La financiación ha sido proporcionada por las subvenciones del NIH 5T32CA09216-26 (la ACC), y K01 AR055619-01A1 y 3 K01 AR055619-03S1 (por DML), así como por el stand de la Fundación de limonada de Alex, el Harvard Stem Cell Institute y la American Cancer la sociedad.

1. Microinyección de ADN embriones de pez cebra <ol><li> Linealizar RAG2:: cMYC y RAG2:: GFP 11 construcciones de ADN mediante la digestión de 10μg de cada plásmido con NotI a 37 ° C durante la noche. </li><li> Fenol: extracto de cloroformo y precipitado los plásmidos, y resuspender en 20μL de cada H 2 O. </li><li> Determinar la concentración del ADN mediante la ejecución de una dilución 1:01, 1:05 y 1:10 de cada plásmido digerido en un 1% en gel de agarosa con 20μL, 10μL y 5μL de una escalera de ADN de alto rango. Este tipo de cuantificación es generalmente más exacto que una lectura del espectrómetro. </li><li> Diluir el ADN a una concentración final de KCl 1M en 60ng/μL TE 0,5 X para la inyección en CG1-deformación (o tensión singénico otros) embriones de pez cebra con 30ng/μL RAG2:: cMYC + 30ng/μL RAG2:: GFP. </li><li> Las inyecciones se deben realizar como se ha demostrado 12, 13. En pocas palabras, el pez cebra macho y hembra se establecen en las cámaras de apareamiento de la noche antes de la inyección. En el día de la inyección, el ADN está cargado en la aguja de inyección, la presión se ajusta de modo que una burbuja con un diámetro de 50 micras es expulsado (30pg ADN), que se mide con un micrómetro. Luego, los embriones se inyectan en el estadio de una célula, con el ADN que se inyecta directamente en la célula, y no en la yema. La supervivencia de la inyección CG1 embriones y larvas es generalmente pobre, y sólo el 5% de los peces con éxito incorporar el transgén, por lo que&gt; 600 embriones se debe inyectar para asegurarse de que algunos peces se desarrollan leucemia. </li><li> Almacenar los embriones inyectados a 28,5 ° C, y la toma de embriones muertos después de las 24 horas. Los animales se transfieren a los tanques grandes con 5 días de la vida y criado como se ha descrito anteriormente 14. </li></ol> 2. La detección de T-ALL primaria en larvas de pez cebra <ol><li> Aproximadamente 28 días después de la inyección, anestesia larvas de pez cebra mediante la adición de 200μL de 4NG / m Tricane-S a 25 ml de peces de agua del sistema en una placa de Petri. </li><li> Examinar las larvas para el desarrollo de fluorescencia con etiqueta T-ALL por el uso de un microscopio de epifluorescencia a 20X, con una longitud de onda de excitación y de emisión de 485/20 530/25 filtro para detectar la fluorescencia de GFP (Figura 1). </li><li> Separados larvas tumor positivo de aquellos que son negativos. Larvas negativas pueden ser examinadas en un momento posterior, una vez que los tumores pueden haber crecido más, para asegurarse de que no T-ALL FISH positivo se perdieron. </li><li> Monitor de T-ALL FISH positivo al menos una vez a la semana usando el microscopio de epifluorescencia para seguir el crecimiento del tumor. </li></ol> 3. Aislamiento y purificación de células marcadas con fluorescencia leucemia primaria <ol><li> Cuando GFP-positivas células leucémicas se han superado a&gt; 50% de los animales, el sacrificio de los peces mediante la adición de 1 ml de 4ng/mL Tricane-S en una placa de Petri que contiene 9 ml de agua del sistema de pescado. </li><li> Coloque el pescado en una nueva placa de Petri que contiene 1 ml de 0.9x PBS con suero bovino fetal al 5% de amortiguamiento de las células. Macerar el pescado con una hoja de afeitar, pipeta de la mezcla de disociar grupos de células grandes, a continuación, pasar a las células a través de un colador de malla 40μm en un tubo de 50 ml. No es necesario disociar todos los grupos de tejidos en células individuales. </li><li> 500μL pipeta de las células a un tubo de poliestireno de 4 ml. Añadir 1μL 1mg/ml yoduro de propidio (PI), que marca las células muertas. Vortex, a continuación, mantener las células en hielo. </li><li> Sacrificar una de tipo salvaje CG1 pescado, macerado y la tensión de la misma manera que antes de recoger las células normales, que sirven como soporte para las células del tumor durante transplant.Add 4 ml 5% de SFB en PBS a 0,9 veces el tubo de 50 ml, para un total volumen de 5 ml. </li><li> Contar con las células normales, se diluye hasta 3x10 5 células / ml en FBS al 5% en PBS 0,9 x, entonces 100μL/well pipeta de una placa de 96 pocillos. </li><li> El uso de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), más o menos las buenas prácticas agrarias de células positivas, PI tumor negativo (Figura 2A, B) en la placa de 96 pozos que contienen células de la sangre en las siguientes dosis: 10 células / pocillo en 48 pozos, 100 células / en 24 pozos, 1000 células / pocillo en 12 pozos, y las células 10.000 / 6 y en los pozos. Además, 10.000 células deben ser ordenados en un pozo sin células sanguíneas normales, y volver a analizar el uso FACS para evaluar la pureza y la viabilidad de las células ordenada (Figura 2C). </li></ol> 4. Limitar la dilución en el trasplante de adultos de pez cebra <ol><li> Precipitar las células por centrifugación de la placa de 96 pozos en 2000xg durante 10 minutos. </li><li> Quitar 95μL del sobrenadante y se resuspenden las células en el 5μL restantes. </li><li> Mantenga un adulto (&gt; 60 días) singénico parte ventral del pez cebra, y se inyecta la suspensión de células en la cavidad peritoneal, utilizando un 26G / 2 &quot;micro-jeringa. Pez cebra no tiene que ser anestesiados antes del trasplante. Generalmente, el 45 de pescado se trasplantan con 10 células de leucemia, 20 son trasplantados con 100 celdas, 7 son trasplantados con células de 1000 y los peces 5 se trasplantan con 10.000 T-todas las células. </li></ol> 5. Análisis para determinar la leucemia de células iniciadoras de la frecuencia <ol><li> Aproximadamente 28 días después del trasplante, examinar el pescado trasplantados con un microscopio con una longitud de onda epifluoresence excitación 485/20 y 530/25 de emisión de filtro para detectar la fluorescencia de GFP. Anote el número de peces positivos por el número total de peces inyectados. </li><li> Volver a examinar el pescado cada 14 días hasta 90 días y registrar el número de peces positivos. Cuando un pez de tumores positivos se convierten en moribundo, el sacrificio del animal por Tricane-S sobredosis. </li><li> De entrada los resultados en una tabla, como se muestra en la figura 3D. Cargar los datos en el ELDA basado en la web (Extreme Análisis de dilución limitante) de software estadístico en <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 15, que utiliza la frecuencia de tumores animales positivos y negativos en cada dosis de trasplante para determinar la frecuencia de auto-renovación de las células de leucemia en el principal T-ALL. </li></ol> 6. Los resultados representativos: Microinyección de ADN en embriones de pez singénico a menudo resulta en una baja tasa de supervivencia de los embriones inyectados, con &lt;60% de los embriones sobreviven durante 24 horas. Además, la supervivencia de los peces singénico inyectada es generalmente pobre durante el desarrollo larvario, con frecuencia &lt;20% de sobrevivir durante 28 días. Por eso es importante para inyectar un gran número de embriones con el fin de crear los peces transgénicos que se desarrollará la LLA-T. A modo de ejemplo, CG1 embriones fueron inyectados con cepa RAG2:: cMYC + RAG2:: GFP. Los transgenes co-segregan en el embrión en desarrollo, de manera que cada célula que expresa GFP también se expresa cMYC. Las larvas fueron seleccionados para la primaria de la LLA-T después de 28 días (Figura 1). Trabajos anteriores han demostrado que aproximadamente el 5% de los peces inyectados se han GFP-positivas las células T en su timo (Figura 1), y el 100% de estos peces se desarrollan leucemia, las células T se transforman 11. Mientras que una pequeña parte de pez cebra puede tener una leucemia más avanzada que es muy fácil de detectar a los 28 días más, sólo tendrá un GFP-positivas del timo (Figura 1), por lo que las larvas deben ser examinados de forma individual con una lupa de alta para asegurarse de que todos los positivos los peces son seleccionados. GFP-T positivas las células de LLA superará&gt; 50% de los animales entre los días 45-70. En el ejemplo citado, el pez cebra fueron sacrificados a los 65 días de vida, y las células de leucemia que estaban aisladas y FACS ordenados para limitar el trasplante de dilución. Las células individuales que se yoduro de propidio negativas y positivas-GFP (Figura 2) se clasificaron en una placa de 96 pocillos. Reanálisis se hizo en 10.000 células seleccionadas con el fin de evaluar la viabilidad (lo ideal es&gt; 95%) y la pureza (lo ideal es&gt; 92%, Figura 2). Trasplantado T-ALL generalmente surgen antes de 28 días, pero algunos tumores pueden tener más de 60 días en desarrollarse. En este ejemplo, el día 28, los tumores en fase inicial fueron vistos como un área de buenas prácticas agrarias de células positivas a cerca del sitio de la inyección (Figura 3 B), mientras que algunos ONVOCATORIAS T-eran más avanzado, después de haber expandido para llenar la cavidad peritoneal (Figura 3 C) . Los datos de los ensayos de limitación de la dilución de trasplante de células a partir de tres diferentes principal T-ALL se muestran en la figura 3D. Para estos experimentos, más de 220 animales fueron trasplantados, lo que puede lograrse fácilmente por una persona en pocas horas. El análisis de datos utilizando el software ELDA mostró que, en promedio, 1 de cada 135 T-Todas las células se auto-renovación de la leucemia se propagan las células (Figura 3E). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 larvas de pez cebra inyectados en el estadio de una célula con un trapo.::-CMYC + trapo::-eGFP fueron seleccionados para el crecimiento de la leucemia primaria 28 días después de la inyección. Pescado (*) había GFP-positivas las células T en el timo, este pez se desarrollará la LLA-T como las células T se transforman con el tiempo. Esta etapa es muy común en el día 28. Un pez (**) tenía un avanzado T-ALL que se ha diseminado a los tejidos blandos. Los otros dos peces son negativos para el crecimiento del tumor. La imagen fue tomada con un aumento de 16X. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Fluorescente marcada con T-ALL células fueron ordenados de animales enfermos y se utiliza en el ensayo de transplante de células de dilución limitante. En primer lugar, una puerta se elaboró ​​para seleccionar las células individuales (panel superior izquierdo), entonces las células del yoduro de propidio negativas son seleccionados (panel de la izquierda). Finalmente, una puerta se elaboró ​​para seleccionar sólo las buenas prácticas agrarias de células positivas para la clasificación de la leucemia (panel inferior izquierdo). Células seleccionadas deben ser vueltos a analizar para evaluar la viabilidad y la pureza antes del trasplante (paneles de la derecha). <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Pez cebra fueron examinados para el crecimiento de la leucemia 28 días después del trasplante. Peces están tumor negcreativas (A), tiene un tumor pequeño que crece en el lugar de inyección (B), o una leucemia avanzado (C). Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 7X. El número total de leucemia positiva de pescado por el número total de peces trasplantado en cada dilución se registra, como en (D). Los datos se introducen en el programa basado en la web ELDA para calcular el número de auto-renovación de células de la leucemia y la parte superior e inferior de confianza del 95% (E).

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Una de las principales de la utilización del pez cebra en la investigación del cáncer es que un gran número de animales se pueden utilizar a un costo relativamente bajo. Esto es especialmente importante en la limitación de los ensayos de dilución de trasplante de células, donde las proporciones de los animales trasplantados que desarrollan tumores en el número total de trasplantados se utilizan para determinar iniciadoras del tumor de células de frecuencia. En el método que aquí se presenta, más de 70 animales receptores de trasplante se utilizan por ensayo, proporcionando una estimación precisa del número de células tumorales se propagan. Tanto el número de animales utilizados y las dosis de las células tumorales trasplantadas deben ser optimizados para un modelo de cáncer dado, por ejemplo, si los experimentos iniciales muestran iniciadoras del tumor las células son poco frecuentes, las dosis pueden ser útiles trasplante de 100.000, 50.000, 10.000 y 1.000 células por trasplante. Singénico cepas de pez cebra son útiles para limitar el análisis de dilución. Sin embargo, estas cepas no son todavía de uso común en todos los laboratorios, y algunos modelos de cáncer de pez cebra existen sólo en el pescado alogénico. Limitar trasplantes de células de dilución se puede realizar en las cepas salvajes que han sufrido la ablación inmune, aunque la frecuencia de auto-renovación de células se puede calcular como 10 a 100 veces mayor que si singénico pez cebra se utilizaron 8. Es importante tener en cuenta que una mayor dosis de células deben ser utilizados para trasplantes en receptores no inmunes encontrados, irradiado, ya que algunas células del tumor no va a sobrevivir el trasplante en un micro exterior. Además, muchos tumores comenzará a regresar después de 21 días, cuando el sistema inmune del animal receptor se recupera, por lo que los animales deben ser evaluados para el crecimiento del tumor cada 7 días después del trasplante. Los métodos presentados aquí son adecuadas para su uso con cualquier modelo de cáncer de pez cebra, y hasta ahora han sido utilizados para determinar iniciadoras del tumor de células, tanto en la frecuencia de células T leucemia linfoblástica aguda, 8, y un modelo de tumor sólido, rabdomiosarcoma 16. Estos tumores fueron etiquetados con fluorescencia mediante la co-inyección de embriones con ambos un oncogen y un marcador fluorescente, ya que el ADN co-segrega, los celulares que expresan el oncogén también expresan la proteína fluorescente 17. Mientras que la fluorescencia es recomendable porque facilita el seguimiento del crecimiento del tumor sin necesidad de sacrificar al animal y provee una forma recta hacia adelante para aislar las células tumorales mediante FACS, es posible marcar a las células tumorales con anticuerpos específicos de tumores fabricantes para facilitar su purificación , aunque la tinción de anticuerpos en el pez cebra puede requerir de optimización. Finalmente, una vez que la incidencia del tumor de células de propagación se ha determinado para un tipo de tumor determinado, es posible utilizar estas pruebas para identificar los mecanismos que gobiernan la frecuencia de la célula. Por ejemplo, células tumorales primarias pueden ser tratados con inhibidores de la vía específica antes de limitar la dilución del trasplante, trasplantados o los peces se pueden dosificar con las drogas. Además, la genética de los tumores se pueden manipular mediante la inyección de los peces de una etapa de células con un gen de interés, de modo que los tumores primarios resultantes se sobre-expresan el gen. En estos experimentos, ningún efecto sobre la frecuencia de auto-renovación de células se observaron en los ensayos de dilución límite.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Noti enzima de restricción </td><td> New England Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> Fenol: cloroformo </td><td> EMD Bioquímicos </td><td> 6805-OP </td></tr><tr><td> KCl 5M </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X Tris-EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> Gama alta escalera del ADN </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Singénico pez cebra </td><td></td><td> Referencias 8.6 </td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Yoduro de propidio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microjeringa </td><td> Hamilton </td><td> 80366 </td></tr><tr><td> Malla de 40μm de células colador </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

Autorrenovables las células cancerosas son los tipos de células sólo dentro de un tumor que tiene una capacidad ilimitada para promover el crecimiento del tumor, y por lo tanto conocido como tumor de propagación células o células iniciadoras del tumor. Se cree que la orientación de estas células de auto-renovación de destrucción bloquear la progresión del tumor y detener la recaída, lo que mejora el pronóstico del paciente 1. La manera más común para determinar la frecuencia de auto-renovación de células de un tumor es una célula de ensayo de transplante de dilución límite, en el que las células tumorales son trasplantadas a animales receptores en dosis cada vez mayores, la proporción de animales que se desarrollan los tumores se utiliza el cálculo del número de auto-renovación de células en la muestra original del tumor 2, 3. Lo ideal sería que una gran cantidad de animales podrían ser utilizados en cada experimento de dilución limitante para determinar con exactitud la frecuencia de los tumores se propagan las células. Sin embargo, experimentos a gran escala con ratones son costosos, y la mayoría de limitar los ensayos de dilución de uso sólo 10-15 ratones por experimento. Pez cebra se han destacado como un modelo de cáncer, en gran parte debido a su facilidad de manipulación genética y la economía por el que los experimentos a gran escala puede llevar a cabo. Además, los tipos de cáncer modelo de pez cebra se han encontrado para imitar a sus cuatro contraparte enfermedades humanas. A pesar de que es posible trasplantar células tumorales de un pez a otro sub-letales de la irradiación de los animales receptores, la regeneración del sistema inmunológico después de 21 días a menudo causa la regresión del tumor 5. La reciente creación de pez cebra singénico ha facilitado en gran medida los estudios tumor trasplante 6-8. Debido a que estos animales son genéticamente idénticos, se implantan las células del tumor trasplantado con firmeza en los peces receptores, y el crecimiento del tumor se puede controlar durante largos períodos de tiempo. Singénico pez cebra es ideal para limitar los ensayos de dilución en el trasplante de células tumorales que no tienen que adaptarse al crecimiento en un microambiente extranjeros, lo que puede subestimar la auto-renovación de la frecuencia de 9 celdas, 10. Además, una trasplantes de células se han completado con éxito el uso de pez cebra singénico 8 y varios cientos de animales puede ser fácil y económicamente trasplantados al mismo tiempo, los cuales sirven para proporcionar una estimación más precisa de la auto-renovación de la frecuencia de la célula. Aquí, se presenta un método para la creación de primaria, con fluorescencia marcado de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) en el pez cebra singénico, y el trasplante de estos tumores en la limitación de dilución en los peces adultos para determinar la frecuencia de auto-renovación celular. Mientras que la leucemia se presenta como un ejemplo, este protocolo es adecuado para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células utilizando cualquier modelo de cáncer en el pez cebra.

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.

Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.1K vistas.  Harvard Medical School. Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.

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Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

El trasplante de médula del riñón entero en adultos de pez cebra

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Investigación

Biología

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

Traqueotomía: Un método para el trasplante de células madre para el pulmón

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

Trasplante de lentes en el pez cebra y su aplicación en el análisis de mutantes de ojos

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generación de humanos CD40 activado por células B

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

El trasplante de células directamente en el riñón de adultos de pez cebra

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la retina de pez cebra adultos

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

En electroporación in vivo de Morpholinos en la regeneración de adultos de pez cebra Aleta de cola

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

Analizando Craneofacial en la morfogénesis de pez cebra Utilizando 4D Microscopía Confocal

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Transgénicos Roedor Ensayo para la cuantificación de la célula germinal masculina Mutant Frecuencia

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...