1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد زيلازين - الكيتامين الحل (الكيتامين هو مادة خاضعة للرقابة ، وينبغي الاحتفاظ بسجلات تفصيلية وحلول تخزين في مكان آمن مؤمن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف وتعقيم المعدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد منطقة الجراحة بواسطة المسح مع وكيل العقيم ثم تغطي مع المناشف الورقية المعقمة ، وإعداد micromanipulator. </li></ol> 2. التحضير لزرع الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي معلق الخلايا إلى خلايا تركيز 100000 / ل هاء وعلى الرغم من أن الخلايا المزروعة 250000 فقط في الماوس ، يلزم وجود فائض من الخلايا لأغراض التحميل حقنة (إعداد ما لا يقل عن 300،000 الخلايا في الخلايا المستقبلة الماوس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المراد زرعها 3 مرات في HBSS في قارورة a مخروطية 50 مل. عد الخلايا قبل تدور النهائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الدوران النهائي لأسفل ، وترك HBSS صب في قارورة الموقف رأسا على عقب لمنع قطرات من الوصول إلى بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل الجدران الجافة مع Kimwipe ، المشع للأشعة فوق البنفسجية العقيمة. لا تسمح بيليه لتجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد أنبوب تستقيم ، ببطء وبحذر شديد resuspend الخلايا في نصف النهائي حجم المطلوب من HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس حجم إجمالي pipetting غالبية تعليق في تلميح ماصة ثم ضبط الطلب على pipetter حتى وقف كامل في الطرف ماصة. هذا وسوف اقول لكم كم من HBSS هناك حاجة للتركيز المطلوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليصل حجم المبلغ المطلوب عن طريق إضافة HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان مرة أخرى على الجليد. التحقق من جدوى إذا كانت الخلايا يجب أن يكون على الجليد لفترة أطول من 2 ساعة. </li></ol> 3. اعداد الفئران للجراحة وزرع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق الكيتامين (100mg/kg) وزيلازين (10mg/kg) في جرعات 100 ~ ميكرولتر مخدر أو ما يعادلها. فإن الإجراء بأكمله من الإعدادية جراحية لخياطة تستغرق دقائق 30-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري : تطبيق مرقمة ، الشريط الملون لذيل كل فأر لضمان تحديد الهوية) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق المنطقة الظهرية للفأرة من أسفل الظهر إلى الرقبة ، وتمتد 2 سم الثنائية من خط الوسط ، مع كليبرز الكهربائية. يجب قص الشعر في أقرب وقت ممكن (قد يكون من الضروري أن يذهب فوق المنطقة عدة مرات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة الشعر المتبقي ، وتطبيق طبقة رقيقة من كريم إزالة الشعر (نير) مع شاش يميل قضيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1-2 دقائق ، امسح ناير قبالة بشاش مبلل بالماء والصابون برفق. وينبغي أن تكون المنطقة مستعدة عارية الجلد نظيفة دون أي قطعة من الشعر الضالة التي يمكن أن تحصل في الجرح أثناء إجراء العمليات الجراحية لاحقا. تعقيم المنطقة مستعدة بمحلول يوديد. </li></ol> 4. استئصال الصفيحه <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كثيرا ما تتغير و / أو تعقيم القفازات في جميع أنحاء الداخلي. موقف الجانب الظهري الماوس مع رئيس لافتا إلى اليسار (إذا كنت الحق وسلم). ثنى الحيوانية لضمان العقم ، وأنه لا يتم كشفها في منطقة الحلق. جعل شق عمودي (~ 1.3cm) عبر موقع laminecomy الممتدة من حوالي الفقرات الصدرية T8 و T12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ملقط غريف الذي عقد في اليد اليسرى ، وتأمين بقوة العمود الفقري في T9 (الشكل 1A) ورفع الماوس تصل إلى المبالغة في انحناء العمود الفقري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مشرط ليسجل تقاطع بين T10 T11 و، المسافة بين نتوءات two شائك. كشف مزيد من تقاطع طريق الغاء بعناية بعيدا الطبقة العضلية لفضح العظام (انظر الشكل 1B ، C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم المقص لمزيد من العضلات واضحة بعيدا عن الصفيحة وحول عنيق مع القصاصات الصغيرة. وهذا الانفتاح على مسافة صغيرة بين فقرات. ببطء وبحذر ادخال شفرة واحدة من مقص في هذه الفجوة وقص عنيق. تأكد من وضعه دائما انحناء جانبيا للمقص ، بعيدا عن السلك. كرر على الجانب الآخر. (انظر الشكل 1D ، E) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الصفيحة لفضح قص الحبل وبعناية تشغيله. تأكد من عدم ترك أي شظايا العظام مجانا أو خشنة وراءهم. (انظر الشكل 1F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الحقن ونظيفة بعيدا مع أي دم قطعة قطن معقمة. </li></ol> 5. حقن الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الإبرة مع الجوز إبرة المحقنة إلى هاميلتون وتنظيفها من قبل بيغ عدة مرات بالماء ، ثم الايثانول 70 ٪ ، وأخيرا HBSS. إدراج المكبس بعد كل ملء مع الماء ، والإيثانول 70 ٪ ، أو HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حقنة هاميلتون لتحميل الخلية عن طريق إزالة المكبس وتخفيف الجوز الإبرة وسحب الإبرة بعيدا عن حقنة لمنع الضغط الخلفي. ضمان أن تتم معالجة متأنية للإبر والجوز مع قفازات معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 15μl من الخلايا في تلميح ماصة واضغط على تلميح بإحكام في نهاية الجزء الخلفي من حقنة لتحميل الخلايا في المحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الغواص عن 5mm ثم تشديد الجوز الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الامم المتحدة تخفض الغطاسسمسم وينظر بعض التعليق الخلية تخرج الإبرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من عدم وجود فقاعات في محقنة ووضع حقنة لأسفل في وضع أفقي لمنع الخلايا من صنع التدرج عن طريق الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امساك الماوس laminectomized من العضلات النخاعي الظهرية من العمود الفقري الذي يربط T8 و T9 (الشكل 2B ، C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشبك في مرقئ إلى الذراع الأيسر micromanipulator (العمودي) بحيث الكفوف الماوس ، الأمامية في الهواء ولمس الكفوف الخلفي طفيفة منبرا للمناشف ورقية معقمة كما هو الحال في أرقام 2A و 2B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق المحقنة إلى الذراع micromanipulator اليمين (بزاوية · 70) والشريحة المحقنة إلى أدنى موقف ممكن قبل لقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استقرار الماوس تعلق ذيله ضد المناشف الورقية وانخفاض ببطء المحقنة (2B الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انخفاض الإبرة نحو الحبل وإدراج 1MM إبرة في نصف الكرة الآخر من خلال خط الوسط الظهرية (الشكل 2C). يجب أن رأس الإبرة تكون في المادة الرمادية على مقربة من القناة المركزية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن ببطء 2.5μl من الخلايا. حقن بمعدل 1μl / 5 ثوان. بعد حقن الخلايا ، وانتظر 10 ثانية وسحب الإبرة عشر منعطفا في وقت واحد كل 10 ثانية حتى الإبرة خارج السلك. إيلاء الاهتمام لهروب رأس المال من الممكن تعليق الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع بسرعة المحاقن وسلخه من الذراع micromanipulator. وضع الحقنة باستمرار أفقيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن الماوس ونقل إلى الجدول خياطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 5،7-5،14 لكل الماوس حتى يتم إفراغ الحقنة. تعقيم الأدوات (في جهاز التعقيم) والإبرة (عن طريق المسح مع الايثانول) بين الحيوانات. تجاهل الخلايا وإذا كان تكتل تحديث مرئيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنظيف حقنة كما في الخطوة 5.1 بين الأحمال. </li></ol> 6. الخيوط الجراحية والرعاية بعد العملية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خياطة الفتحة. يتم إدخال إبرة خياطة في اللفافة السطحية على جانبي الشق. هو موتر الخيط من خلال سحب اللفافة السطحية معا (الشكل 3A) ، وتغطي بذلك الحبل الشوكي معرضة في موقع الصفيحة إزالتها. لا خياطة العضلات الجلدي تعلق على الجلد أو العضلات والهيكل العظمي من الظهر. سحب الخيط من خلال كامل ، وترك ما يقرب من 1 / 2 &quot;. استخدام حامل الإبرة ، وشكلت ثلاثة عقدة ، ويتم قطع الصفحات أقرب إلى عقدة ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق شق طريق تطبيق 2-3 المواد الغذائية (اعتمادا على حجم الجرح) على الجلد (الشكل 3B). سحب الجلد بعناية بعيدا عن الماوس لتجنب التدبيس العضلات الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام 26G3 / 8 إبرة حقن قارعو الأجراس Lactated 0.5ml الفرعي cutaneously في أسفل الظهر بعيدا عن الشق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الماوس مرة أخرى في قفصه. لضمان أنها قادرة على التنفس بشكل مريح بينما تحت التخدير ، ويجب وضع الماوس على جانبها في القفص ، وتجنب الاتصال بين الموقع والفراش جراحة القفص. يجب أن توضع على منصات أقفاص التدفئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويتم رصد الفئران بعد التخدير يلبس لضمان تهدأ النزيف ، وخياطة الجروح لا تزال مغلقة ، والعودة إلى أن الفئران قبل الجراحة التنقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الفئران وقت واحد مع البوبرينورفين مسكن (،05-،1 ملغ / كلغ) بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضمان الفئران ضعف وصول كاف في الغذاء والماء : يتم تركيبها مع زجاجات المياه ينبثق 3.5 بوصة طويلة والفئران التي هي غير قادرة على المشي وتغذية المياه اليد و / أو ذات السعرات الحرارية العالية المكملات الغذائية (نوتري ، كال ، Tomlyn). </li></ol> 7. ممثل النتائج : وسوف تكون النتائج المرجوة بسبب عدم تحديدها من هروب رأس المال من خلال تعليق خلية الحقن وظهور سليمة من الحبل الشوكي بعد الإجراء. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم جدا أن يكون الإضاءة الساطعة والمباشر على العمود الفقري الماوس خلال الثقب وخلال الحقن. ومما يسهل الإضاءة الأمثل من خلال الإضاءة الألياف البصرية (الشكل 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1 -- استئصال الصفيحه (أ) بمجرد عقد بقوة فقرة T9 مع ملقط غريف ، (B ، C) درجة في العمود الفقري مع مشرط وبين T10 T11 لتسهيل دخول المقص الصغير. (D) الشريحة بعناية المقص الصغير من خلال المسافة بين T10 T11 و (السهام وأقحم E ،) وقطع السويقات على كل جانب (شرطات ، E) لتحرير الصفيحة الظهرية. (F) اقلب الصفيحة حتى rostrally وقطع تشغيله. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. حقن NSCs (A) والإعداد العام للmicromanipulator مع مرقئ عقد الماوس تعلق على ذراعه اليسرى والمحاقن هاميلتون على ذراعه اليمنى بزاوية 70. (ب) ومرقئ عقد العضلات الظهرية النخاعي من العمود الفقري الذي يربط T8 و T9. (C) هو خفض الإبرة من خلال روكان خط الوسط في المادة الرمادية في نصف الكرة الآخر ، الأقرب إلى القناة المركزية. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="الشكل 3"/> الشكل 3. الغرز وإغلاق الجرح. (أ) تطبق على الخيوط اللفافة السطحية على جانبي الشق. (ب) واقفل شق 2-3 مع المواد الغذائية حسب الحاجة (واحدة أساسية معروضة على الجرح يحتاج 3).

<ol>
	<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+multiple+sclerosis:+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease.">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li><li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+(MHV-4):+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease.">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li><li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li><li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response.">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li><li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , (1992).</li><li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li><li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li><li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury.">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وسوف تنفذ جيدا زرع يتوقف في المقام الأول على استئصال الصفيحه الحذر وحقن الخلايا. في شرك الأولية لتجنب خلال الثقب هو إلحاق أضرار في الحبل الشوكي. وهذا يمكن أن تحدث أثناء العملية نفسها أو الأضرار الناجمة عن شظايا عظام حادة تركوها وراءهم بعد الإجراء. لتجنب هذه ، تأكد من أن نقطة من المقص الصغير منحني تواجه دائما بعيدا عن الحبل وتدرس بعناية laminectomized العمود الفقري لضمان أن يتم مسح جميع شظايا العظام والتي تبقى العمود الفقري لهيكل لا يملك جاحظ علنا ​​أو خشنة الحواف. كما ذكر سابقا ، فإن الكشف عن هروب رأس المال إذا كان من الممكن على ضوء مشرقة زاهية ومباشرة على تعرض النخاع الشوكي أثناء الحقن. هروب رأس المال هو ما سيحدث على الأرجح مع الإبر قياس 30 (مقابل 33 مقياس) وإذا تم حقن بسرعة كبيرة. رغم أن هذا البروتوكول قد أعطانا نتائج جيدة ، وأفاد آخرون ينتظرون فترات طويلة (تصل إلى 5 دقائق) قبل حقن ابرة التراجع 8،9 التالية. أيضا ، والإبر أصغر قياس هي الأفضل ، لكننا لاحظنا أن يتم بسهولة lysed بعض الخلايا عند تمرير عن طريق إبر عيار 33. لتعظيم الكفاءة ، وفريق زرع يحرسون مراكز الأربعة المختلفة (الماوس الإعدادية ، الثقب ، والحقن ، وخيوط) أمر مرغوب فيه. وعلاوة على ذلك ، ينبغي أن يكون الأمثل لتوقيت كل إجراء لتقليل الوقت الخلايا ينتظرون على الجليد. على سبيل المثال ، ونحن لدينا زرع الفئران في مجموعات من أربعة (عدد الجرعات في كل حمولة من الحقنة) ، والشخص حقن الخلايا يبدأ تحميل محقنة بعد laminectomized الماوس الشخص الثالث واعداد الفئران يجب تخدير التالية وقد laminectomized المجموعة بعد الماوس الثانية من المجموعة السابقة. بهذه الطريقة ، يمكننا زرع الخلايا (أو وسائط التحكم) إلى 40 في الفئران نحو 3 ساعات على الرغم من كل الماوس سيستغرق 30-40 دقيقة تقريبا. العلاجات البديلة للخلايا لعلاج بعض اضطرابات الجهاز العصبي المركزي في الوقت الراهن 10 في التجارب السريرية. ليس هناك بديل عن النماذج الحية في زرع مجلس الأمن القومي وبروتوكول لدينا من engraftment NSCs في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين يسببها فيروس يسهل استخدام نموذجا هاما للماجستير ويمكن أيضا أن تتكيف بسهولة مع نماذج أخرى.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف / المعدات </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات (اختياري) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Parmaceuticals الفينيق </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> زيلازين هيدروكلوريد </td><td> النائب Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> ناير </td><td> الكنيسة وشركاه دوايت </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  ميكرولتر هاميلتون الحقنة ث / إزالة الإبرة </td><td> شركة هاملتون </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> إبر هاملتون ، أو 33 G 30G ، ونصف بوصة ، 30 درجة شطبة </td><td> شركة هاملتون </td><td> 7803-077803-05 </td><td> اختبار قابلية خلايا الجسم بعد المرور عبر الإبر لتحديد أفضل مقياس لاستخدام </td></tr><tr><td> المقص الصغير </td><td> العالم آلات دقيقة </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> الملقط الصغيرة غريف </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> التجسيمي </td><td> KOPF الآلات </td><td> نموذج 1772 هولدر العالمي </td><td></td></tr><tr><td> التجسيمي </td><td> KOPF الآلات </td><td> حامل النموذج الكهربائي 1773 </td><td></td></tr><tr><td> التجسيمي </td><td> KOPF الآلات </td><td> نموذج 902 التجسيمي الحيوانات الصغيرة </td><td></td></tr><tr><td> التجسيمي </td><td> KOPF الآلات </td><td> 960 نموذج الناقل الكهربائي اليسار </td><td></td></tr><tr><td> الغرز </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated قارعو الأجراس </td><td> هوسبيرا </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> الدبابيس </td><td> غرامة العلوم </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> مرقئ </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> المشارط ، وأحجام 10،11 </td><td> الصياد </td><td> 268878 ، 268879 </td><td></td></tr><tr><td> الغرز </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> حجم 5-0 ، 3 / 8 &quot;دائرة ، 19mm الإبرة والخيوط مضفر 45cm </td></tr><tr><td> منعكس كليب جرح 7 قضيب </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm مقاطع الجرح ريفلكس </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> أولسن ، Hegar حامل إبرة </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

فئران مصابة بسلالة فيروس موجه للعصب JHM التهاب الكبد الماوس (MHV) وضع النتائج المرضية والسريرية للمرضى مماثلة مع مرض التصلب المتعدد المزيل (MS). وقد أظهرت لنا أن زرع NSCs في النخاع الشوكي للمريض في الفئران النتائج تحسنا كبيرا في كل من وعودة الميالين في نتائج سريرية. العلاجات البديلة للخلايا لعلاج الأمراض العصبية المزمنة أصبحت الآن حقيقة واقعة في النماذج الحية والحيوية في فهم التفاعلات بين الخلايا المضيفة المكروية engrafted والأنسجة. هذا العرض يوفر وسيلة لزرع الخلايا تتكيف في النخاع الشوكي للفئران المصابة JHMV. باختصار ، نحن نقدم لإجراء ط) إعداد NSCs قبل الزرع ، والثاني) قبل العملية الرعاية من الفئران ، والثالث) تعرض الحبل الشوكي من خلال الثقب ، والرابع) من حقن المجسم NSCs ، والرابع) الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية .

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus at JoVE.com

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

هو مفصل في زرع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين المعمول بها. إعداد NSCs ، هي الخطوط العريضة لاستئصال الصفيحه من الفقرات الصدرية 9 (T9) ، وزرع NSCs جنبا إلى جنب مع الرعاية قبل وبعد العملية ، من الفئران.

الجراحية زرع الخلايا الجذعية العصبية الماوس في النخاع الشوكي لفئران مصابة موجه للعصب الماوس فيروس التهاب الكبد

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Views.  University of California, Irvine. هو مفصل في زرع الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) في النخاع الشوكي للفئران مع إزالة الميالين المعمول بها. إعداد NSCs ، هي الخطوط العريضة لاستئصال الصفيحه من الفقرات الصدرية 9 (T9) ، وزرع NSCs جنبا إلى جنب مع الرعاية قبل وبعد العملية ، من الفئران.

Video: Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

العزل والتوسع في الخلايا الجذعية العصبية الكبار باستخدام الفحص Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

ماوس واحدة، واثنين من الثقافات: العزلة وثقافة الكبار الخلايا الجذعية العصبية من المناطق العصبية اثنان من الفئران الفردية

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية البالغة العصبية من المنطقة تحت الثفني ماوس

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

وضع البروتوكول المكرر لزرع الخلايا الظهارية الصبغية الشبكية البشرية ترانس-سكليرال سوبريتينال في عيون الفئران

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

زرع هوموتشرونيك إينتيرنيورون السلائف في أوائل العقول الماوس بعد الولادة

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

العزلة والثقافة من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس العصبية

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

زرع الذرية القشرية الهندسية كيميائياً في عقول الفئران المبكرة بعد الولادة

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

الكشف عن 5-هيدروكسي ميثيل سيتوسين في الخلايا الجذعية العصبية وعقول الفئران

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

التسليم داخل الشرايين للخلايا الجذعية العصبية إلى الدماغ الفئران والفأر: تطبيق على الإقفاري الدماغي

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...