우리는 미세 조정 칩에 대한 조건에 자신의 기여에 대한 실험과 리코 린드너의 초기 칩 실험 설정에 대한 도움 안드레아 테데스키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Hertie 재단에 의해 지원되었다; 포춘 그랜트, Tuebingen 대학 및 DFG DI 1497/1-1 보조금 (모든 시몬 디 지오 바니 부여).

1. 좌골 &amp; 지느러미 열 신경 손상 <ol><li> 동물은 수술 수건에 위치하고 아래 thermopad 37에서 마우스의 체온을 유지 ° C. 절차 전반에 걸쳐 존재입니다 모든 동물은 지속적인 O / isoflurane이 관리와 수술 anesthetized 있습니다. 외과 용구는 절차 전에 autoclaved 있습니다. </li><li> 좌골 신경통의 부상, 두 엉덩이쪽에 신중하게 면도 있으며, 왁스는 사전 Betadyne 3 회 다음 알코올로 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다. </li><li> 좌골 신경은 4mm의 절개가 후부과 피부를 통해 중반 허벅지에있는 대퇴골을 병행함으로써 훌륭한 포셉과 팔뚝의 femoris의 간격 근육을 확산하여 노출됩니다. </li><li> 노출된 좌골 신경이 그 부상하고, 피부가 두 봉합 클립과 함께 닫힙니다. </li></ol> 참고 : 동일한 절개가 좌골 신경을 노출했다지만, 상처가 가짜 부상에 대한 신경은 그대로 둔 폐쇄 봉합합니다. <ol start="5"><li> 등의 열 손상의 경우 마우스의 뒷면을 세심하게 면도하고, 왁스는 이전에 알코올 스프레이 / 강타와 함께 피부를 클렌징하는 일반 헤어 제거제와 함께 완료됩니다. </li><li> 척수는 T7 약에서 T13에 2.5 cm의 절개하여 노출됩니다. 피부는 별개로 확산되고 결합 조직은 T9에서 T11로 척추를 따라 제거됩니다. </li><li> laminectomy는 T10 수준에서 수행됩니다 </li></ol> 참고 : 대부분의 실험은 laminectomy가 위장 부상으로 간주됩니다. <ol start="8"><li> Xylocain 몇 방울이 코드를 마취시키다하기 위해 조직에 추가되며, 두라 메이터는 척수를 만지지 않도록주의를 기울이고, 제거됩니다. </li><li> 지느러미 열은 부상되고 근육은 다시 척수를 만지지 않도록주의를 기울이고 닫기 봉합합니다. 마지막으로, 피부 봉합 클립과 함께 폐쇄 봉합합니다. Buprenorphine (0.1 밀리그램 / kg 체중)을 48 시간 또는 더 이상 필요하지 않은까지 매일 두 번 실시한다. </li></ol> 2. 교차 연결 <ol><li> euthanization 후 부상 생쥐에서 L4 및 L5 DRG를 해부하다. 얼음처럼 차가운 HBSS + 프로 테아제 억제제 칵테일 (2 4 동물의 총 각 동물의 부상과 2 사기 DRG)에 16 DRG 총를 수집합니다. </li><li> 간단히 DRG를 원심 후, 조심스럽게 37 HBSS를 제거하고 PBS + 프로 테아제 억제제 칵테일의 1 % 포름 알데히드 500 μl를 추가하고 30 분 샘플을 품어 ° C. </li></ol> 임계 단계. 신선한, 분자 생물학의 등급 포름 알데히드를 사용하십시오. <ol start="3"><li> 실온에서 5 분간 고정과 부화를 중지 글리신 125 MM을 추가합니다. </li><li> 간단히, 원심 분리기 버퍼를 대기음, 500 μl 얼음처럼 차가운 PBS + 프로 테아제 억제제 칵테일과 함께 두 번 조직을 씻으십시오. </li></ol> 3. 핵의 준비와 염색질의 전단 <ol><li> PBS를 대기음, SDS의 용해 버퍼 400 μl를 추가 미리 차게 microcentrifuge 관에 전송하고, micropestle로 약 30 스트로크와 조직을 방해. </li></ol> 임계 단계. 용해 및 조직의 혼란은 가교 염색질의 좋은 수율을 위해 매우 중요합니다. <ol start="2"><li> 8 펄스, 70 % 출력 (Bandelin, Sonoplus GM70) 각 10초와 샘플을 Sonicate. </li></ol> 주의. 염색질의 전단은 특정 sonication을 위해 최적화된되어야합니다 설정하고 염색질의 적절한 조각은 (섹션 3 참조) 실제 IP 실험을 실행하기 전에 확인하여야한다. 염색질의 참고. 파쇄도 micrococcal nuclease (MNase) 소화에 의해 수행 수 있습니다. MNase는 소화가 기본 조직 염색질의 immunoprecipitation을 위해 선호되는 동안 경험 원칙적으로, sonication에 의해 분열이 고정 조직이 선호됩니다. 교차 연결된, 가지각색 염색질은 최대 2 개월까지 -80 ° C에 보관하지만, 반복되는 동결 / 해동 사이클을 피할 수 있습니다. 4. 염색질 소화의 분석 (권장) <ol><li> 분석을위한 가지각색 염색질 샘플 10 μl를 제거합니다. 샘플에 NaCl 200 MM을 추가하고 2 시간을위한 65 ° C를 잠복기하여 상호 링크를 역방향. </li><li> DNA를 (8 항 참조) 정화하고 1 % 아가로 오스 겔을 실행합니다. DNA는 약 200-1000 BP (그림 1)의 길이로 조각난해야합니다. </li></ol> 불완전한 조각이 감소 해상도 및 증가 배경에 이끌면서 염색질의주의. 오버 - 조각이 감소 신호가 발생할 수 있습니다. 5. Immunoprecipitation <ol><li> immunoprecipitation 반응의 숫자를 (아래 참고 참조) 확인하고, 마찬가지로 새로운 튜브에 샘플을 나눕니다. 각각의 볼륨을 가지고최대 칩 버퍼 + 테아제 억제제 칵테일 500 μl 수 있습니다. </li><li> 당신의 희석 시료의 5 μl를 제거하고 새 튜브로 전송할 수 있습니다. 이것은 1 %의 입력 샘플이며 필요 때까지 그것은 (제 7) -20 ° C에 저장됩니다. </li><li> 각 immunoprecipitation 들어, 적절한 항체 또는 일반 IgG 컨트롤을 추가하고 회전 ° C 하루 4 알을 품다. </li></ol> 참고. immunoprecipitation의 번호, 긍정적인 컨트롤 (예 : 히스톤 H3 항체)과 대조군 (일반 IgG)를 결정할 때 고려되어야합니다. 각 IP에 사용되는 항체의 수량 항체 사이에 다양하고 경험적으로 결정되어야합니다. 그러나, 그것은 2-10의 범위 이내인가? G / immunoprecipitation. <ol start="4"><li> 귀하의 항체 / 단백질 / DNA 복잡한 immunoprecipitate하려면, 칩 학년 단백질 G 자성 비즈의 30 μl를 추가하고 4 2 H에 대한 품어 ° C를 회전. </li></ol> 6. 세탁 <ol><li> 풀다운 바운드 염색질 - 구슬 복잡한하려면 자기 랙에 튜브를 놓으십시오. 솔루션은 명확하고 신중하게 뜨는을 제거할 때까지 기다리십시오. </li><li> 비즈로 낮은 소금 세척 1 ML (칩 버퍼)을 추가하고 4 품어 ° C를 회전 3~5분에 대한 다음 구슬을 내리고 단계 6.1에서와 같이 세척을 대기음. 3 세척 총에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 비즈 높은 소금 세척 버퍼 1 ML (칩 버퍼 + 350 MM NaCl)을 추가하고 구슬을 내리고 단계 6.1에서와 같이 세척을 대기음 다음, 회전 3~5분을위한 부화. </li></ol> 7. 용출 및 상호 연결의 반전 <ol><li> -20의 입력 샘플을 꺼내서 ° C는, 칩 용출 버퍼 150 μl를 추가하고 단계 7.5까지 실온에서 따로 설정할 수 있습니다. </li><li> 6.3 단계에서 각 IP 샘플 1X 칩 용출 버퍼 150 μl를 추가합니다. </li><li> thermomixer에 튜브를 삽입하고 ° C 부드러운 vortexing 30 분 65 샘플을 잠복기로 비즈에서 염색질을 elute. </li><li> 자기 선반에 구슬을 아래로 당겨, 조심스럽게 새로운 튜브로 eluted 염색질 (뜨는)를 전송합니다. </li><li> 귀하의 입력 샘플을 포함하여 모든 튜브에 2 시간 동안 NaCl 40 65 μg / Proteinase K와 부화의 반응 ° C의 200mM를 추가합니다. </li></ol> 참고. 용출 단계도 상온에서 수행할 수 있지만, 그것으로 효율적이지 않습니다 수 있습니다. 8. DNA 복구 <ol><li> 30 초 동안 단계 7.5과 와동에서 샘플로 / 페놀 클로로포름 1 볼륨을 추가합니다. </li><li> 5 분 룸 온도에서 microcentrifuge의 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 수성 (어퍼) 새로운 튜브로 위상, 수성 단계로 클로로포름 1 볼륨을 추가하고 30 초 동안 와동을 복구합니다. </li><li> 5 분 룸 온도에서 microcentrifuge의 최대 속도로 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 새로운 튜브로 수성 (어퍼) 단계를 복구 후, 얼음처럼 차가운 100 % 에탄올 20 μg / 글리코겐의 반응, 그리고 2.5 볼륨을 NaOAc의 300mM 추가할 수 있습니다. </li></ol> 주의. 같은 글리코겐으로 이동 통신사의 추가는 비교적 작은 크기의 DNA 조각의 강수량을 향상시키기 위해 필요합니다. <ol start="6"><li> ° C 2 시간 동안 침전의 DNA를 -80에서 알을 품다. </li></ol> 참고. 강수량 단계도 -20 ° C.에서 하룻밤을 수행할 수 있습니다 <ol start="7"><li> 4 20 분 microcentrifuge의 최대 속도로 샘플을 원심 ° C. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 제거하고 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 300 μl와 시켰던 DNA의 알약을 씻으십시오. </li><li> 4 10 분 microcentrifuge의 최대 속도로 샘플을 원심 ° C. </li><li> 조심스럽게만큼 뜨는 가능한 제거하고 알약은 공기 건조하게. </li><li> 무균 H 2 O. 20 μl에 Resuspend 샘플 지금은 PCR을위한 준비, 또는 DNA는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 9. 대표 결과 좌골 신경통의 병변에 따라 DRGs의 칩 실험의 대표적인 결과는 (그림 1 및 2) 표시됩니다. 첫째, 우리는 약 200-1000 BP (그림 1)의 길이로 조각난 DNA를 보여줍니다. 둘째, 우리는 단백질 43 (GAP - 43) 전용시 좌골 신경 손상 (레인 4, 그림 2, 5 &#39;) 관련된 성장의 근위 모터에서 PCR 신호 다음과 같은 칩을 보여줍니다. 없음 PCR 신호 동물은 가짜 상처를 받고 (레인 3) 때 존재하지 않으며 IP (레인 5와 6)에 대한 정상 혈청 IgG를 사용하는 경우. 항체의 특이성에 대한 테스트하려면, 우리는 같은 DNA 샘플을 분석,하지만 숙박이 예상되지 관심을 우리의 유전자의 3&#39; - UTR에서 영역을 감지 제어 프라이머 세트를 사용했습니다. PCR 신호는 표준 PCR 컨트롤 같은 비 - IP DNA 샘플을 나타내는 입력 신호를 제외한 모든 차선 (차선 3-6 그림 2, 3 &#39;), (레인 1-2, Figu에서 결석 아르다시 2). 회로도 (그림 3)에 요약로 칩 절차 중 좌골이나 척추 등의 부상 열 다음을 수행할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="그림 1" /> 조각 길이의 적절한 범위를 sonication으로 가지각색으로 잘리고 반대로 교차 연결된 DNA의 그림 1. 아가로 오스 겔. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. acetylated p53의는 GAP - 43 48 시간 좌골 신경 손상 후 근위 발기인 지역에 바인딩되는 보여주는 좌골 신경 병변 다음 DRG 조직에서 세미 양적 PCR 결과. 제어 PCR acetylated p53의는 GAP - 43 유전자 (S = 섐 전 = 부상자)의 3&#39; - 번역되지 않은 지역 (UTR)에있는 DNA의 제어 영역에 바인딩하지 않는 것과 같은 DRG 조직 쇼에서. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 좌골 신경에 병변 사이트의 위치, 그리고 등의 열의를 보여주는 일반적인 다이어그램.

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	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 직접 axonal 부상 다음과 같은 성인 신경계의 axonal 중생 중에 염색질 환경에 대해 문의하는 방법을 제공합니다. 그것은 PNS 또는 CNS를 하나에 부상 이후 transcriptional 및 epigenetic 환경을 탐사하기 위해 염색질 immunoprecipitation와 DRG 상해 모델을 포함합니다. 그것은 자신이 좋아하는 전사 인자에 대한 putative 구속력이 사이트를 특성화하고 싶습니다,이 사이트의 수용 인원은 부상에 대한 응...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 10X 칩 버퍼 </td><td> 세포 신호 </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2X 칩 용출 버퍼 </td><td> 세포 신호 </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> 칩 학년 단백질 G 자성 비즈 </td><td> 세포 신호 </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> 마그나 그립 랙 (물론 8) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> 클로로포름 </td><td> 머크 </td><td> UN 1888 </td></tr><tr><td> 37 % 포름 알데히드 </td><td> 로스 </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10X 글리신 솔루션 </td><td> 세포 신호 </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> 글리코겐 </td><td> 시그마 </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Gibco </td><td> 14,185 </td></tr><tr><td> 히스톤 H3 항체 (토끼) </td><td> 세포 신호 </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> 일반 래빗 IgG </td><td> 세포 신호 </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> 페놀 / 클로로포름 / Isoamyl 알코올 </td><td> 로스 </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> 프로 테아제 억제제 칵테일 정제 </td><td> 로체 </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinase K (20 MG / ML) </td><td> 세포 신호 </td><td> 10,012 </td></tr><tr><td> SDS 용해 버퍼 </td><td> 북부 </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> 장비 필요 </th></tr><tr><td> Sonicator </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifuge </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

주변 신경계 (PNS)에 그가 부상 후 제한된 범위 (탱 외., 2006)으로 재생을하는 동안 중추 신경계 (CNS)에 Axons이 재생되지 않습니다. 이것은 neurite 및 axonal 가지 필수 transcriptional 프로그램 PNS (Makwana 외., 2005)의 부상에 따라 활성화되는 인식됩니다. 그러나 생체내로의 연결을 유전자 규제를 분석에 사용할 수있는 도구가 제한되어 종종 도전하고 있습니다. CNS와 PNS 모두 같은 소마에서 발생하는 bifurcated 축삭에 의해 innervated 때문에 지느러미 루트 신경 (DRG)는 훌륭한 상해 모델 시스템을 제공합니다. 신경은 모든 transcriptional 이벤트가 발생 세포 기관의 이산 컬렉션을 대표하고, 따라서 쉽게 reproducibly 동물에서 제거할 수 있습니다 transcriptional 활동의 명확하게 정의된 영역을 제공합니다. axonal 중생이 발생 PNS (예 : 좌골 신경)에서 신경 섬유의 부상은 재생이 장소 (예 : 척수을하지 않습니다 어디 CNS에서 비슷한 부상에 대응 사람에서 구분되는 transcriptional 프로그램의 집합을 공개합니다 ). 히스톤, 바인딩 전사 인자와 부상에서 PNS 또는 CNS 중 하나에 발생 DNA 조작을위한 사이트는 염색질 immunoprecipitation을 (칩)을 사용하여 특징하실 수 있습니다. 여기, 우리는 axonal 부상을 다음과 고정 마우스 DRG 조직을 사용하여 칩 프로토콜을 설명합니다. 이 강력한 결합은 axonal 재생을 촉진하는 데 필요한 프로 재생 염색질 환경을 특성화를위한 수단을 제공합니다.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K 조회수.  University of Tuebingen. 우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Rhizotomy 후 도설 루트 Axons의 라이브 영상

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

연구

신경과학

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

마우스 지느러미 열 압박 손상에 마이크로 글 리아와 대 식세포와 축삭의 상호 작용의 생체 내에 이미징

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

루트 신경절 신경 세포와 차별화 된 지방 유래 줄기 세포를 이룬다 :<em&gt; 체외</em&gt; 공동 문화 모델은 주변 신경 재생을 연구하는

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

설치류의 등쪽 뿌리 신경절의 척수 및 절연의 유압 압출

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

신경 전달 물질 방출 공부 하 느 루트 중추 절연 및 주 문화

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

등갈 뿌리 신경절 대식세포의 신속한 절연

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

체외에서 감각 및 모터 신경에서 섬유 아세포와 슈완 세포의 정화

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

면역패닝에 의한 성체 마우스 배근 신경절 뉴런 배양의 농축

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...