحقيق في العدوى البكتيرية الخلوية من قبل الممرض<em&gt; المستوحدة الليستيريا</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

استخدام<em&gt; الشيجلا الفلكسنرية</em&gt; لدراسة التفاعلات الالتهام الذاتي الهيكل الخلوي

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

باستخدام نماذج الزرد من الإنسان الأنفلونزا فيروس العدوى الى الشاشة المضادة للفيروسات المخدرات وتوصيف المضيف المناعي الردود خلية

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

بروتوكول لتوصيف التغيرات المورفولوجية<em&gt; كلوستريديوم ديفيسيل</em&gt; في الاستجابة للعلاج بالمضادات الحيوية

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.