기금은 NIH 보조금 5T32CA09216 - 26 (JSB) 및 K01 AR055619 - 01A1 3 K01 AR055619 - 03S1 (DML)을,뿐만 아니라 알렉 스의 레모네이드 스탠드 재단, 하버드 줄기 세포 연구소 미국 암에 의해 제공되었습니다 사회.

1. zebrafish 배아의 유전자 microinjection <ol><li> rag2를 Linearize : cMyc 및 rag2 : GFP 11 DNA 구조를 37 ° C 하룻밤에 노티 각 플라스미드의 10μg을 소화하여. </li><li> 페놀 : 클로로포름 추출하고 plasmids을 촉진하고, 20μL H 2 O.에서 각 resuspend </li><li> 높은 범위의 DNA 사다리 20μL, 10μL 및 5μL와 1 % 아가로 오스 겔 각 소화 플라스미드의 1:1, 1시 5분 및 1시 10분 희석을 실행하여 DNA의 농도를 결정합니다. 부량 이러한 유형의 일반적으로 분광계 읽기보다 더 정확합니다. </li><li> CG1 - 스트레인 (또는 다른 syngeneic 변형)로 분사에 대한 1M KCl 0.5 X TE에 60ng/μL의 최종 농도로 DNA를 희석 30ng/μL rag2를 사용하여 zebrafish의 배아 : cMyc + 30ng/μL rag2 : : GFP. </li><li> 주사는 이전에 다음 ID로 시연 12, 13로 수행되어야합니다. 간단히, 남성과 여성 zebrafish는 짝짓기 실에서 주입하기 전에 밤새 설정되어 있습니다. 주사 당일, DNA가 주사 바늘에로드되어 압력이 50μm 직경 거품이 무대 마이크로 미터로 측정되는 (30pg DNA) 퇴학되도록 조정됩니다. 그렇다면, 배아는 DNA가 노른자에 안 세포에 직접 주입하고 있기 때문에 한 세포 단계에서 주입하고 있습니다. 주입 CG1 배아 및 유충의 생존은 일반적으로 가난하고, 물고기의 5 % 만 성공적으로 transgene를 통합할 것이며 따라서,&gt; 600 배아는 어떤 물고기가 백혈병을 개발합니다 수 있도록 주입해야합니다. </li><li> 28.5 ° C에서 주입된 배아를 저장하고, 이용하려면 이후에 죽은 태아를 제거합니다. 동물은 그 삶의 오일에 대형 탱크로 전송하고 이전 14 설명된대로 사육하고 있습니다. </li></ol> 2. 기본 T - ALL zebrafish 애벌레에 대한 심사 <ol><li> 주사 후 약 28일, 배양 접시에있는 생선 시스템 물 25mL에 4ng / M Tricane - S의 200μL를 추가하여 애벌레를 마취 zebrafish. </li><li> T - ALL 20분의 485 여기 파장과 GFP 형광 (그림 1)을 감지하는 필터 25분의 530 방출을 사용하여, 20X 확대 epifluorescence 현미경을 사용하여 찬란 - 라벨의 개발을위한 애벌레를 검사합니다. </li><li> 부정하는 이들과는 별도로 종양 긍정적인 애벌레. 부정 애벌레가 나중 지점에서 검사 수 있습니다, 일단 종양은 T - ALL 긍정적인 물고기보고하지 않은 것을 보장하기 위해, 더 큰 성장 수 있습니다. </li><li> 모니터 T - ALL 종양 성장을 추적하는 epifluorescence 현미경을 사용하여 주 적어도 한번 긍정적인 물고기. </li></ol> 3. 찬란 - 표시 주요 백혈병 세포의 분리 및 정화 <ol><li> GFP 양성 백혈병 세포는 동물의&gt; 50 % 잡힐 때, 9mL 생선 시스템 물을 포함하고있는 배양 접시에있는 4ng/mL Tricane - S의 1mL를 추가하여 물고기를 희생. </li><li> 세포를 버퍼 5 % 태아 소 혈청 1mL 0.9X PBS를 포함하는 새로운 배양 접시에있는 물고기를 놓습니다. 면도날, pipet 대형 세포 대단히 짧은 시간을 떼어 놓다 수있는 혼합과 생선을 물에 담가서 부드럽게, 다음 50mL 튜브로 40μm 메쉬 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. 그것은 하나의 세포로 모든 조직 대단히 짧은 시간을 떼어 놓다 필요는 없습니다. </li><li> 4mL 폴리스티렌 튜브에 세포의 Pipet의 500μL. 죽은 세포를 분류합니다 1μL 1mg/mL propidium 요오드화물의 (PI)를 추가합니다. 와동 후, 얼음에 세포를 유지. </li><li> , 야생 타입 CG1 생선을 희생 더운 물에 담가서 부드럽게하고 총 50mL 튜브에 0.9X PBS에 transplant.Add 4mL 5% FBS 동안 종양 세포에 대해 캐리어 역할을 정상 세포를 수집하기 위해 위와 같은 방법으로 변형 5mL의 볼륨. </li><li> 96 - 웰 플레이트의 pipet의 100μL/well 다음 0.9X PBS에서 5% FBS에있는 정상 세포, 희석에 3x10 5 셀 / ML 카운트. </li><li> 다음 복용량에서 혈액 세포를 포함하는 96 - 웰 플레이트에 형광 활성 세포 분류기 (외과), 정렬 GFP 양성, PI 부정적인 종양 세포 (그림 2A, B)을 사용 : 10 셀 / 물론 48 우물, 100 세포 / 음에 24 우물, 1000 세포에 / 물론 12 우물, 그리고 10,000 세포로 / 음 6 웰스에. 또한, 만 세포는 정상 혈액 세포가없이 잘으로 분류하고, reanalyzed는 정렬 세포의 순도와 생존 (그림 2C)를 평가 외과를 사용해야합니다. </li></ol> 4. 성인 zebrafish에 희석 이식을 제한 <ol><li> 10 분 2000xg에서 96 - 웰 플레이트 centrifuging하여 펠렛 세포. </li><li> 뜨는의 95μL 제거하고 나머지 5μL에있는 세포를 resuspend. </li><li> 성인 (&gt; 60 일이 지나면) syngeneic zebrafish 복부 쪽을 잡고, 그리고 26G / 2 &quot;마이크로 주사기를 사용하여 복막 캐비티에 세포 현탁액을 주입. Zebrafish는 이식하기 전에 anesthetized 될 필요가 없습니다. 일반적으로 45 물고기 10 백혈병 세포와 이식 아르, 20 100 세포로 이식되며, 7 천 세포 5 생선 이식 아르는 10000 T - ALL 세포로 이식하고 있습니다. </li></ol> 5. 백혈병 - 시작 셀 주파수를 결정하기 위해 분석 <ol><li> 약 28일 이식 후 20분의 485 여기 파장과 GFP 형광을 감지 필터 25분의 530 방출을 사용하여 epifluoresence 현미경으로 이식 생선을 확인합니다. 주입 물고기의 총계 당 긍정적인 물고기의 수를 기록합니다. </li><li> 다시 검사 최대 90 일 동안 모든 십사일 생선과 긍정적인 물고기의 수를 기록합니다. 종양 - 긍정적인 물고기가 죽어가는가하면, Tricane - S 과다 복용으로 동물을 희생. </li><li> 그림 3D와 같이 테이블에 결과를 입력. 웹 기반 엘다 (익스 트림 제한 희석 분석)에 대한 통계 소프트웨어로 데이터를 업로드 <a href="http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html">http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html</a> 에서 종양 긍정적이고 부정적인 동물의 주파수를 사용하여 15 기본 T - ALL 내에서 자기 갱신 백혈병 세포의 빈도를 결정하기 위해 각 이식 선량. </li></ol> 6. 대표 결과 : syngeneic 생선 배아로의 DNA microinjection은 종종 태아의 &lt;60% 24 시간 동안 생존과 주입 배아의 낮은 생존율을 초래합니다. 또한, 주입 syngeneic 물고기의 생존은 자주, 애벌레 개발하는 동안 일반적으로 가난한 사람입니다 &lt;20%은 28 일 동안 살아. T - ALL 개발할 것입니다 유전자 변형 물고기를 만들려면 배아들 중 다수를 주입하는 것이 중요하다. 예를 들어, CG1 변형 배아가 rag2 주사되었습니다 : cMyc + rag2 : : GFP. transgenes는 GFP를 표현하는 모든 세포는 또한 cMyc 표현되도록, 개발 배아 공동 분리. 애벌레는 T - ALL 28일 (그림 1) 이후 기본에 대한 상영되었다. 이전 작업은 주입된 물고기의 약 5 %가 (그림 1)은 thymus 내에 T - 세포가 GFP - 긍정적인 것이라고 표시하고, T - 세포가 변형되어 11 이러한 물고기의 100 %가 백혈병을 개발합니다. zebrafish의 작은 비율은 일 28에 탐지하는 것은 매우 쉬운 고급 백혈병가있을 수 있지만, 대부분은 GFP 양성 thymus (그림 1)이되므로, 애벌레는 모든 긍정적인 보장하기 위해 높은 배율에 따라 개별적으로 검사해야합니다 물고기가 선택됩니다. GFP 양성 T - ALL 세포가 45-70 일 사이에 동물의&gt; 50 %를 추월합니다. 제공된 예제에서, zebrafish는 삶의 65일에 희생되었고, 백혈병 세포는 고립되었고 외과는 희석 이식을 제한을위한 정렬. propidium 요오드화물 부정과 GFP 양성 (그림 2)되었습니다 단일 세포는 96 - 웰 플레이트로 정렬되었습니다. Reanalysis는 생존 (이상&gt; 95%)와 순결을 평가하기 위해 10,000 정렬 세포에서 수행되었다 (이상&gt; 92%, 그림 2). 이식 T - 올스은 일반적으로 28일 전에 발생하지만, 일부 종양 개발에 60 일 이상 소요될 수 있습니다. 일부 T - 올스은 복막 캐비티 (그림 3C)을 채우기 위해 확장하는 데 더 진행하는 동안이 예제에서는, 하루 28에서 초기 단계의 종양은 사출 사이트 (그림 3B) 근처 GFP 양성 세포의 영역으로 간주되었다 . T - 올스 세 가지 기본에서 희석 세포 이식의 assays을 제한에서 데이터는 그림 3D로 표시됩니다. 이러한 실험의 경우, 220 이상의 동물은 쉽게 몇 시간 이내에 한 사람에 의해 성취 수있는, 이식되었다. 엘다 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석은 평균 135 1 T - ALL 세포 백혈병 - 전파 전지 (그림 3E) 자기 갱신했고 것으로 나타났다. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1 걸레로 한 세포 단계에 주입 Zebrafish의 유충 :. : - cMyc + 걸레 : - eGFP는 기본 백혈병 성장을위한 상영되었습니다 28일 포스트 주사. 물고기 (*) thymus 내에 T - 세포가 GFP 양성을했다, T - 세포가 시간이 지남에 따라 변형되기로 물고기 T - ALL을 개발할 것입니다. 이 단계는 28 일 아주 일반적입니다. 한 물고기 (**) 고급 있었 T - ALL 부드러운 조직으로 퍼져있다. 나머지 물고기 두 마리는 종양 성장을 위해 아무것도 없습니다. 이미지 16X 배율에서 촬영되었다. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 찬란 - 분류 T - ALL 세포가 질병 동물의 분류 및 제한 희석 세포 이식 분석에 사용되었다. 첫째, 게이트가 하나의 세포 (왼쪽 상단 패널)을 선택 부른 후 propidium 요오드화물 부정적인 세포 (가운데 왼쪽 패널)을 선택합니다. 마지막으로, 게이트는 GFP - 긍정적인 정렬을위한 백혈병 세포를 (왼쪽 아래 패널)를 선택 그립습니다. 정렬 세포는 이식하기 전에 생존 및 순도 (오른쪽 패널)을 평가하기 위해 reanalyzed한다. <img src="/files/ftp_upload/2790/2790fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. Zebrafish는 28일 이식 후 백혈병의 성장에 대한 검사를했다. 물고기도 종양 neg 아르ative은 (A), 사출 사이트 (B)에서 성장 작은 종양이 있거나 진행 백혈병 (C)가. 이미지 7X 확대 촬영했다. 각 희석에 이식 물고기의 총계 당 백혈병 - 긍정적인 생선의 총수은 (D)과 같이 기록됩니다. 데이터의 개수를 계산하는 웹 기반 엘다 프로그램에 입력 아르 자기 갱신 백혈병 세포 및 상위 및 하위 95 % 신뢰 간격 (E)를.

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

암 연구에 zebrafish를 사용하여의 주요 장점은 동물의 다수가 상대적으로 저렴한 비용으로 사용할 수있다는 것입니다. 이것은 이식의 총 개수에 종양을 개발 이식 동물의 비율은 종양 세포 - 시작 주파수를 결정하는 데 사용되는 희석 세포 이식의 assays을 제한 특히 중요합니다. 여기서 제시하는 방법에서, 70 이식받는 동물 종양 - 전파 휴대폰 번호의 정확한 견적을 제공하는 분석마다 사용됩니다. 사용된 동물의 숫자와 이식 종양 세포의 방사선이 모두가 주어진 암 모델에 맞게 최적화되어 있어야합니다, 예를 들어, 초기 실험 종양 - 시작 세포가 드물게 보여주면, 유용한 이식 접종은 100,000, 50,000, 10,000 1,000 세포 수 있습니다 이식. Syngeneic zebrafish의 변종은 희석 분석을 제한에 유용합니다. 그러나 이러한 변종이 아직 일반적으로 모든 실험실에서 사용하고, 일부 암 zebrafish 모델은 allogenic 물고기 존재하지 않습니다. 자동 갱신 셀 주파수가 syngeneic zebrafish가 8을 사용한다면보다 10-100 배 이상으로 계산 수 있지만 제한 희석 세포 transplantations은 면역 절제를받은 야생 형 변종으로 수행할 수 있습니다. 일부 종양 세포가 외국 microenvironment에 이식 생존하지 않습니다, 세포의 큰 복용량이 아닌 면역 일치, 조사받는 사람에 이식에 사용되어야합니다하는 것이 중요합니다. 또한, 많은 종양받는 동물의 면역 시스템이 복구 21일 후 복귀하기 시작되므로 동물은 매 7 일마다 이식 후 종양 성장에 대한 평가해야합니다. 여기에 제시 방법은 zebrafish 암 모델에서 사용하기에 적합하며, 지금까지 결정하는 데 사용되었습니다 종양 - 시작 T - 세포 급성 lymphoblastic 백혈병 8, 고체 종양 모델, rhabdomyosarcoma 16 모두 셀 주파수를. 이러한 종양은 찬란 oncogene과 형광 마커 모두와 배아의 공동 주사로 라벨이 붙지만, DNA 공동 segregates는 oncogene을 표현하는 세포는 형광 단백질 17 표현 때문에. 그것은 동물을 희생하지 않고 종양 성장의 추적 촉진 및 외과 의해 종양 세포를 분리하기 위해 스트레이트 전달 방법을 제공하기 때문에 형광 권장하는 동안, 그것은 자신의 정화를 촉진하는 종양이 특정 업체에 항체로 종양 세포를 분류 할 수 있습니다 , zebrafish에 불구하고 항체 얼룩이 최적화가 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 한번 종양 - 증식 세포의 발병률이 주어진 종양의 유형에 대한 결정되었습니다, 그것은 그들의 셀룰라 주파수를 제어 메커니즘을 식별하는 데 이러한 assays를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 기본 종양 세포는 희석 이식, 또는 자신이 마약을 복용한 수 이식 물고기를 제한하기 전에 특정 경로 억제제로 치료하실 수 있습니다. 또한, 종양 자체의 유전자는 결과 기본 종양 유전자를 과다 표현되도록, 관심있는 유전자를 가진 세포 단계 생선을 주사에 의해 조작 수 있습니다. 이 실험에서, 자기 갱신 세포 주파수에 대한 영향은 제한 희석 assays에서 관찰됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 노티 제한 효소 </td><td> 뉴 잉글랜드 Biolabs </td><td> R0189 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 </td><td> EMD의 Biochemicals </td><td> 6805 - OP </td></tr><tr><td> 5M KCl </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> 100X 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> T9285 </td></tr><tr><td> 하이 레인지 DNA 사다리 </td><td> Fermentas </td><td> R0621 </td></tr><tr><td> Syngeneic zebrafish </td><td></td><td> 참조 6-8 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Gibco </td><td> 16000-036 </td></tr><tr><td> Propidium의 이우 </td><td> 시그마 - 알드리치 </td><td> P4864 </td></tr><tr><td> 26G / 2 &quot;Microsyringe </td><td> 해밀턴 </td><td> 80,366 </td></tr><tr><td> 40μm 메쉬 셀 스트레이너 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352340 </td></tr></tbody></table>

quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish

자기 갱신 암 세포가 종양 성장을 촉진하기 위해 무제한 능력을 가지고 종양 내에있는 유일한 세포 유형이며, 따라서 종양 - 증식 세포 또는 종양 - 시작 세포로 알려져 있습니다. 그것은 파괴를 위해 이러한 자기 갱신 세포를 대상으로하는 것은 크게 환자 예후 (豫后) 1 개선, 종양 진행을 차단하고 재발을 막을 수 있다고 생각합니다. 의 빈도를 결정하는 가장 일반적인 방법은 자기 갱신 종양 내에서 세포를하면 종양 세포가 증가 복용에받는 동물에 이식하는 제한 희석 세포 이식 분석이다; 종양을 개발하는 동물의 비율은 숫자를 계산하는 데 사용됩니다 의 자기 갱신 원래 종양 샘플 2, 3 이내에 세포를. 이상적으로, 동물의 많은 정확하게 종양 - 전파 세포의 빈도를 결정하기 위해 각각의 제한 희석 실험에 사용되는 것입니다. 그러나, 마우스를 포함한 대규모 실험 비용이며, 대부분의 제한 희석 assays 실험마다 10-15 생쥐를 사용합니다. Zebrafish는 유전자 조작과 대규모 실험을 수행할 수있는가 경제의 그들의 용이성으로 인해 많은 부분에서 암 모델로 프로미넨스를 얻고있다. 또한, zebrafish 모델에서 암 종류 밀접하게 자신의 대응 인간의 질병 4 모방을 발견했습니다. 그것이받는 동물의 하위 치명적인 조사, 21 일 후에 면역 시스템의 재생하여 한 물고기에서 다른 종양 세포를 이식하는 것이 가능이지만 종종 종양 역행 5됩니다. syngeneic zebrafish의 최근 생성은 크게 종양 이식 연구에게 6-8를 촉진하고 있습니다. 동물들이받는 생선, 종양 성장에 견고하게 유전자 동일, 이식 종양 세포의 합치다 있기 때문에 시간이 오랜 기간 동안 모니터링할 수 있습니다. Syngeneic zebrafish 자기 갱신 세포 주파수 9, 10을 과소 평가 수있는 외국 microenvironment 성장에 적응하지 않아도 종양 세포에 희석 이식 assays 제한에 이상적입니다. 또한 한 세포 이식이 성공적으로 자기 갱신 셀 주파수의보다 정확한 견적을 제공하는 역할을 모두하는 쉽고 경제적으로 한 번에 이식 수 있습니다 syngeneic zebrafish 8 수백 동물을 사용하여 완료되었습니다. 여기 방법 syngeneic zebrafish의 기본, 찬란 - 라벨 T - 세포 급성 lymphoblastic 백혈병 (T - ALL) 작성과 자기 갱신 세포 주파수를 결정하기 위해 어른 물고기로 희석을 제한에서 이러한 종양을 이식을 위해 제공됩니다. 백혈병이 예제로 제공되는 동안,이 프로토콜은 zebrafish에 암 모델을 사용하여 종양 - 전파 세포의 빈도를 결정하기 위해 적합합니다.

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Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

Syngeneic Zebrafish의 제한 희석 세포 이식을 사용하여 종양 - 증식 세포의 주파수 Quantifying

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

quantifying-frequency-tumor-propagating-cells-using-limiting-dilution

Research

JoVE Journal

Biology

19.1K 조회수.  Harvard Medical School. 제한 희석 세포 이식의 assays는 종양 - 세포의 증식 주파수를 결정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 찬란 - 표시 백혈병 및 성인 zebrafish의 복막 구멍에 희석을 제한에서이 백혈병 세포를 분리 및 이식하는 방법에 세부 사항을 개발 syngeneic zebrafish을 생성하는 방법을 설명합니다.

비디오: Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

성인 Zebrafish의 전체 신장 마로우의 이식

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

연구

생물학

Tracheotomy: A Method for Transplantation of Stem Cells to the Lung

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell therapy may alleviate many of the symptoms associated with lung disease and induce alveolar repair in adults. Concurrent with the ongoing search for stem cells applicable for human treatment, precise delivery and homing (to the site of disease) must be reassured for successful therapy. Here, I report that stem cells can safely be instilled via the trachea opening a non-stop route to the lung. This method involves a skin incision, caudal insertion of a cannula into and along the tracheal lumen, and injection of a stem cell vehicle mixture into airways of the lung. A broad range of media solutions and stabilizers can be instilled via tracheotomy, resulting in the ability to deliver a wider range of cell types. With alveolar epithelium confining these cells to the lumen, lung expansion and negative pressure during inhalation may also assist in stem cell integration. Tracheal delivery of stem cells, with a quick uptake and the ability to handle a large range of treatments, could accelerate the development of cell-based therapies, opening new avenues for treatment of lung disease.

Significant breakthroughs in stem cell identification are continuously being made. To translate these discoveries, however, novel methods for cellular delivery must be devised. Here I report that the airways provide a safe route for stem cell transplantation to the lungs.

기관 절개술 : 폐에 줄기 세포의 이식을위한 방법

Lung disease is a leading cause of death and likely to become an epidemic given increases in pollution and smoking worldwide. Advances in stem cell ...

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development can be addressed. The zebrafish is useful for genetic studies due to several advantageous characteristics, including small size, high fecundity, short lifecycle, and ease of care. Lens development occurs rapidly in zebrafish. By 72 hpf, the zebrafish lens is functionally mature [3]. Abundant genetic and molecular resources are available to support research in zebrafish. In addition, the similarity of the zebrafish eye to those of other vertebrates provides basis for its use as an excellent animal model of human defects[4-7]. Several zebrafish mutants exhibit lens abnormalities, including high levels of cell death, which in some cases leads to a complete degeneration of lens tissues [8]. To determine whether lens abnormalities are due to intrinsic causes or to defective interactions with the surrounding tissues, transplantation of a mutant lens into a wild-type eye is performed. Using fire-polished metal needles, mutant or wild-type lenses are carefully dissected from the donor animal, and transferred into the host. To distinguish wild-type and mutant tissues, a transgenic line is used as the donor. This line expresses membrane-bound GFP in all tissues, including the lens. This transplantation technique is an essential tool in the studies of zebrafish lens mutants.

Lens development involves interactions with other tissues. Several zebrafish eye mutants are characterized by an abnormally small lens size. Here we demonstrate a lens transplantation experiment to determine whether this phenotype is due to intrinsic causes or defective interactions with tissues that surround the lens.

렌즈 Zebrafish의 이식과 눈 돌연변이의 분석에의 응용

The lens plays an important role in the development of the optic cup[1,2]. Using the zebrafish as a model organism, questions regarding lens development ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

인간 CD40 - 활성화된 B 세포의 생성

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

조직 타겟 배아 Chimeras : Zebrafish Gastrula 세포 이식

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

직접 성인 Zebrafish의 신장에 세포의 이식

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos의 생체내의 Electroporation에서 성인 Zebrafish의 망막에

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

전체 세포 인구의 단일 셀 수준에서 Cyclin B의 Proteolysis 유학

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical clarity and amenability to genetic manipulation, the zebrafish embryo has become a popular model organism with which to perform time-lapse analysis of morphogenesis in living embryos. Confocal imaging of a live zebrafish embryo requires that a tissue of interest is persistently labeled with a fluorescent marker, such as a transgene or injected dye. The process demands that the embryo is anesthetized and held in place in such a way that healthy development proceeds normally. Parameters for imaging must be set to account for three-dimensional growth and to balance the demands of resolving individual cells while getting quick snapshots of development. Our results demonstrate the ability to perform long-term in vivo imaging of fluorescence-labeled zebrafish embryos and to detect varied tissue behaviors in the cranial neural crest that cause craniofacial abnormalities. Developmental delays caused by anesthesia and mounting are minimal, and embryos are unharmed by the process. Time-lapse imaged embryos can be returned to liquid medium and subsequently imaged or fixed at later points in development. With an increasing abundance of transgenic zebrafish lines and well-characterized fate mapping and transplantation techniques, imaging any desired tissue is possible. As such, time-lapse in vivo imaging combines powerfully with zebrafish genetic methods, including analyses of mutant and microinjected embryos.

Time-lapse confocal imaging is a powerful technique useful for characterizing embryonic development. Here, we describe the methodology and characterize craniofacial morphogenesis in wild-type, as well as pdgfra, smad5, and smo mutant embryos.

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

형질 전환 쥐 분석 정량화 남성 생식 세포 돌연변이 주파수에 대한

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...