Vorremmo ringraziare Andrea Tedeschi per un aiuto nel fissare gli esperimenti ChIP iniziale in laboratorio e Ricco Lindner per il suo contributo per mettere a punto le condizioni per la ChIP. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Hertie; Grant Fortuna, Università di Tuebingen, e la DFG DI concede 1497/1-1 (tutti concessi a Simone Di Giovanni).

1. Sciatico e dorsale della colonna lesioni nervose <ol><li> L&#39;animale è posto su un asciugamano chirurgico e sotto un thermopad è presente in tutto il procedimento mantenendo la temperatura del corpo del mouse a 37 ° C. Tutti gli animali sono anestetizzati per l&#39;intervento chirurgico con un continuo isoflurano / O 2 amministrazione. Gli strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima della procedura. </li><li> Per lesioni sciatico, sia posteriori sono accuratamente rasata, e depilazione si completa con Epilatore generico prima di pulizia della pelle con l&#39;alcool seguita da Betadyne 3 volte. </li><li> Il nervo sciatico è esposta facendo una incisione 4 millimetri posteriore e parallelo al femore a metà coscia attraverso la pelle e diffondendo i muscoli a parte del bicipite femorale con una pinza sottile. </li><li> Il nervo sciatico è esposta poi ferito, e la pelle è chiusa con due clip sutura. </li></ol> NOTA: La stessa incisione è fatta per esporre il nervo sciatico, ma la ferita viene suturata chiuso lasciando intatto il nervo per l&#39;infortunio farsa. <ol start="5"><li> Per lesioni della colonna dorsale, la parte posteriore del mouse è accuratamente rasata, e depilazione si completa con Epilatore generico prima pulizia della pelle con l&#39;alcool spray / swipe. </li><li> Il midollo spinale è esposto facendo una incisione 2,5 cm circa T7 a T13. La pelle è allargate, e il tessuto connettivo viene rimosso lungo la vertebra da T9 a T11. </li><li> Un laminectomia viene eseguita a livello T10 </li></ol> NOTA: Per la maggior parte degli esperimenti, la laminectomia è considerato l&#39;infortunio Sham. <ol start="8"><li> Alcune gocce di xylocaina vengono aggiunti al tessuto per anestetizzare il cavo, e la dura madre viene rimosso, facendo attenzione a non toccare il midollo spinale. </li><li> Le colonne dorsali sono feriti e il muscolo viene suturata vicino, sempre facendo attenzione a non toccare il midollo spinale. Infine, la pelle viene suturata chiusa con clip sutura. Buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo) deve essere somministrato due volte al giorno per 48 ore o fino a quando non più necessari. </li></ol> 2. Cross-linking <ol><li> Sezionare DRG L4 e L5 di topo ferito dopo euthanization. Raccogliere un totale di 16 DRG in ghiacciato HBSS + cocktail di inibitori della proteasi (2 feriti e 2 farsa DRG da ciascun animale, per un totale di 4 animali). </li><li> Centrifugare brevemente il DRG, poi rimuovere con attenzione i HBSS e aggiungere 500 microlitri di 1% di formaldeide in PBS + cocktail di inibitori della proteasi e incubare il campione per 30 minuti a 37 ° C. </li></ol> PUNTO CRITICO. Usa fresca, formaldeide grado di biologia molecolare. <ol start="3"><li> Aggiungere 125 mM di glicina per fermare la fissazione e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> In breve centrifuga, aspirare il tampone, e lavare il tessuto due volte con 500 microlitri ghiaccio PBS freddo cocktail + inibitori della proteasi. </li></ol> 3. Nuclei di preparazione e taglio della cromatina <ol><li> Aspirare off PBS, aggiungere 400 ml di tampone di lisi SDS, il trasferimento di un pre-raffreddata provetta, e distruggere il tessuto con circa 30 colpi con la micropestle. </li></ol> PUNTO CRITICO. Lisi e la rottura del tessuto sono vitali per una buona resa della cromatina reticolato. <ol start="2"><li> Sonicare il campione con 8 impulsi, 10 secondi ciascuna al 70% di uscita (Bandelin, Sonoplus GM70). </li></ol> ATTENZIONE. Il taglio della cromatina deve essere ottimizzato per il vostro sonicazione particolare istituiscono e la frammentazione propria della cromatina devono essere controllati prima di eseguire l&#39;esperimento IP effettivo (vedi sezione 3). NOTA. Frammentazione della cromatina può essere eseguita anche micrococcal nucleasi (MNase) digestione. Come regola generale, la frammentazione mediante ultrasuoni è preferibile per il tessuto fisso, mentre la digestione MNase è favorito per immunoprecipitazione della cromatina natale dei tessuti. Reticolato, cromatina tranciati possono essere conservati a -80 ° C per un massimo di 2 mesi, ma evitare ripetuti cicli gelo / disgelo. 4. Analisi di digestione della cromatina (consigliato) <ol><li> 10 ml di rimuovere il campione cromatina tranciati per l&#39;analisi. Aggiungere 200 mM di NaCl al campione e invertire il cross-link di incubazione a 65 ° C per 2 ore. </li><li> Purificare DNA (vedi paragrafo 8) ed eseguire un gel di agarosio all&#39;1%. DNA dovrebbe essere frammentato per una lunghezza di circa 200-1000 bp (Figura 1). </li></ol> ATTENZIONE. Eccessiva frammentazione della cromatina può portare alla diminuzione del segnale, mentre la frammentazione incompleta porterà a risoluzione ridotta e lo sfondo aumentata. 5. Immunoprecipitazione <ol><li> Determinare il numero di reazioni di immunoprecipitazione (vedi nota sotto), e si dividono equamente in campioni di nuovi tubi. Portare il volume di ognifino a 500 microlitri di buffer di ChIP + cocktail di inibitori della proteasi. </li><li> Prelevare 5 ml di campione diluito e il tuo trasferimento in un nuovo tubo. Questo è il vostro esempio l&#39;ingresso 1% e sarà conservato a -20 ° C fino al momento (sezione 7). </li><li> Per ogni immunoprecipitazione, aggiungere anticorpi appropriati o normale controllo IgG e incubare a ° C per una notte con rotazione 4. </li></ol> NOTA. Nel determinare il numero di immunoprecipitazione, un controllo positivo (ad esempio anticorpi istone H3) e un controllo negativo (Normale IgG) dovrebbe essere considerato. La quantità di anticorpi utilizzati per ogni IP varia tra gli anticorpi e deve essere empiricamente determinato. Tuttavia, è di solito entro un range di 2-10? G / immunoprecipitazione. <ol start="4"><li> Per la tua immunoprecipitato anticorpi / proteine ​​/ DNA complesso, aggiungere 30 ml di perline proteina ChIP Grado G magnetica e incubare per 2 ore a 4 ° C con rotazione. </li></ol> 6. Lavaggio <ol><li> Di pull-down legato cromatina-tallone complesso, posizionare il tubo sul sostegno magnetico. Attendere che la soluzione è chiara e poi rimuovere con attenzione il tuo supernatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di lavare iposodica (buffer ChIP) ai talloni e incubare a 4 ° C per 3-5 minuti con la rotazione, poi a tendina perline e aspirare fuori lavare come al punto 6.1. Ripetere questo passaggio per un totale di 3 lavaggi. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di lavaggio ad alta sale (ChIP di buffer + 350 mM NaCl) ai talloni e incubare per 3-5 minuti con la rotazione, poi a tendina perline e aspirare fuori lavare come al punto 6.1. </li></ol> 7. Eluizione e l&#39;inversione del cross-linking <ol><li> Prendete il vostro campioni di ingresso fuori dal -20 ° C, aggiungere 150 ml di tampone di eluizione ChIP e mettere da parte a temperatura ambiente fino a Passo 7.5. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone 1x eluizione ChIP per ogni campione IP dal punto 6.3. </li><li> Collocare le provette in un Thermomixer ed eluire la cromatina dal perline incubando i campioni a 65 ° C per 30 minuti con vortexando gentilmente. </li><li> Pull-down perline sul sostegno magnetico, e con attenzione il trasferimento della cromatina eluiti (surnatante) in nuovi tubi. </li><li> Per tutti i tubi, tra cui i campioni di ingresso, aggiungere 200mm di NaCl e 40 mcg / reazione di proteinasi K e incubare a 65 ° C per 2 ore. </li></ol> NOTA. Il passo eluizione può essere effettuata a temperatura ambiente, anche, ma potrebbe non essere così efficiente. 8. DNA di recupero <ol><li> Aggiungere 1 volume di fenolo cloroformio / i vostri campioni dal punto 7.5 e vortex per 30 secondi. </li><li> Centrifugare alla massima velocità in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Con attenzione recuperare il acquosa (superiore) in fase di nuovi tubi, aggiungere 1 volume di cloroformio alla fase acquosa, e vortex per 30 secondi. </li><li> Centrifugare alla massima velocità in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Con attenzione recuperare il acquosa (superiore) in fase di nuovi tubi, quindi aggiungere 300 mm di NaOAc, 20 mg / reazione di glicogeno, e 2,5 volumi di etanolo ghiacciato del 100%. </li></ol> ATTENZIONE. L&#39;aggiunta di un vettore, come il glicogeno, è necessario per migliorare la precipitazione di frammenti di DNA relativamente piccole dimensioni. <ol start="6"><li> Incubare a -80 ° C per 2 ore al DNA precipitato. </li></ol> NOTA. Precipitazione Il passo può essere eseguita anche durante la notte a -20 ° C. <ol start="7"><li> Centrifugare i campioni alla massima velocità in una microcentrifuga per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con cura il supernatante e lavare il pellet di DNA precipitato con 300 ml di ghiacciata etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare i campioni alla massima velocità in una microcentrifuga per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere con cura il più possibile sovranatante e lasciare che il pellet asciugare all&#39;aria. </li><li> Risospendere in 20 ml di sterili H 2 O. I campioni sono ora pronti per la PCR, o il DNA può essere conservato a -20 ° C. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati Un risultato rappresentativo di un esperimento di ChIP DRG seguente lesione sciatico è dimostrato (figure 1 e 2). In primo luogo, mostriamo DNA frammentato per una lunghezza di circa 200-1000 bp (Figura 1). In secondo luogo, dimostrare un segnale ChIP seguenti PCR dal promotore prossimale della crescita associati proteina-43 (GAP-43) solo su lesioni del nervo sciatico (corsia 4, figura 2, 5 &#39;). Nessun segnale di PCR è presente quando l&#39;animale riceve una lesione farsa solo (corsia 3), e durante l&#39;uso normale IgG sieriche per l&#39;IP (corsia 5 e 6). Per verificare la specificità dell&#39;anticorpo, abbiamo analizzato i campioni di DNA stesso, ma ha utilizzato un set di primer di controllo che rileva una regione nel 3&#39;-UTR del nostro gene di interesse in cui è prevista alcuna occupazione. Segnali di PCR sono assenti da tutte le corsie (corsie 3-6, Figura 2, 3 &#39;), ad eccezione del segnale di ingresso, che rappresenta non IP campioni di DNA di serie controlli PCR (corsie 1-2, Figure 2). Questa procedura ChIP può essere eseguita in seguito sia sciatico o lesioni della colonna vertebrale dorsale come riassunto in uno schema (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Gel di agarosio invertito reticolato del DNA che è stato tranciato da sonicazione alla gamma di lunghezze proprio frammento. <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Semi-quantitativa dei risultati della PCR da tessuto DRG dopo lesione del nervo sciatico dimostrando che p53 acetilata lega al GAP-43 regione del promotore prossimale 48 ore dopo la lesione al nervo sciatico. Controllo PCR dallo spettacolo stesso tessuto DRG che p53 acetilata non si lega ad una regione di controllo del DNA si trova nella regione 3&#39;-non tradotta (UTR) del gene della GAP-43 (S = Sham, I = feriti). <img src="/files/ftp_upload/2803/2803fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Uno schema generale che indica la posizione dei siti di lesione del nervo sciatico, e la colonna dorsale.

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	<li>Beirowski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+analysis+of+Wallerian+degeneration+using+restricted+axonal+labelling+in+YFP-H+mice.">Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).</li><li>Carey, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).</li><li>Dahl, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+micro+chromatin+immunoprecipitation+assay+(&amp;mu;ChIP.">A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (&amp;mu;ChIP.</a> Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).</li><li>Haring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation:+optimization,+quantitative+analysis+and+data+normalization.+Plant+Methods.">Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods.</a> 11, 3-11 (2007).</li><li>Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neuronal+chromatin+from+brain+tissue.">Isolation of neuronal chromatin from brain tissue.</a> BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).</li><li>Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+neural+stem+cells+from+the+postnatal+cerebellum.">Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum.</a> Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).</li><li>Makwana, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+in+successful+peripheral+regeneration.">Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration.</a> Febs J. 272, 2628-2638 (2005).</li><li>Tedeschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+p53-CBP/p300+transcription+module+is+required+for+GAP-43+expression,+axon+outgrowth,+and+regeneration.">A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration.</a> Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).</li><li>Teng, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regeneration+in+adult+CNS+neurons--signaling+molecules+and+pathways.">Axonal regeneration in adult CNS neurons--signaling molecules and pathways.</a> J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questo protocollo fornisce un metodo per chiedere direttamente sull&#39;ambiente cromatina durante la rigenerazione assonale nel sistema nervoso adulto seguenti danno assonale. Incorpora il modello DRG lesioni con immunoprecipitazione della cromatina per sondare l&#39;ambiente trascrizionali ed epigenetici successive a lesioni sia alla PNS e CNS. E &#39;particolarmente utile per gli investigatori che vogliono caratterizzare putativi siti di legame per il loro fattore di trascrizione preferiti, e per determinare se l&#39...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> ChIP Buffer 10x </td><td> Cell Signaling </td><td> 7008 </td></tr><tr><td> 2x ChIP Elution Buffer </td><td> Cell Signaling </td><td> 7009 </td></tr><tr><td> ChIP grado proteina G Beads Magnetic </td><td> Cell Signaling </td><td> 9006 </td></tr><tr><td> Grip Rack Magna (8 bene) </td><td> Millipore </td><td> 20-400 </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> MERCK </td><td> ONU 1888 </td></tr><tr><td> 37% di formaldeide </td><td> ROTH </td><td> CP10.1 </td></tr><tr><td> 10x Glycine Soluzione </td><td> Cell Signaling </td><td> 7005 </td></tr><tr><td> Glicogeno </td><td> Sigma </td><td> G1767 </td></tr><tr><td> HBSS 10x </td><td> Gibco </td><td> 14185 </td></tr><tr><td> Istone H3 anticorpi (coniglio) </td><td> Cell Signaling </td><td> 2650 </td></tr><tr><td> Normale coniglio IgG </td><td> Cell Signaling </td><td> 2729 </td></tr><tr><td> Fenolo / cloroformio / alcool isoamilico </td><td> ROTH </td><td> A156.1 </td></tr><tr><td> Inibitori della proteasi Cocktail compresse </td><td> Roche </td><td> 04 693 116 001 </td></tr><tr><td> Proteinasi K (20 mg / ml) </td><td> Cell Signaling </td><td> 10012 </td></tr><tr><td> SDS Lysis Buffer </td><td> Upstate </td><td> 20-163 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><th> Attrezzatura necessaria </th></tr><tr><td> Ultrasuoni </td></tr><tr><td> Micropestle </td></tr><tr><td> Microcentrifuga </td></tr><tr><td> Thermomixer </td></tr></tbody></table>

chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury

Assoni nel sistema nervoso centrale (SNC), non si rigenerano, mentre quelli del sistema nervoso periferico (PNS) si rigenerano in misura limitata dopo l&#39;infortunio (Teng et al., 2006). Si riconosce che i programmi trascrizionali essenziali per la crescita dei neuriti e assonale vengono riattivati ​​su lesioni in PNS (Makwana et al., 2005). Tuttavia gli strumenti disponibili per analizzare regolazione neuronale gene in vivo sono limitati e spesso difficile. Gangli delle radici dorsali (DRG) offrono un ottimo sistema modello lesioni perché sia ​​il SNC e SNP sono innervate da un assone biforcata provenienti dal soma stesso. I gangli rappresentano una discreta collezione di corpi cellulari in cui tutti gli eventi trascrizionali si verificano, fornendo così una regione ben definita di attività trascrizionale che possono essere facilmente riproducibile e rimosso dall&#39;animale. Lesioni delle fibre nervose nel PNS (es. nervo sciatico), dove la rigenerazione assonale si verifica, dovrebbe rivelare un insieme di programmi trascrizionali che sono distinti da quelli rispondendo a un infortunio simile nel sistema nervoso centrale, in cui la rigenerazione non avviene (per esempio il midollo spinale ). Siti di legame per il fattore di trascrizione, modificazione degli istoni e DNA derivati ​​da lesioni al sistema nervoso centrale sia PNS o possono essere caratterizzati con immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Qui, descriviamo un protocollo ChIP utilizzando tessuti fissati DRG del mouse seguente danno assonale. Questa potente combinazione fornisce un mezzo per caratterizzare la pro-ambiente di rigenerazione cromatina necessario per promuovere la rigenerazione assonale.

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Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Vi presentiamo un metodo per immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale. L&#39;approccio può essere utilizzata per identificare specifici siti di legame fattore di trascrizione e di importanti modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA per la rigenerazione degli assoni danneggiati sia nel sistema nervoso periferico e centrale.

Immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

chromatin-immunoprecipitation-from-dorsal-root-ganglia-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K Views.  University of Tuebingen. Vi presentiamo un metodo per immunoprecipitazione della cromatina dal tessuto dei gangli dorsali seguenti danno assonale. L'approccio può essere utilizzata per identificare specifici siti di legame fattore di trascrizione e di importanti modificazioni epigenetiche degli istoni e del DNA per la rigenerazione degli assoni danneggiati sia nel sistema nervoso periferico e centrale.

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Live Imaging of Dorsal Root Axons after Rhizotomy

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. Regeneration of dorsal root (DR) axons into spinal cord is prevented at the dorsal root entry zone (DREZ), the interface between the CNS and PNS. Our understanding of the molecular and cellular events that prevent regeneration at DREZ is incomplete, in part because complex changes associated with nerve injury have been deduced from postmortem analyses. Dynamic cellular processes, such as axon regeneration, are best studied with techniques that capture real-time events with multiple observations of each living animal. Our ability to monitor neurons serially in vivo has increased dramatically owing to revolutionary innovations in optics and mouse transgenics. Several lines of thy1-GFP transgenic mice, in which subsets of neurons are genetically labeled in distinct fluorescent colors, permit individual neurons to be imaged in vivo1. These mice have been used extensively for in vivo imaging of muscle2-4 and brain5-7, and have provided novel insights into physiological mechanisms that static analyses could not have resolved. Imaging studies of neurons in living spinal cord have only recently begun. Lichtman and his colleagues first demonstrated their feasibility by tracking injured dorsal column (DC) axons with wide-field microscopy8,9. Multi-photon in vivo imaging of deeply positioned DC axons, microglia and blood vessels has also been accomplished10. Over the last few years, we have pioneered in applying in vivo imaging to monitor regeneration of DR axons using wide-field microscopy and H line of thy1-YFP mice. These studies have led us to a novel hypothesis about why DR axons are prevented from regenerating within the spinal cord11.
In H line of thy1-YFP mice, distinct YFP+ axons are superficially positioned, which allows several axons to be monitored simultaneously. We have learned that DR axons arriving at DREZ are better imaged in lumbar than in cervical spinal cord. In the present report we describe several strategies that we have found useful to assure successful long-term and repeated imaging of regenerating DR axons. These include methods that eliminate repeated intubation and respiratory interruption, minimize surgery-associated stress and scar formation, and acquire stable images at high resolution without phototoxicity.

An in vivo imaging protocol to monitor primary sensory axons following dorsal root crush is described. The procedures utilize wide-field fluorescence microscopy and thy1-YFP transgenic mice, and permit repeated imaging of axon regeneration over 4 cm in the PNS and axon interactions with the interface of the CNS.

Imaging in diretta degli assoni spinali dopo rizotomia

The primary sensory axons injured by spinal root injuries fail to regenerate into the spinal cord, leading to chronic pain and permanent sensory loss. ...

Ricerca

Neuroscienze

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Studio genetico della rigenerazione assonale con colture di neuroni adulti Root dorsali gangliari

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. Intra-vital two-photon microscopy enables the study of macrophages and microglia in the spinal cord lesion in the living animal. This can be performed in adult animals with a traumatic injury to the dorsal column. Here, we describe methods for distinguishing macrophages from microglia in the CNS using an irradiation bone marrow chimera to obtain animals in which only macrophages or microglia are labeled with a genetically encoded green fluorescent protein. We also describe a injury model that crushes the dorsal column of the spinal cord, thereby producing a simple, easily accessible, rectangular lesion that is easily visualized in an animal through a laminectomy. Furthermore, we will outline procedures to sequentially image the animals at the anatomical site of injury for the study of cellular interactions during the first few days to weeks after injury.

Two-photon intravital imaging can be used to investigate interactions among different cell types in the spinal cord in their native tissue environment in a bone marrow chimeric animal with a dorsal column traumatic spinal cord crush injury.

Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Traumatic spinal cord injury causes an inflammatory reaction involving blood-derived macrophages and central nervous system (CNS)-resident microglia. ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.

Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.

Estrusione idraulica del midollo spinale e isolamento dei gangli dorsali nei roditori

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Dorsal Root Ganglion Injection and Dorsal Root Crush Injury as a Model for Sensory Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each other anatomically, it is important to identify an appropriate model to use for the study of axon regeneration. By using a suitable model, we can formulate a specific treatment based on the severity of injury, the neuronal cell type of interest, and the desired spinal tract for assessing regeneration. Within the sensory pathway, DRG neurons are responsible for relaying sensory information from the periphery to the CNS. We present here a protocol that uses a DRG injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in the lower cervical spinal cord of an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. As demonstrated using a control virus, AAV5-GFP, we show the effectiveness of a direct DRG injection in transducing DRG neurons and tracing sensory axons into the spinal cord. We also show the effectiveness of the dorsal root crush injury in denervating the forepaw as an injury model for evaluating axon regeneration. Despite the requirement for specialized training to perform this invasive surgical procedure, the protocol is flexible, and potential users can modify many parts to accommodate their experimental requirements. Importantly, it can serve as a foundation for those in search of a suitable animal model for their studies. We believe that this article will help new users to learn the procedure in a very efficient and effective manner.

This protocol presents the use of a dorsal root ganglion (DRG) injection with a viral vector and a concurrent dorsal root crush injury in an adult rat as a model to study sensory axon regeneration. This model is suitable for investigating the use of gene therapy to promote sensory axon regeneration.

Radice dorsale Ganglion iniezione e dorsale radice Lesioni Crush come un modello per sensoriale Axon Regeneration

Achieving axon regeneration after nervous system injury is a challenging task. As different parts of the central nervous system (CNS) differ from each ...

Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral tissues, such as skin, muscle and visceral organs, as well as the spinal dorsal horn of the central nervous system. Sensory neurons transmit somatic sensation, including touch, pain, thermal, and proprioceptive sensations. Therefore, DRG primary cultures are widely used to study the cellular mechanisms of nociception, physiological functions of sensory neurons, and neural development. The cultured neurons can be applied in studies involving electrophysiology, signal transduction, neurotransmitter release, or calcium imaging. With DRG primary cultures, scientists may culture dissociated DRG neurons to monitor biochemical changes in single or multiple cells, overcoming many of the limitations associated with in vivo experiments. Compared to commercially available DRG-hybridoma cell lines or immortalized DRG neuronal cell lines, the composition and properties of the primary cells are much more similar to sensory neurons in tissue. However, due to the limited number of cultured DRG primary cells that can be isolated from a single animal, it is difficult to perform high-throughput screens for drug targeting studies. In the current article, procedures for DRG collection and culture are described. In addition, we demonstrate the treatment of cultured DRG cells with an agonist of neuropeptide FF receptor type 2 (NPFFR2) to induce the release of peptide neurotransmitters (calcitonin gene-related peptide (CRGP) and substance P (SP)).

Dorsal root ganglia (DRG) primary cultures are frequently used to study physiological functions or pathology-related events in sensory neurons. Here, we demonstrate the use of lumbar DRG cultures to detect the release of neurotransmitters after neuropeptide FF receptor type 2 stimulation with a selective agonist.

Isolamento dei gangli di radice dorsale e colture primarie per lo studio del rilascio di neurotrasmettitore

Dorsal root ganglia (DRG) contain cell bodies of sensory neurons. This type of neuron is pseudo-unipolar, with two axons that innervate peripheral ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

Isolamento rapido dei macrofagi di Ganglion dorsale

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Purificazione dei fibroblasti e delle cellule di Schwann dai nervi sensoriali e motori in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Enrichment of Adult Mouse Dorsal Root Ganglia Neuron Cultures by Immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as well as various other cell types. Published culture protocols often refer to whole dissociated DRG cultures as being neuronal, despite the presence of fibroblasts, Schwann cells, macrophages, and lymphocytes. While these whole DRG cultures are sufficient for imaging applications where neurons can be discerned based on morphology or staining, protein or RNA homogenates collected from these cultures are not primarily neuronal in origin. Here, we describe an immunopanning sequence for cultured mouse DRGs. The goal of this method is to enrich DRG cultures for neurons by removing other cell types. Immunopanning refers to a method of removing cell types by adhering antibodies to cell culture dishes. Using these dishes, we can negatively select against and reduce the number of fibroblasts, immune cells, and Schwann cells in culture. This method allows us to increase the percentage of neurons in cultures.

This paper describes an immunopanning protocol for adult mouse dorsal root ganglia. By adhering antibodies to culture plates, we can negatively select and remove non-neuronal cells. We show that the cultures are enriched for neurons using this protocol, allowing for an in-depth study of neuronal responses to manipulation.

Arricchimento di colture di neuroni dei gangli dorsali di topo adulto mediante immunopanning

Dorsal root ganglia (DRGs) are peripheral structures adjacent to the dorsal horn of the spinal cord, which house the cell bodies of sensory neurons as ...