وقد أبرز حدوث زيادة في الأوبئة التي حدثت مؤخراً، مثل فيروس زيكا والإيبولا، الحاجة إلى استجابة أكثر تنسيقاً وسرعة على نطاق عالمي. ولتحقيق ذلك، صممنا وحدة مختبرية مبتكرة وقابلة للتطوير وداخل الوسائط لاستخدامها في المناطق المحدودة الموارد في جميع أنحاء العالم خلال هذه الفاشيات. هنا نقدم لدينا داخل مشروط، قابلة للتوسيع، ومختبرات حاويات الشحن المتنقلة.
وفي الورقة التالية، نقدم نهج BSL-2 و BSL-3 لتشخيص فيروس الأنفلونزا التنفسية. تشخيص فيروس الإنفلونزا السريع بواسطة RCT-PCR. قبل الاستعداد لدخول وحدة المختبرات المثبتة، يجب أن تدرك أنه يجب حساب جميع متطلبات السلامة BSL-2.
وهذا يشمل ارتداء الملابس مع معدات الحماية الشخصية المناسبة، وغسل اليدين، وارتداء القفازات، وإزالة التلوث أي مساحات العمل كنت تخطط لاستخدام. لاحظ، إذا كنت تستخدم التبييض لإزالة التلوث مساحة العمل الخاصة بك واللوازم، يجب عليك أيضا استخدام 70٪ الإيثانول لتنظيف جميع المناطق المعرضة للتبييض، كما يمكن أن تختلط التبييض مع المواد الكيميائية الأخرى في مساحة العمل لخلق أبخرة سامة. تخلص من جميع منتجات التبييض في سلة النفايات الخاصة بها.
كما يتم أخذ عينات من المرضى، يتم نقلها إلى منشأة المختبر من الحقل أو العيادة وتمريرها إلى فني المختبر عن طريق نافذة المرور. لا يمكن فتح هذا الإطار من كلا الجانبين. في نافذة المرور BSL-2، يجب تطهير السطح الخارجي للأنبوب التي تحتوي على عينات بالكامل مع التبييض وتركه وحده للجلوس لمدة دقيقتين.
فتح نافذة التمرير وجمع العينات ليتم تسجيلها. مسح أسفل أي عينات التي لديها بقايا التبييض، ومسح أسفل المناطق الداخلية من نافذة تمرير من خلال مع التبييض، تليها 70٪ حل الإيثانول. إضافة رموز شريطية إلى كل أنبوب عينة، والأنابيب الفارغة الأربعة المخصصة لـ aliquots.
نقل العينات الخاصة بك إلى غطاء التهوية. قم بمسح الباركود على كل أنبوب وتأكد من ظهور معلومات تحديد العينة المناسبة على شاشة النظام المستندة إلى الكمبيوتر اللوحي أو الكمبيوتر المحمول. أكمل عملية التسجيل.
عينة aliquot. مرة واحدة وقد تم تسمية أنابيب الاختبار، واستخدام مجلس الوزراء السلامة البيولوجية من الفئة الثانية المعتمدة والمفككة لأخذ aliquots من العينات. عند أخذ aliquots تأكد من استخدام الماصات الطازجة المعقمة أو المتاح لكل عينة والتخلص منها في حاويات النفايات الخطر الحيوي من أجل تجنب التلوث عبر.
تأكد من أن كل أنبوب مغلق ومغلق بإحكام. الاستفادة من aliquot واحد لكل عينة لاستخراج فوري. تخزين أي aliquots أخرى في الثلاجة للاستخدام في المستقبل.
قبل الانتقال إلى محطة العمل، قم بتنظيف جميع أسطح مساحة العمل والمعدات مع التبييض متبوعاً بمحلول الإيثانول بنسبة 70٪. مرة واحدة وقد تم ونقلت عينات PCR الباركود الخاص بك على نقلها إلى محطة عمل مخصصة لاستخراج. إعداد الخاص بك العازلة AVL الناقل RNA خليط لخطوة تحلل.
يجب الاحتفاظ بالمزيج الرئيسي للعينة والتحلل في درجة حرارة الغرفة. تسمية أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر. تعيين تلميح ماصة إلى 560 ميكروليترس.
تطبيق طرف ماصة نظيفة. إضافة عازلة تحلل إلى كل أنبوب. تجاهل الطرف في حاوية النفايات.
المقبل, خذ الخاص بك PCR aliquot العينة. وضعه في أنبوب عازلة تحلل المعدة المعينة لألكوت واحد، وتكرار هذا لأي عينات إضافية. تجاهل طرف الماصات القديمة وتطبيق طرف ماصة نظيفة.
تطبيق طرف ماصة نظيفة. أضف 140 ميكرولترات من المخزن المؤقت إلى أنبوب التحكم. أغلق كل أنبوب بشكل آمن.
نبض الدوامة لمدة 15 ثانية. كرر مع أي aliquots إضافية أو عينات. ميكروcentيريفوج كل عينة لمدة خمس ثوان.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد 10 دقائق لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب الخاصة بك لإزالة أي قطرات من داخل غطاء كل أنبوب. إضافة 560 ميكرولترات من الإيثانول عينة واحدة.
تغيير الخاص بك ماصة تلميح. كرر مع أي عينات المتبقية أو إضافية. أغلق كل عينة أنبوب بشكل آمن.
نبض الدوامة كل عينة لمدة 15 ثانية. اِفَرِيّرَ العينات لخمس ثواني الحصول على أنبوب جمع 2 ملليلتر نظيفة.
إضافة أعمدة الدوران. تسمية لهم لتتناسب مع العينات الخاصة بك. نقل 630 ميكرولترات من العينة لمطابقة العمود وفقا لذلك.
تأمين القبعات الخاصة بك. الانتقال إلى جهاز الطرد المركزي. توزيع عينات بالتساوي في جهاز الطرد المركزي.
أجهزة الطرد المركزي في 6000 غرام لمدة دقيقة واحدة لإزالة العازلة تحلل. العودة إلى محطة العمل. استبدل أنابيب التجميع الخاصة بك.
إضافة المخزن المؤقت تحلل المتبقية وكرر خطوة الطرد المركزي. تجاهل أنابيب عينة aliquot الأصلية، وبعد ذلك، تخلص من الـ eluate واغسل عمود الدوران مع المخزن المؤقت AW1. كرر هذا الإجراء مع كل عينة أو أي عينات إضافية.
تأمين القبعات على كل عينة والطرد المركزي في ستة ز. كرر مع عازلة غسل الثاني AW2 في 20 غرام. وأخيرا، ضع العمود في أنبوب 1.5 ملليلتر نظيفة.
افتح العمود وأضف 60 ميكروليتر من العازلة AVE. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة والطرد المركزي في ستة غرام لمدة دقيقة واحدة. وقد أصبحت العينة جاهزة الآن لتحليل نظام تحليل الـ PCR.
وبموجب شروط BSL-3، سيبقى البروتوكول التجريبي على حاله، ولكن تدابير السلامة سوف تتخذ سابقة فوق أي شيء آخر. قبل الدخول إلى مختبر BSL-3 ننظر من خلال نافذة شفافة للتأكد من أن تم تأسيس الضغط السلبي في وحدة صندوق القفازات. وسيكون من الواضح أن الضغط السلبي قد ثبت عندما تكون الكرة في الجدار مرئية.
مرة واحدة تم إنشاء الضغط السلبي فتح الباب وأدخل وحدة. اغسل يديك على الفور ثم انتقل إلى قائمة التحقق من معدات الحماية الشخصية. المضي قدما في وضع على معدات الوقاية الشخصية في الترتيب التالي: تحت قفازات، ثوب، أغطية الأحذية، قناع، درع الوجه، الزوج الثاني من القفازات.
بدوره على الجهاز والسماح للضغط في القفازات لتحقيق الاستقرار. استخدام محلول رذاذ التبييض لتطهير جميع المناطق والإمدادات كنت تخطط لاستخدام داخل وخارج صندوق القفازات. تخلص من أي منتجات نفايات التبييض في حاوية التبييض فقط.
استخدام 70٪ من محلول الإيثانول لتنظيف أكثر من أي مناطق حيث تم استخدام التبييض. نقل العينات الخاصة بك عبر نافذة التمرير. كان ينبغي رش العينات بمحلول التبييض وتركها وحدها لمدة دقيقة واحدة على الأقل في التمرير قبل استلامها داخل وحدة BSL-3.
بعد ذلك، تلقي العينات الخاصة بك داخل وحدة BSL-3 وتنظيفها جيدا قبل الشروع في التسجيل ووضع العلامات الخطوة. بمجرد تسجيل العينات وتسمية الأنابيب ، ضع العينات في صندوق القفازات عبر علبة airlock. لا تفتح البابين في وقت واحد.
افتح وأقفل كل باب في خطوتين مختلفتين لاحتياطات السلامة. مرة واحدة وقد تم نقل عينات بأمان إلى الداخل صندوق القفازات، اتبع نفس الخطوات كما سبق وصفها لإنشاء aliquots عينة في صندوق القفازات. مرة واحدة يتم نقل عينات aliquoted العينات إلى حاوية محكم الإغلاق.
رذاذ محلول التبييض داخل صندوق القفازات لإزالة التلوث الأنابيب وجميع الأسطح الأخرى. انتظر خمس دقائق ثم تطبيق 70٪ من محلول الإيثانول لغسل التبييض. بعد إزالة التلوث شامل نقل العينات اللازمة فقط لتحليل PCR لتحلل خطوة إلى الوراء في صندوق القفازات.
في صندوق القفازات تنفيذ فقط خطوة تحلل من إجراء الاستخراج. مرة واحدة قد تم lysed الخلايا، ختم بإحكام قبعات على كل عينة ووضعها في ممر قفل الهواء المضغوط. تطهير صندوق القفازات مرة أخرى مع التبييض تليها 70٪ حل الإيثانول.
نقل العينات خارج علبة القفازات ونقلها إلى محطة العمل للخطوات المتبقية من إجراء الاستخراج. بعد استخراج نقل العينات الخاصة بك إلى نافذة تمرير من خلال لتحليل PCR. بعد إزالة العينات ونقلها، انظف مساحة العمل المختبرية خارج صندوق القفازات.
قبل إزالة معدات الوقاية الشخصية، انتظر حتى تصل دورة الهواء في الوحدة بأمان إلى عدد مناسب من دورات التصفية قبل أن تبدأ في إزالة معدات الوقاية الشخصية. مباشرة بعد إزالة والتخلص من جميع معدات الوقاية الشخصية في حاوية النفايات معدات الوقاية الشخصية، انتقل إلى غسل يديك في بالوعة المختبر بالصابون والماء قبل الخروج من الوحدة. PCR التضخيم والكشف.
إزالة عينات RNA المستخرجة من النافذة التمريرية. إعداد مزيج رئيسي في أنبوب 1.5 ملليلتر مع المكونات التالية لكل المقايسة المستهدفة: الماء، التمهيديات والتحقيقات، وخليط الهجوم، و2X العازلة. دوامة وتدور المزيج الخاص بك الرئيسي، وبعد ذلك، aliquot مزيج سيد في كل من أنابيب الشريط.
أعد مجموعة PCR إلى التخزين في درجات الحرارة الموصى بها بمجرد إعداد المزيج الرئيسي. إضافة العينات إلى كل من أنابيب الشريط باستخدام طرف منفصل بين كل أنبوب الشريط. تدور العينات في 1, 500 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة, وبعد ذلك عينات جاهزة ليتم تحميلها على وحدة PCR في الوقت الحقيقي.
مرة واحدة يتم تحميل العينات على صك PCR، فإنه يأخذ حوالي 90 دقيقة لإكمال تشغيل واحد. في الوقت الحقيقي PCR فحص هو وسيلة حساسة للكشف عن الفيروس قوية. ويمكن رؤية هذا في الجدول المسمى: نتائج تحليل PCR.
قبل جمع النتائج الخاصة بك وترك المختبر، وإزالة معدات الوقاية الشخصية وإزالة التلوث بشكل كاف كل محطة عمل استعدادا للاختبار التشخيص المقبل. نتائج تمثيلية. يتم تمثيل سير العمل في المختبر في الرسم التخطيطي الذي يؤكد على الحماية الشخصية.
ويتم إجراء الاختبار التشخيصي السريع للأنفلونزا عن طريق تحليل RT-PCR. يتكون الإجراء من أربع خطوات رئيسية ويتم تعيين مساحات العمل الفردية لكل مرحلة من مراحل البروتوكول. والهدف من هذا المشروع هو التحقق من صحة منشأة مختبرية جديدة قابلة للنشر السريع، وقد نجحنا في ذلك، فضلا عن تطوير برامج تدريبية للعاملين في المختبرات العاملين في بيئات منخفضة الموارد أثناء الأوبئة وتفشي الأمراض.
