نشكر الدكتور ألان تسلر للتعليق عليها ومساعدة التحرير. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NS062320.

1. مجهر إعداد والتحضير والتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لدينا مجموعة التصوير وتتألف المجموعة من stereomicroscope MZ16 ايكا الفلورسنت مع مصراع الكاميرا بسرعة ويبرد CCD التي تسيطر عليها البرمجيات Metamorph. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة التحكم التدفئة حراريا وضبط الانتاج الى 32.5 درجة مئوية للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء وبعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رينغر الدافئة محلول معقم أو اصطناعية السائل النخاعي (ACSF) إلى 32.5 درجة مئوية في وقت مبكر للري من الحبل الشوكي أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات مع حقن داخل الصفاق من زيلازين (8 ملغ / كلغ) والكيتامين (120 ملغ / كلغ) كوكتيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق أعلى الظهر مع كليبرز الحيوانات الصغيرة وانتشارها قطرة واحدة صغيرة من محلول لإزالة الشعر فوق منطقة حلق مع مسحات القطن ذات الرؤوس. بعد دقائق ، وإزالة المستحضر تطبيقها باستخدام الايثانول 70 ٪ الإسفنج شاش مبللة. </li></ol> 2. استئصال الصفيحه والتعرض الجراحية الجذرية الظهرية L5 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الحيوانات على حامية (32.5 درجة مئوية) وسادة وتطهير الجلد مع مسحات الايثانول 70 ٪ غارقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت إضاءة ساطعة على حقل stereomicroscope ، تنفيذ شق خط الوسط (2 -- لسم 3) في جلد ظهره. إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام القطن مسحات يميل لوقف النزيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعكس عضلات العمود الفقري لفضح الفقرات القطنية الكامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح شرائح L3 - S1 الشوكي عن طريق الحق من جانب ونصفي الثقب باستخدام rongeurs الصغيرة. يتم إنشاء الثقب الجزئي تعريض 4-6 شرائح من الحبل الشوكي القطنية والعجزية بواسطة إزالة الجزء الأيمن من فقرات الظهرية L5 على مستوى قمة الحرقفي في الورك (موقع DRG L5) rostrally إلى فقرات L2 (2 الفقرات الذيلية للضلع الماضي). يروي تجويف بمحلول معقم رينغر الدافئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موقف الحيوان على وسادة الدعم (تدحرجت الشاش والقطن) إلى تسطيح العمود الفقري. تراجع استخدام السنانير لتوسيع منطقة مكشوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند هذه النقطة (حوالي 30 دقيقة بعد حقن المخدر IP الأول ، ينبغي حقن ملحق (0.5X) تحت الجلد وذلك للحفاظ على الحيوانات تخدير كامل. التخدير بدلا من الغاز ، (2-4 ٪ isoflurane في الأكسجين 0.5L/min ) يمكن استخدامها لتخدير المتكررة أثناء جلسات التصوير وقتا أطول من 1 ساعة. </li></ol> 3. بضع الجذور / سحق الظهرية جذر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل إلى الإثارة مضان لتصور YFP المسمى (+) المحاور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض من إبرة (26ga.) الفرعية Q ، إجراء شق صغير في الجافية المغطي الجذر L5 الظهرية (DR). يروي مرارا مع حل رينغر ونظيفة بلطف مع مسحات القطن ذات الرؤوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع لابد من سحقهم وإدراج جانب واحد من ملقط غرامة (دومون # 5) subdurally. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق ملقط بلطف ولكن بحزم ، وعقد جزء من الجذر الإنسي L5 لمدة 10 ثوان ، ثم حرر بلطف ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرارا مع حل الفسيولوجية ونظيفة بلطف مع مسحات القطن ذات الرؤوس. </li></ol> 4. الحصول على الصور والاجراءات بعد العملية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور متعددة من المنطقة كلها بما في ذلك تعرض موقع وسحق DREZ قبل وبعد سحق الحق في كل من التكبير المنخفضة والعالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم الحصول على الصور لقطات إما واحد أو في تيارات متعددة من 10 إلى 20 لقطة المكتسبة في غضون 30 -- لزمن التعرض 40 مللي. ويتم اختيار ثم التركيز في الصور ، ويتم إنشاء المونتاج نظرة عامة في وقت لاحق باستخدام برنامج فوتوشوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحد من تشكيل ندبة ، وتطبيق بإحكام قطعة من الغشاء الرقيق مصفوفة الاصطناعية (Biobrane) ، تليها الجافية الاصطناعي ، وعلى رأس الحبل الشوكي المكشوفة. يجب التأكد من قطع القطع لتناسب بالضبط في إطار يتعرض الحبل الشوكي بحيث تكون ملتصقة إلى الحبل الشوكي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق الجهاز العضلي مع الغرز 5-0 معقمة وإغلاق شق خط الوسط مع مقاطع الجرح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن محلول رينغر (0.3 إلى 0.5 مل ، تحت الجلد) ، وإدارة البوبرينورفين وتسكين بعد العملية الجراحية (0.05 ملغ / كلغ) تحت الجلد كل 12 ساعة لمدة 2 ايام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابقاء الحيوانات على لوحة التدفئة (34 درجة -35 درجة مئوية) حتى استردادها. </li></ol> 5. التصوير المتكرر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الحيوانات وإزالة مقاطع الجرح والغرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الجافية الاصطناعي ورقيقة الغشاء مصفوفة بقع الاصطناعية والاحتفاظ بها في أنبوب يحتوي على محلول معقم رينغر لإعادة استخدامها في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بلطف أي النسيج الضام المتراكمة ندبة مع طرف عازمة إبرة الفرعية س ملقط والغرامة. يروي كثير من الأحيان مع حل رينغر الدافئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة فضح مجال المنطوق ، بما في ذلك موقع وسحق DREZ ، نقل YFP + المحاوير المصورة في الدورات السابقة ، وكرر الإجراءات المذكورة في القسم 4. </li></ol> 6. ممثل النتائج : وقد لاحظنا أنه ، في حين أنهم لم تتجدد بعد إصابة transection ، وتقريبا جميع المحاور + YFP نمت من خلال موقعاصابة بواقع 3 أيام بعد سحق (الشكل 1) 11. عادة ، في اليوم التالي بعد سحق لاحظنا يموتون الظهير تنكس المحاوير جدعة الداني والتفتيت / تنكس من نفس المحاور البعيدة للسحق ، الذي أكد أنه قد تم المحاوير التالفة بشكل مناسب (على سبيل المثال ، الشكل 1 ؛ يوم 3 و 5) . وتطبق معايير إضافية للتمييز بين عدة محاور بشكل لا لبس فيه من تجديد المحاور التي كانت بمنأى أو قد تعافى من الاصابة. وشملت هذه ما يلي : (1) محاور تجديد تظهر توسعا في الجزء غير الفلورسنت من YFP + محور عصبي في موقع سحق بسبب تنكس الدانية والقاصية (على النقيض من تضييق الفجوة غير المسماة بسبب السيتوبلازم الفلورسنت إعادة تعبئتها على موقع سحق إذا نجا من الاصابة المحاور) ، (2) تجديد محاور هي أرق بكثير ، وأقل الفلورسنت الزاهية ، وأكثر من متموجة من المحاور التي نجت من الضرر ؛ (3) neurites تجديد هي أرق وأكثر الفلورسنت بشكل خافت من شظايا التحول الفلورسنت من خلال المحاور التي قدموه ، (4) على النقيض من الباقين على قيد الحياة أو يدخر المحاور ، المحاور تجديد تتوقف عند DREZ ؛ و (5) على العكس من الباقين على قيد الحياة أو يدخر المحاور ، المحاور تجديد العقد لا يحمل رانفييه. الشكل 1 يظهر أربعة محاور + YFP سطحية مباشرة بعد سحق (A1 ؛ السهام الملونة). بعد ثلاثة أيام من سحق جميع المحاور four تمديد neurite واحد الذي ينمو من خلال موقع سحق (A2). بعد خمسة أيام من سحق ، neurites تبقى مستقرة وليس هناك أي نمو إضافي من هذه المحاور أو غيرها الداني (A3). وتجديد neurites التي عبرت من خلال موقع سحق ممدود شظايا الفلورسنت أكثر سمكا وأكثر إشراقا بكثير من محور عصبي تحولها (أي أنابيب غمد الليف العصبي) ، وتصل في أقرب وقت DREZ 4 أيام بعد سحق (حوالي 3mm / 2 يوما) 11. وكشف التصوير المتكرر لهذه المحاور ونصائح لهم كل يومين أو ثلاثة أسابيع لاثنين من أكثر (الشكل 2) أنها لا تنمو إلى الأمام أو التراجع ، ولكنها بقيت جامدة. وكان التغيير الوحيد الملحوظ تورم في مهاوي ونصائح من بعض المحاور. تبرهن هذه الملاحظات السريعة من المستغرب بالتالي الشلل والأمراض المزمنة من المحاور في تجديد DREZ. <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 : التصوير المتكرر للL5 المحاوير DR + YFP في موقع سحق الجذرية الظهرية على مدى 5 أيام. وسحق جزء من الجذر الإنسي L5 (رأس السهم الأحمر) ، والتقط في أيام 0 ، 3 ، 5 وبعد سحق. ويضاعف مجال سحق الحق في لوحات (A1 - A3). <img src="/files/ftp_upload/3126/3126fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> وصل التصوير المتكرر من المحاور وصلت إلى أكثر من 20 DREZ يوما بعد يوم سحق الجذر L5 4 ، وثلاثة محاور (الأسهم الملونة) في DREZ : الشكل 2. نصائح من هذه المحاور لا تزال في الموقع نفسه ، ولها مظهر مماثل في دورات لاحقة على التصوير 7 أيام ، 9 ، 13 ، 15 ، و 20. واستخدمت مواقف تلميح محوار النسبي لنصائح الآخرين ومعالم محوار (النجمة) لتحديد حركية محور عصبي بين دورات التصوير.

<ol>
	<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Watching+the+neuromuscular+junction.">Watching the neuromuscular junction.</a> J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).</li><li>Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon+branch+removal+at+developing+synapses+by+axosome+shedding.">Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding.</a> Neuron. 44, 651-661 (2004).</li><li>Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+visualization+of+the+growth+of+pre-+and+postsynaptic+elements+of+neuromuscular+junctions+in+the+mouse.">in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse.</a> J Neurosci. 10, 894-908 (1990).</li><li>Trachtenberg, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+in+vivo+imaging+of+experience-dependent+synaptic+plasticity+in+adult+cortex.">Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex.</a> Nature. 420, 788-794 (2002).</li><li>Pan, F., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+dendritic+spine+development+in+the+mouse+cortex.">Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex.</a> Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).</li><li>Grutzendler, J., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+synaptic+plasticity+and+pathology+in+the+living+mouse+brain.">Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain.</a> NeuroRx. 3, 489-496 (2006).</li><li>Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+axonal+degeneration+and+regeneration+in+the+injured+spinal+cord.">in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord.</a> Nat Med. 11, 572-577 (2005).</li><li>Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+single+axons+in+the+mouse+spinal+cord.">in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord.</a> Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).</li><li>Davalos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+in+vivo+imaging+of+densely+populated+glia,+axons+and+blood+vessels+in+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy.">Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).</li><li>Maio, D. D. i. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+vivo+imaging+of+dorsal+root+regeneration:+Rapid+immobilization+and+presynaptic+differentiation+at+the+CNS/PNS+border.">in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border.</a> Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التصوير DR التجدد مباشرة في الفئران الحية تحديا من نوع خاص لأنه يتطلب استئصال الصفيحه كبيرة الظهرية لرصد النمو محوار على مساحة واسعة تليها إجراءات متعددة الغازية الجراحية والتخدير في جلسات التصوير لاحقة. وساعدت عدة استراتيجيات للتغلب على هذه التحديات. الأولى ، والت?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> H - خط thy1 YFP (2-4 أشهر من العمر ، أي من الجنسين) </td><td> مختبر جاكسون (بار هاربور ، ME) </td><td> 003782 </td><td></td></tr><tr><td> زيلازين (حقن AnaSed ، محلول معقم) </td><td> مختبرات لويد ، (شيناندواه ، LA) </td><td> 4811 </td><td> 8 ملغ / كغ </td></tr><tr><td> الكيتامين (حقن هيدروكلوريد الكيتامين ، USP) </td><td> هوسبيرا ، وشركة (ليك فورست ، IL) </td><td> 2051 </td><td> 120 ملغ / كغ </td></tr><tr><td> البوبرينورفين (Buprenex حقن) (0.05 ملغ / كلغ) </td><td> ريكيت بينكيزر الصيدلة (رمزها في ريتشموند ، فيرجينيا) </td><td> 7571 </td><td></td></tr><tr><td> الحيوانات الصغيرة كليبرز الشعر </td><td> اوستر الفنية ، (McMinnville ، TN) </td><td> 76059-030 </td><td></td></tr><tr><td> إزالة الشعر محلول </td><td> الكنيسة وشركاه دوايت (برينستون ، نيوجيرسي) </td><td> ناير النفط مع اطفال </td><td></td></tr><tr><td> الشاش الإسفنج </td><td> فيشر العلمية ، (بيتسبرغ ، السلطة الفلسطينية) </td><td> 22-362-173 </td><td></td></tr><tr><td> مسحات القطن ذات الرؤوس </td><td> فيشر العلمية ، (بيتسبرغ ، السلطة الفلسطينية) </td><td> 14-960 ، 3Q </td><td></td></tr><tr><td> 1 مل المحاقن </td><td> بيكتون ، ديكسون وشركة فرانكلين البحيرات ، ونيو جيرسي) </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> تحت الجلد (الفرعية س) الإبر ، 26ga. </td><td> بيكتون ، وشركة ديكسون (فرانكلين البحيرات ، ونيو جيرسي) </td><td> 305115 </td><td></td></tr><tr><td> مقص وملقط الربيع </td><td> أدوات العلوم الدقيقة ، (فوستر سيتي ، كاليفورنيا) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2.5 ملم rongeurs المنحني </td><td> أدوات العلوم الدقيقة ، (فوستر سيتي ، كاليفورنيا) </td><td> 16221-14 </td><td></td></tr><tr><td> USP حقن Lactated رينغر </td><td> باء براون الطبية ، وشركة (ايرفين ، كاليفورنيا) </td><td> ببر - L7502 </td><td></td></tr><tr><td> محلول ملحي معقم </td><td> APP الصيدلة ، (شومبرغ ، IL) </td><td> 918610 </td><td></td></tr><tr><td> الغشاء الرقيق مصفوفة الاصطناعية (Biobrane) </td><td> Bertek الصيدلة ، (مورغانتاون ، WV) </td><td> 62794-096-251 </td><td></td></tr><tr><td> الاصطناعي الجافية </td><td> جور يستبعد دورا MVP البديل ، WL غور وشركاه ، و(فلاغستاف ، من الألف إلى الياء) </td><td> 1MVP40 </td><td></td></tr><tr><td> خيوط الحرير 5-0 </td><td> Ethicon ، وشركة (سوميرفيل ، ونيو جيرسي) </td><td> K - 580 </td><td></td></tr><tr><td> مقاطع الجرح </td><td> الكمال -- الترجمة Ets Bruneau (Burnea ، فرنسا) </td><td> A75 </td><td></td></tr><tr><td> فلوري stereomicroscope </td><td> لايكا مايكروسيستمز ، (يتزلا ، ألمانيا) </td><td> MZ16 </td><td></td></tr><tr><td> كاميرا CCD </td><td> هاماماتسو ، (بريدجووتر ، ونيو جيرسي) </td><td> ORCA - Rx2 </td><td></td></tr><tr><td> درجة الحرارة المراقب المالي </td><td> العالم الدقة الثمينة (ساراسوتا ، فلوريدا) </td><td> 1000 ATC </td><td></td></tr><tr><td> Metamorph البرمجيات </td><td> الأجهزة الجزيئية (سانيفيل كاليفورنيا) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> فوتوشوب </td><td> أدوبي سيستمز ، سان خوسيه ، كاليفورنيا </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of dorsal root axons after rhizotomy

والمحاور الرئيسية الحسية أصيب إصابات العمود الفقري تفشل الجذرية على التجدد في النخاع الشوكي ، مما يؤدي إلى الألم المزمن وفقدان الحواس دائم. يتم منع تجديد الظهرية المحاوير (DR) الجذر في النخاع الشوكي في منطقة الجذر دخول الظهرية (DREZ) ، والتفاعل بين الجهاز العصبي المركزي والجهاز العصبي المحيطي. فهمنا من الأحداث الجزيئية والخلوية التي تمنع التجديد في DREZ غير مكتملة ، في جزء منه لأنه قد تم استنتاجها التغيرات المعقدة المرتبطة الاصابة العصبية من يحلل بعد الوفاة. يتم دراسة أفضل العمليات الخلوية الحيوية ، مثل تجديد المحور ، مع التقنيات التي التقاط الأحداث في الوقت الحقيقي مع ملاحظات متعددة من كل حيوان حي. وقد زاد من قدرتنا على رصد الخلايا العصبية في الجسم الحي بسبب متسلسل بشكل كبير على الابتكارات الثورية في علم البصريات والمعدلة وراثيا الماوس. عدة أسطر من الفئران المعدلة وراثيا thy1 - GFP ، الذي وصفت وراثيا مجموعات فرعية من الخلايا العصبية في الألوان الفلورية متميزة ، تسمح تصوير الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي 1. وقد استخدمت هذه الفئران على نطاق واسع في الجسم الحي لتصوير الدماغ والعضلات 2-4 5-7 ، وقدمت أفكارا جديدة في آليات الفسيولوجية التي لا يمكن أن يكون حل تحليلات ثابتة. دراسات التصوير من الخلايا العصبية في النخاع الشوكي الذين يعيشون في الآونة الأخيرة فقط بدأ. يختمن وزملاؤه أثبتت جدواها first عن طريق تتبع المصابين عمود الظهري (DC) مع المحاور واسعة المجال المجهري 8،9. الفوتون متعددة في مجال التصوير المجراة من محاور العاصمة وضعه بعمق ، الدبقية الصغيرة والأوعية الدموية كما تم إنجاز 10. على مدى السنوات القليلة الماضية ، ونحن كان لها السبق في تطبيق المجراة في مجال التصوير لرصد تجديد المحاوير DR باستخدام واسع المجال المجهري وH - خط thy1 YFP الفئران. وقد أدت هذه الدراسات لنا فرضية جديدة حول لماذا يمنعون من المحاور DR تجديد داخل الحبل الشوكي 11. في خط H - YFP من thy1 الفئران ، متوضعة بشكل سطحي متميزة YFP + المحاور ، الذي يسمح برصد محاور عدة في وقت واحد. تعلمنا أن يتم تصوير أفضل محاور DR صوله DREZ في الفقرات القطنية من العمود الفقري في عنق الرحم. في هذا التقرير عدة استراتيجيات وصفنا بأننا وجدنا من المفيد أن أؤكد التصوير ناجحة على المدى الطويل والمتكرر لتجديد المحاوير DR. وتشمل هذه الأساليب التي تقضي على التنبيب المتكررة وانقطاع التنفس ، وتقليل التوتر المصاحب لعملية جراحية وتشكيل ندبة ، والحصول على صور ثابتة بدرجة وضوح عالية دون الضيائية.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy at JoVE.com

Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

و<em&gt; في الجسم الحي</emيوصف&gt; التصوير بروتوكول لرصد المحاور العصبية الحسية الأولية التالية سحق الجذرية الظهرية. إجراءات استخدام واسع الحقل المجهري مضان وthy1 - YFP الفئران المعدلة وراثيا ، والسماح التصوير المتكرر للتجديد لأكثر من 4 سم محور عصبي في الجهاز العصبي المحيطي والتفاعلات محوار مع واجهة للجهاز العصبي المركزي.

يعيش بين محاور التصوير الجذر الظهرية بعد بضع الجذور

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

live-imaging-of-dorsal-root-axons-after-rhizotomy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K Views.  Shriners Hospitals Pediatric Research Center and Department of Anatomy and Cell Biology. و في الجسم الحي التصوير بروتوكول لرصد المحاور العصبية الحسية الأولية التالية سحق الجذرية الظهرية. إجراءات استخدام واسع الحقل المجهري مضان وthy1 - YFP الفئران المعدلة وراثيا ، والسماح التصوير المتكرر للتجديد لأكثر من 4 سم محور عصبي في الجهاز العصبي المح...

Video: Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

مناعي لونين من الظهرية جذر الأنسجة العقد التالي من الإصابات محواري

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

دراسة وراثية من التجديد أكسون مع الكبار الظهرية مثقف الخلايا العصبية العقدة الجذر

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

تصوير لايف من النيكوتين المستحثة اشارة الكالسيوم وناقل عصبي الإصدار جنبا إلى جنب بطني الحصين المحاوير

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

في المختبر نمذجة السرطانية العصبية الغزو: وظهري الجذر العقدة نموذج

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

الظهرية جذر حقن العقدة وظهري الجذر سحق إصابة نموذجا لالحسية أكسون التجديد

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its highly-organized subcellular architecture, we recently developed a new imaging modality, named spectral reflectometry (SpeRe), which enables unprecedented label-free nanoscale imaging of the live myelinated axons in situ. The underlying principle is to obtain nanostructural information by analyzing the reflectance spectrum of the multilayered subcellular structure. In this article, we describe a detailed step-by-step protocol for performing a basic SpeRe imaging of the nervous tissues using a commercial confocal microscopic system, equipped with a white-light laser and a tunable filter. We cover the procedures of sample preparation, acquisition of spectral data, and image processing for obtaining nanostructural information.

Spectral Reflectometric Microscopy on Myelinated Axons In Situ

Here, we present a step-by-step protocol for imaging myelinated axons in a fixed brain slice using a label-free nanoscale imaging technique based on spectral reflectometry.

مجهر ريفليكتوميتريك الطيفية على محاور عصبية ميليناتيد في الموقع

In a mammalian nervous system, myelin provides an electrical insulation by enwrapping the axon fibers in a multilayered spiral. Inspired by its ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

العزلة السريعة للضامة الجذرية الدجورة

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

In Vitro Myelination of Peripheral Axons in a Coculture of Rat Dorsal Root Ganglion Explants and Schwann Cells

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, neurons and Schwann cells engage in a complex interaction to control the myelination of axons. Disturbances of this interaction and breakdown of the myelin sheath are hallmarks of inflammatory neuropathies and occur secondarily in neurodegenerative disorders. Here, we present a coculture model of dorsal root ganglion explants and Schwann cells, which develops a robust myelination of peripheral axons to investigate the process of myelination in the peripheral nervous system, study axon-Schwann cell interactions, and evaluate the potential effects of therapeutic agents on each cell type separately. Methodologically, dorsal root ganglions of embryonic rats (E13.5) were harvested, dissociated from their surrounding tissue, and cultured as whole explants for 3 days. Schwann cells were isolated from 3-week-old adult rats, and sciatic nerves were enzymatically digested. The resulting Schwann cells were purified by magnetic-activated cell sorting and cultured under neuregulin and forskolin-enriched conditions. After 3 days of dorsal root ganglion explant culture, 30,000 Schwann cells were added to one dorsal root ganglion explant in a medium containing ascorbic acid. The first signs of myelination were detected on day 10 of coculture, through scattered signals for myelin basic protein in immunocytochemical staining. From day 14 onward, myelin sheaths were formed and propagated along the axons. Myelination can be quantified by myelin basic protein staining as a ratio of the myelination area and axon area, to account for the differences in axonal density. This model provides experimental opportunities to study various aspects of peripheral myelination in vitro, which is crucial for understanding the pathology of and possible treatment opportunities for demyelination and neurodegeneration in inflammatory and neurodegenerative diseases of the peripheral nervous system.

In the coculture system of dorsal root ganglia and Schwann cells, myelination of the peripheral nervous system can be studied. This model provides experimental opportunities to observe and quantify peripheral myelination and to study the effects of compounds of interest on the myelin sheath.

الميالين في المختبر للمحاور المحيطية في زراعة مشتركة لنباتات العقدة الجذرية الظهرية للفئران وخلايا شوان

The process of myelination is essential to enable rapid and sufficient signal transduction in the nervous system. In the peripheral nervous system, ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

إثراء مزارع الخلايا العصبية للعقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ عن طريق التحفيز المناعي

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...