Il finanziamento è stato fornito dal NIH 5T32CA09216-26 (per ACC), e K01 AR055619-01A1 e 3 K01 AR055619-03S1 (per DML), così come dai Alex Lemonade Stand della Fondazione, l&#39;Harvard Stem Cell Institute e l&#39;American Cancer società.

1. Microiniezione di DNA di embrioni di zebrafish <ol><li> Linearizzare RAG2:: cMyc e RAG2:: 11 GFP costruisce DNA da digerire 10μg di ogni plasmide con Noti a 37 ° C durante la notte. </li><li> Fenolo: cloroformio e precipitare i plasmidi, e risospendere in ogni 20μL H 2 O. </li><li> Determinare la concentrazione del DNA eseguendo una diluizione 1:1, 1:5 e 1:10 di ogni plasmide digerito su un 1% gel con 20μL, 10μL e 5μL di alta gamma scala del DNA. Questo tipo di quantificazione è generalmente più preciso di una lettura spettrometro. </li><li> Diluire il DNA di una concentrazione finale di 60ng/μL a 1M di KCl 0,5 X TE per iniezione in CG1-deformazione (o altro ceppo singenici) embrioni di zebrafish con 30ng/μL RAG2:: cMyc + 30ng/μL RAG2:: GFP. </li><li> Le iniezioni devono essere eseguite precedentemente dimostrato come 12, 13. In breve, pesce zebra maschio e femmina sono istituiti in camere di accoppiamento la sera prima iniezione. Il giorno di iniezione, il DNA è caricato nella ago per l&#39;iniezione, la pressione è regolato in modo che una bolla con un diametro di 50 micron viene espulso (30pg DNA), che viene misurata da un micrometrico. Poi, gli embrioni vengono iniettati al unicellulare palco, con il DNA viene iniettato direttamente nella cellula, e non nel tuorlo. Survival of the iniettato CG1 embrioni e larve è generalmente scarsa, e solo il 5% dei pesci con successo incorporare il transgene, quindi,&gt; 600 embrioni deve essere iniettato per garantire che alcuni pesci si sviluppano leucemia. </li><li> Conservare gli embrioni iniettati a 28,5 ° C, e rimuovere gli embrioni morti dopo 24 ore. Gli animali sono poi trasferiti in vasche di grandi dimensioni a 5 giorni di vita e cresciuto come descritto in precedenza 14. </li></ol> 2. Lo screening per la T-ALL primario in larve zebrafish <ol><li> Circa 28 giorni dopo l&#39;iniezione, anestetizzare zebrafish larvale aggiungendo 200μL di 4ng / m Tricane-S a 25 ml di acqua pesce sistema in una capsula di Petri. </li><li> Esaminare le larve per lo sviluppo di fluorescenza marcata con T-ALL utilizzando un microscopio a epifluorescenza a 20X di ingrandimento, con una lunghezza d&#39;onda di eccitazione ed emissione 485/20 530/25 filtro per rilevare la fluorescenza GFP (Figura 1). </li><li> Separare le larve di tumore positivi da quelli negativi. Larve negativi possono essere esaminate in un punto secondo momento, una volta che i tumori possono essere cresciuti più grandi, per garantire che nessun T-ALL pesce positivi sono stati mancati. </li><li> Monitor T-ALL pesce positivo almeno una volta alla settimana utilizzando il microscopio a epifluorescenza per monitorare la crescita tumorale. </li></ol> 3. Isolamento e la purificazione di fluorescenza marcata con cellule leucemiche primarie <ol><li> Quando GFP-positive cellule leucemiche hanno superato&gt; 50% degli animali, il sacrificio il pesce con l&#39;aggiunta di 1 ml di 4ng/mL Tricane-S in una capsula di Petri contenente 9 ml di acqua sistema di pesce. </li><li> Mettere il pesce in un nuovo piatto di Petri contenente 1 ml 0.9x PBS con 5% di siero fetale bovino al buffer le cellule. Macerare il pesce con una lama di rasoio, pipetta la miscela di dissociarsi grumi grandi cellule, le cellule passano poi attraverso un filtro di 40μm in un tubo 50ml. Non è necessario dissociare tutti i grumi di tessuto in cellule singole. </li><li> 500μL Pipettare delle cellule in una provetta di polistirolo da 4 ml. Aggiungere 1ml 1mg/mL ioduro di propidio (PI), che etichetta le cellule morte. Vortex, poi mantenere le cellule in ghiaccio. </li><li> Sacrifica una wild-type CG1 pesce, macerare e la tensione nello stesso modo come sopra per raccogliere le cellule normali, che servono come supporto per le cellule tumorali durante transplant.Add 4 ml 5% FBS a 0.9x PBS al tubo 50mL per un totale volume di 5 ml. </li><li> Contare le cellule normali, portare a 3x10 5 cellule / ml in FBS 5% in PBS 0.9x, poi 100μL/well pipetta di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Utilizzando un Sorter fluorescenza cellulare attivato (FACS), sorta GFP positive, le cellule tumorali PI negativo (Figura 2A, B) nella piastra a 96 pozzetti contenenti le cellule del sangue a dosi seguenti: 10 cellule / pozzetto in 48 pozzi, 100 cellule / pozzetto in 24 pozzi, 1000 cellule / pozzetto in 12 pozzi, e 10.000 cellule / pozzetto in 6 pozzi. Inoltre, 10.000 cellule devono essere ordinati in un pozzo senza cellule del sangue normali, e rianalizzati usando FACS per valutare la purezza e la vitalità delle cellule ordinate (Figura 2C). </li></ol> 4. Limitare il trapianto di diluizione in zebrafish adulti <ol><li> Agglomerare le cellule centrifugando la piastra a 96 pozzetti a 2000xg per 10 minuti. </li><li> Rimuovere 95μL del supernatante e risospendere le cellule del 5μL rimanenti. </li><li> Tenere un adulto (&gt; 60 giorni di età) singenici zebrafish lato ventrale, e iniettare la sospensione cellulare nella cavità peritoneale, utilizzando un 26G / 2 &quot;micro-siringa. Zebrafish non c&#39;è bisogno di essere anestetizzato prima del trapianto. Tipicamente, 45 pesci sono trapiantati con cellule leucemiche 10, 20 sono trapiantati con 100 celle, 7 sono le cellule trapiantate con 1.000 e 5 pesci sono trapiantati con 10.000 cellule T-ALL. </li></ol> 5. Analisi per determinare la leucemia, l&#39;avvio di frequenza delle cellule <ol><li> Circa 28 giorni dopo il trapianto, esaminare il pesce trapiantati con un microscopio epifluoresence usando una lunghezza d&#39;onda di eccitazione ed emissione 485/20 530/25 filtro per rilevare la fluorescenza GFP. Registrare il numero di pesci positivo per numero totale di pesci iniettato. </li><li> Riesaminare il pesce ogni 14 giorni per un massimo di 90 giorni e registrare il numero di pesci positivo. Quando un tumore positivo pesci diventano moribondo, il sacrificio degli animali da Tricane-S overdose. </li><li> Ingresso i risultati in una tabella, come mostrato nella Figura 3D. Carica i dati nel web-based ELDA (Extreme Analisi diluizione limitazione) software statistici a <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, che utilizza la frequenza di tumori animali positivi e negativi a ogni dose di trapianto per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule leucemiche all&#39;interno del primario di T-ALL. </li></ol> 6. Rappresentante dei risultati: Microiniezione di DNA in embrioni di pesce singenici si traduce spesso in un basso tasso di sopravvivenza degli embrioni iniettati, con &lt;60% degli embrioni sopravvivere per 24 ore. Inoltre, la sopravvivenza dei pesci iniettato singenici è generalmente scarsa durante lo sviluppo larvale, con spesso &lt;20% sopravvive per 28 giorni. E &#39;quindi importante iniettare un gran numero di embrioni al fine di creare i pesci transgenici che si svilupperà T-ALL. A titolo di esempio, CG1 embrioni ceppo sono stati iniettati con RAG2:: cMyc + RAG2:: GFP. I transgeni co-segregano negli embrioni, in modo che ogni cellula che esprime GFP anche esprimere cMyc. Le larve sono stati sottoposti a screening per primario T-ALL dopo 28 giorni (Figura 1). Il lavoro precedente ha mostrato che circa il 5% dei pesci iniettato avrà GFP-positive le cellule T nel loro timo (Figura 1), e il 100% di questi pesci si sviluppano leucemia, come i linfociti T si trasformano 11. Mentre una piccola percentuale di zebrafish può avere una leucemia più avanzato che è molto facile da individuare al giorno 28, la maggior parte solo un GFP-positive timo (Figura 1), per cui le larve devono essere esaminati individualmente sotto forte ingrandimento per garantire che tutti positivi i pesci vengono selezionati. GFP-positive T-ALL cellule supererà&gt; 50% degli animali tra i giorni 45-70. Nell&#39;esempio fornito, zebrafish sono stati sacrificati a 65 giorni di vita, e le cellule leucemiche sono stati isolati e FACS ordinati per limitare il trapianto di diluizione. Singole cellule che sono state ioduro di propidio negative e GFP-positive (Figura 2) sono stati ordinati in una piastra da 96 pozzetti. Ri-analisi è stato fatto su 10.000 cellule ordinati al fine di valutare la vitalità (idealmente&gt; 95%) e purezza (idealmente&gt; 92%, Figura 2). Trapiantate T-ALLS generalmente nascono prima dei 28 giorni, ma alcuni tumori possono prendere più di 60 giorni di tempo per svilupparsi. In questo esempio, al giorno 28, i tumori prima fase sono stati visti come una zona di cellule GFP-positive nei pressi del sito di iniezione (figura 3B), mentre alcune T-ALLS erano più progredito, avendo ampliato per riempire la cavità peritoneale (Figura 3C) . I dati di limitare la diluizione saggi di trapianto di cellule provenienti da tre diversi primari T-ALLS sono illustrate nella figura 3D. Per questi esperimenti, oltre 220 animali sono stati trapiantati, che può essere facilmente realizzata da una sola persona all&#39;interno di diverse ore. L&#39;analisi dei dati utilizzando il software ELDA ha dimostrato che, in media, 1 in 135 T-ALL cellule sono state auto-rigenerante leucemia di moltiplicazione delle cellule (Figura 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 larve Zebrafish iniettato a una cellula palco con straccio:.:-CMyc + straccio::-eGFP sono stati sottoposti a screening per la crescita leucemia primario 28 giorni dopo l&#39;iniezione. Di pesce (*) aveva GFP-positive le cellule T nel timo; questo pesce si svilupperà T-ALL, come i linfociti T si trasformano nel tempo. Questa fase è molto comune al giorno 28. Un pesce (**) aveva un avanzato T-ALL, che si è diffuso nel tessuto molle. I restanti due pesci sono negativi per la crescita del tumore. L&#39;immagine è stata scattata con ingrandimento di 16x. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Fluorescenza marcata T-ALL cellule sono state ordinate da animali malati e utilizzati nel trapianto di cellule limitare test di diluizione. In primo luogo, un cancello è stato elaborato per selezionare celle singole (pannello superiore a sinistra), poi le cellule ioduro di propidio negative vengono selezionate (al centro del pannello a sinistra). Infine, un cancello è stato elaborato per selezionare solo la GFP-positive cellule leucemiche per l&#39;ordinamento (pannello inferiore a sinistra). Cellule ordinati dovrebbero essere rianalizzati per valutare la vitalità e purezza prima del trapianto (pannelli a destra). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Zebrafish sono stati esaminati per la crescita leucemia 28 giorni dopo il trapianto. I pesci sono o tumorali negative (A), hanno un piccolo tumore che cresce al sito di iniezione (B), o hanno una leucemia progredito (C). Le immagini sono state scattate con ingrandimento 7X. Il numero totale di leucemia-positivi pesce per numero totale di pesci trapiantato ad ogni diluizione viene registrata, come in (D). I dati sono immessi nel web-based ELDA programma per calcolare il numero di auto-rinnovamento delle cellule leucemiche e il superiore e inferiore intervallo di confidenza al 95% (E).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un punto di forza di usare zebrafish nella ricerca sul cancro è che un gran numero di animali può essere utilizzato a costi relativamente bassi. Questo è particolarmente importante nel limitare la diluizione test trapianto di cellule, in cui vengono utilizzate le proporzioni degli animali trapiantati che sviluppano i tumori al numero totale trapiantato a determinare tumore iniziare la frequenza delle cellule. Nel metodo qui presentato, oltre 70 animali ricevente di trapianto vengono usati per test, fornendo una stima accurata del numero di tumori di moltiplicazione delle cellule. Sia il numero di animali usati e le dosi delle cellule tumorali trapiantate dovrebbero essere ottimizzati per un modello determinato tipo di tumore, ad esempio, se gli esperimenti iniziali mostrano tumore inizio cellule sono rare, le dosi di trapianto utili possono essere 100.000, 50.000, 10.000 e 1.000 cellule per trapianto. Singenici ceppi zebrafish sono utili a limitare l&#39;analisi di diluizione. Tuttavia, questi sforzi non sono ancora comunemente utilizzati in tutti i laboratori, e alcuni modelli cancro zebrafish esistono solo nei pesci allogenico. Limitare i trapianti delle cellule di diluizione possono essere eseguite in ceppi wild-type che hanno subito l&#39;ablazione immunitario, anche se l&#39;auto-rinnovamento delle cellule di frequenza può essere calcolata come 1-10 volte superiore se singenici zebrafish sono stati utilizzati 8. E &#39;importante notare che una maggiore dose di cellule devono essere utilizzati per i trapianti in non immuni abbinati, i destinatari irradiati, come alcune cellule tumorali non sopravvivono trapianto in un microambiente straniero. Inoltre, molti tumori comincia a regredire dopo 21 giorni quando il sistema immunitario dell&#39;animale ricevente recupera, per cui gli animali dovrebbero essere valutati per la crescita del tumore ogni 7 giorni dopo il trapianto. I metodi qui presentati sono adatti per l&#39;uso con qualsiasi modello di cancro zebrafish, e sono finora stati utilizzati per determinare tumore delle cellule di avviare la frequenza in entrambe le cellule T leucemia linfoblastica acuta 8, e un modello di tumore solido, rabdomiosarcoma 16. Questi tumori sono state marcate da co-iniezione di embrioni sia con un oncogene e marcatore fluorescente, perché il DNA co-segrega, ogni cellula che esprime l&#39;oncogene anche esprimere la proteina fluorescente 17. Mentre la fluorescenza è raccomandato perché facilita il monitoraggio della crescita tumorale, senza la necessità di sacrificare l&#39;animale e fornisce uno straight-forward modo per isolare le cellule tumorali da FACS, è possibile etichettare le cellule tumorali con anticorpi specifici per i responsabili del tumore per facilitare la loro purificazione , anche se colorazione anticorpi in zebrafish può richiedere di ottimizzazione. Infine, una volta che l&#39;incidenza di tumore di moltiplicazione delle cellule è stata determinata per un dato tipo di tumore, è possibile utilizzare questi test di identificare i meccanismi che regolano la loro frequenza delle cellule. Per esempio, primario cellule tumorali possono essere trattati con inibitori percorso specifico prima di limitare la diluizione trapianto, trapiantati o di pesce si può essere dosato con i farmaci. Inoltre, la genetica degli stessi tumori possono essere manipolati, iniettando il one-cell pesce palco con un gene di interesse, in modo che il tumore primario risulta sovra-esprimere il gene. In questi esperimenti, alcun effetto sulla frequenza di auto-rinnovamento delle cellule saranno osservati nel test di diluizione limitante.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Noti enzima di restrizione </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Fenolo: cloroformio </td><td> EMD Biochemicals </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> KCl 5M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Alta Gamma scaletta del DNA </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Singenici zebrafish </td><td></td><td> Riferimenti 6-8 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidio ioduro </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microsiringa </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> 40μm mesh cellulare </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

Auto-rinnovano le cellule tumorali sono i tipi di cellule solo all&#39;interno di un tumore che hanno una capacità illimitata di promuovere la crescita del tumore, e sono quindi conosciuti come moltiplicazione delle cellule tumorali o le cellule tumorali di origine. Si pensa che gli obiettivi di tali auto-rigenerante per la distruzione delle cellule blocca la progressione del tumore e smettere di recidiva, migliorando notevolmente la prognosi dei pazienti 1. Il modo più comune per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule all&#39;interno di un tumore è la limitazione delle cellule test di diluizione trapianto, in cui vengono trapiantate le cellule tumorali in animali destinatari a dosi crescenti; la percentuale di animali che sviluppano tumori viene utilizzato il calcolare il numero di auto-rinnovamento delle cellule all&#39;interno del campione di tumore originale 2, 3. Idealmente, un gran numero di animali potrebbe essere usato in ogni esperimento diluizione limita a determinare con precisione la frequenza del tumore di moltiplicazione delle cellule. Tuttavia, esperimenti su vasta scala che coinvolgono i topi sono costosi, e più saggi di diluizione che limitano l&#39;uso solo il 10-15 topi per esperimento. Hanno assunto un rilievo Zebrafish come modello di cancro, in gran parte a causa della loro facilità di manipolazione genetica e l&#39;economia con cui gli esperimenti su larga scala può essere eseguita. Inoltre, i tipi di cancro modellati in zebrafish sono stati trovati per imitare da vicino i loro 4 malattie umane controparte. Mentre è possibile trapiantare cellule tumorali da un pesce a un altro sub-letali radiazioni di animali destinatario, la rigenerazione del sistema immunitario dopo 21 giorni è spesso causa di regressione del tumore 5. La recente creazione di zebrafish singenici ha enormemente facilitato gli studi trapianto di tumore 6-8. Perché questi animali sono geneticamente identici, trapiantato innestare cellule tumorali robustamente in pesci destinatario, e la crescita tumorale può essere monitorato per lunghi periodi di tempo. Singenici zebrafish sono ideali per limitare i test di diluizione in trapianti che le cellule tumorali non devono adattarsi alla crescita in un microambiente straniero, che può sottovalutare e auto-rigenerante frequenza delle cellule 9, 10. Inoltre, un trapianto di cellule sono state completate con successo utilizzando singenici zebrafish 8 e diverse centinaia di animali possono essere facilmente e economicamente trapiantato in una sola volta, entrambi i quali servono a fornire una stima più precisa di auto-rinnovamento delle cellule di frequenza. Qui viene presentato un metodo per la creazione di primario, fluorescenza marcata con cellule T leucemia acuta linfoblastica (T-ALL) in zebrafish singenici e trapianto questi tumori a limitare la diluizione in pesci adulti per determinare la frequenza di auto-rinnovamento delle cellule. Mentre la leucemia è fornito come esempio, questo protocollo è adatto per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule utilizzando qualsiasi modello di cancro nel zebrafish.

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Limitare i test di diluizione trapianto di cellule vengono utilizzati per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di zebrafish singenici che sviluppano leucemia fluorescenza-etichettati e dettagli su come isolare e trapianto di queste cellule di leucemia a limitare la diluizione nella cavità peritoneale di zebrafish adulti.

Quantificare la frequenza di tumori di moltiplicazione celle usando Limitare trapianto di cellule Diluizione in Singenico Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K Views.  Harvard Medical School. Limitare i test di diluizione trapianto di cellule vengono utilizzati per determinare la frequenza di tumore di moltiplicazione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo per la generazione di zebrafish singenici che sviluppano leucemia fluorescenza-etichettati e dettagli su come isolare e trapianto di queste cellule di leucemia a limitare la diluizione nella cavità peritoneale di zebrafish adulti.

Video: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

Il trapianto di midollo renale intero in Zebrafish adulti

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Ricerca

Biologia

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Tracheotomia: Un metodo per il trapianto di cellule staminali al polmone

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Lens trapianto in Zebrafish e la sua applicazione nell&#39;analisi dei Mutanti Eye

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Il trapianto di cellule direttamente nel rene di Zebrafish adulti

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

In elettroporazione in vivo dei Morpholinos nella retina Zebrafish per adulti

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

Studiare proteolisi della ciclina B a livello di singola cellula in popolazioni di cellule intere

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizzando craniofacciale morfogenesi in Zebrafish Uso 4D Microscopia confocale

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgenici Roditore Assay per quantificare Maschio cellule germinali Mutant Frequenza

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...