1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Xylazine-קטמין פתרון (קטמין הוא חומר מבוקר. מידע מפורט צריך להישמר ופתרונות מאוחסן במיקום, כספת נעולה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי מחטאים ציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אזור הניתוח על ידי מנגב עם סוכן aseptic ואז מכסה עם מגבת נייר סטרילי, ולהגדיר את micromanipulator. </li></ol> 2. הכנת תאים להשתלה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צריכים להיות resuspended לריכוז של 100,000 תאים / l אלקטרוני, למרות שרק 250,000 תאים מושתלים לכל עכבר, עודף של התאים נדרשת טעינה למטרות מזרק (להכין לפחות 300,000 תאים לכל עכבר קבלת תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף התאים המושתלים להיות 3 פעמים ב HBSS חרוטי בקבוקון 50 מ&quot;ל. ספירת התאים לפני הסיבוב האחרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הספין האחרון למטה, HBSS למזוג ולהשאיר בקבוקון במהופך עמדה כדי למנוע טיפות מלהגיע גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך קירות יבש עם Kimwipe, UV-מוקרן סטרילית. אל תאפשר גלולה להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת שפופרת זקוף, לאט מאוד בעדינות resuspend התאים בנפח חצי הרצוי הסופי של HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הנפח הכולל של pipetting רוב ההשעיה אל קצה פיפטה ואז להתאים את החוגה על pipetter עד ההשעיה כולו בקצה פיפטה. זה יגיד לך כמה HBSS יותר דרוש ריכוז הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו נפח לכמות הרצויה על ידי הוספת HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בחזרה על הקרח. בדיקת הכדאיות של תאים אם הם חייבים להיות על הקרח יותר מ 2 שעות. </li></ol> 3. הכנה של עכברים עבור ניתוח השתלת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר באמצעות זריקה intraperitoneal של קטמין (100mg/kg) ו xylazine (10mg/kg) ב ~ 100 מנות μl או הרדמה המקבילה. ההליך כולו מן הרחצה כדי תפירת ייקח 30-40 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי: להחיל ממוספרים, סרט צבעוני לזנב של עכבר כל כדי להבטיח זיהוי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את האזור הגבי של העכבר מן הגב התחתון אל הצוואר, והארכת 2 ס&quot;מ בין שתי המדינות מ קו האמצע, עם קוצץ חשמלי. השיער צריך לחתוך קרוב ככל האפשר (יתכן שיהיה צורך לעבור על האזור מספר פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר את השיער הנותר, למרוח שכבה דקה של קרם להסרת שיער (Nair) עם גזה היטה המוליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 1-2 דקות, לנגב נאיר את עם גזה הרטובות קלות במי סבון. השטח צריך להיות מוכן עור חשוף ונקי ללא חתיכות תועה של שיער שיכולים להיכנס הפצע במהלך ההליך הכירורגי הבאים. לחטא את האזור עם פתרון מוכן יודיד. </li></ol> 4. Laminectomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעתים קרובות שינוי ו / או לעקר כפפות לאורך כל ההליך. מקם את העכבר בצד הגב עם הראש והצביע שמאלה (אם אתם ימניים). הנח בעלי חיים על מנת להבטיח סטריליות וכי רק את האזור מגולח חשוף. ביצוע חתך אנכי (~ 1.3cm) על אתר laminecomy פורש מ על חוליות בית החזה T8 ל T12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים גרפה החזיק ביד שמאל, בנחישות להבטיח את עמוד השדרה על מילון T9 (איור 1A) ולהרים את העכבר עד להגזים עקמת שדרתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזמל כדי להבקיע את הצומת בין T10 ו T11, את החלל בין שתי בליטות קוצני. יתר על כן לחשוף את צומת בקפידה על ידי מבטל את שכבת השריר משם לחשוף את העצם (ראה איור 1 ב &#39;, ג&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לקדם את השריר ברור הרחק lamina וסביב pedicle עם חיתוכים קטנים. זו תפתח את חלל קטן בין החוליות. לאט לאט ובעדינות להוסיף אחת של להב המספריים לתוך הפער הזה לגזור pedicle. ודא את העקמומיות של המספריים ממוקם תמיד רוחבית, הרחק חוט. חזרי על הפעולה בצד השני. (ראה איור 1D, ה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את lamina לחשוף את כבל ובזהירות לגזור אותו. הקפידו לא להשאיר את כל שברי עצמות חינם או משונן מאחור. (ראה איור 1F) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הזריקה, לנקות דם משם עם צמר גפן סטרילי. </li></ol> 5. הזרקה של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המחט עם אגוז המחט במזרק המילטון לנקות אותם על ידי שטיפה מספר פעמים עם מים, אז 70% אתנול, ו HBSS לבסוף. הכנס הבוכנה לאחר מילוי כל אחד עם מים, אתנול 70%, או HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המזרק המילטון לטעינת התא על ידי הסרת הבוכנה ואת משחררת את אגוז מחט ומושך את המחט מן המזרק כדי למנוע backpressure. ודא כי טיפול זהיר של המחט ואגוזים נעשים עם כפפות סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 15μl של תאים לתוך פיפטה קצה ולחץ בחוזקה את קצה אל הקצה האחורי של המזרק כדי לטעון את התאים לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הבוכנה על 5 מ&quot;מ, ואז להדק את האום מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדכא הבוכנה האו&quot;םtil חלק ההשעיה תא נתפסת היציאה מחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאין בועות במזרק ולהניח את המזרק במצב האופקי כדי למנוע את התאים מפני ביצוע הדרגתי על ידי כוח הכבידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחוז בעכבר laminectomized על ידי השריר spinalis dorsi המחבר את עמוד השדרה של T8 ו T9 (איור 2 ב, ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ hemostat לזרוע (אנכי) שמאל micromanipulator כך רגליו הקדמיות של העכבר נמצאים באוויר רגליו האחוריות נוגע קלות פלטפורמה של מגבות נייר סטרילי כמו דמויות 2A ו 2B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המזרק בזרוע micromanipulator ימינה (בזווית של ° 70) והחלק את המזרק למצב הנמוכה ביותר האפשרית בטרם יבלעו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצב את העכבר על ידי הצמדת זנבו נגד מגבות נייר ולאט לאט להוריד את המזרק (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את המחט לכיוון חוט והכנס את 1mm מחט לתוך חצי הכדור השני דרך קו האמצע הגבי (איור 2C). קצה המחט צריכה להיות בחומר האפור קרוב לתעלה המרכזית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק 2.5μl של תאים. הזרק בשיעור של 1μl / 5 שניות. לאחר הזרקת תאים, להמתין 10 שניות לחזור בו את המחט עשירית סיבוב בכל פעם כל 10 שניות עד שהמחט יוצא של חוט. שימו לב בזרימת אפשרית של השעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסגת במהירות את המזרק ולנתק אותו מן היד micromanipulator. הנח את המזרק אופקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את העכבר ולהעביר אל שולחן התפירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.7-5.14 עבור כל עכבר עד מזרק מרוקנת. לעקר כלים (ב מעקר) ואת המחט (על ידי מנגב עם אתנול) בין בעלי חיים. מחק תאים מחדש אם clumping גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המזרק כמו בשלב 5.1 בין המון. </li></ol> 6. התפרים ואת מנותחות טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפר את החתך. מחט תפר מוכנס לתוך fascia השטחי משני צידי החתך. חוט מתוח היא דרך, מושך fascia השטחית יחד (איור 3A), ובכך מכסה את חוט השדרה חשוף באתר lamina הוסרו. אל תפר את השריר עורית המצורפת עור או שריר השלד של הגב. משוך את החוט כולו דרך, והשאיר כ 1 / 2 &quot;. שימוש מחזיק מחט, שלושה קשרים נוצרים חוט חיתוך קרוב הקשר האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת החתך על ידי יישום 02:58 סיכות (בהתאם לגודל של החתך) על העור (איור 3B). משוך בזהירות העור הרחק העכבר כדי למנוע הידוק השרירים הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש 26G3 / 8 המחט להזריק האצבעות Lactated 0.5ml משנה cutaneously בגב התחתון מן החתך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום העכבר לכלוב שלו. כדי להבטיח זאת הוא מסוגל לנשום בנוחות בזמן הרדמה, העכבר צריך להיות ממוקם בצד שלה בכלוב, הימנעות ממגע בין האתר הניתוח ומצעים כלוב. כלובים צריך להיות ממוקם על כריות חימום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים מנוטרים לאחר הרדמה פגה כדי להבטיח שוך דימום, התפרים נשארים סגורים, עכברים לחזור ניידות ניתוח מראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התייחס עכברים פעם אחת עם עצירות כאבים (0.05-0.1 מ&quot;ג / ק&quot;ג) לאחר הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא עכברים לקויי גישה מספיק אוכל ומים: בקבוקי מים מצוידים 3.5 אינטש פיות המורחבת ועכברים אינם מסוגלים ללכת יד הם האכילו מים ו / או עתירי קלוריות תוסף תזונה (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. נציג תוצאות: התוצאות הרצויות יהיה ניתן לזיהוי על ידי חוסר בזרימת ההשעיה התא במהלך זריקה ועל ידי הופעת שלם של חוט השדרה בעקבות ההליך. לשם כך, חיוני לקיים תאורה בהיר ישירות על עמוד השדרה של העכבר במהלך laminectomy ובמהלך הזריקה. תאורה אופטימליים הוא הקל על ידי תאורה סיבים אופטיים (איור 2 א). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1 - Laminectomy (א) לאחר חוליה T9 מוחזק ביציבות עם מלקחיים גרפה, (B, C) ​​ציון את עמוד השדרה עם האיזמל בין T10 ו T11 כדי להקל על כניסתם של המספריים מיקרו.. (ד) להחליק בזהירות את המספריים מיקרו בחלל שבין T10 ו T11 (החצים הבלעה, E) לחתוך את pedicles בכל צד (מקפים, E) לשחרר את lamina הגבי. (F) תהפכו את lamina עד rostrally ולנתק אותה. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. הזרקת NSCs. (א) ההגדרה הכללית של micromanipulator עם hemostat שמחזיק את העכבר מחובר בזרוע שמאל את המזרק המילטון על זרוע ימין בזווית של 70. (ב) hemostat להחזיק את השריר spinalis dorsi המחבר את עמוד השדרה של T8 ו T9. (ג) הוא הוריד את המחט דרך tהוא קו האמצע אל החומר האפור על הכדור השני, הפרוקסימלי לתעלה המרכזית. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3. Sutures וסגירת הפצע. (א) Sutures מוחלים fascia השטחי משני צידי החתך. (ב) החתך נסגר עם סיכות 2-3 לפי הצורך (אחד מצרך המוצג פצע צורך 3).

<ol>
	<li>Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronavirus+infection+of+the+central+nervous+system:+host-virus+stand-off.">Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off.</a> Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).</li><li>Weiner, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenge+of+multiple+sclerosis:+how+do+we+cure+a+chronic+heterogeneous+disease.">The challenge of multiple sclerosis: how do we cure a chronic heterogeneous disease.</a> Ann Neurol. 65, 239-248 (2009).</li><li>Fleming, J. O., Trousdale, M. D., Bradbury, J., Stohlman, S. A., Weiner, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+demyelination+induced+by+coronavirus+JHM+(MHV-4):+molecular+identification+of+a+viral+determinant+of+paralytic+disease.">Experimental demyelination induced by coronavirus JHM (MHV-4): molecular identification of a viral determinant of paralytic disease.</a> Microb Pathog. 3, 9-20 (1987).</li><li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remyelination,+axonal+sparing,+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis.">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187, 254-265 (2004).</li><li>Carbajal, K. S., Schaumburg, C., Strieter, R., Kane, J., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+of+engrafted+neural+stem+cells+is+mediated+by+CXCL12+signaling+through+CXCR4+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis.">Migration of engrafted neural stem cells is mediated by CXCL12 signaling through CXCR4 in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 11068-11073 (2010).</li><li>Hardison, J. L., Nistor, G., Gonzalez, R., Keirstead, H. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+a+viral+model+of+multiple+sclerosis+induces+remyelination+in+the+absence+of+an+attenuated+inflammatory+response.">Transplantation of glial-committed progenitor cells into a viral model of multiple sclerosis induces remyelination in the absence of an attenuated inflammatory response.</a> Exp Neurol. 197, 420-429 (2006).</li><li>Blakemore, W. F., Crang, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transplantation of glial cells into areas of demyelination in the adult rat spinal cord. , (1992).</li><li>Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 6126-6131 (2000).</li><li>Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+oligodendrocyte+progenitor+cell+transplants+remyelinate+and+restore+locomotion+after+spinal+cord+injury.">Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury.</a> J Neurosci. 25, 4694-4705 (2005).</li><li>Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+patient+enters+trial+to+test+safety+of+stem+cells+in+spinal+injury.">First patient enters trial to test safety of stem cells in spinal injury.</a> BMJ. 341, c5724-c5724 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ההשתלה מבוצע היטב יהיה בעיקר על ציר laminectomy הזריקה זהירה של התאים. מכשול יסודי להימנע במהלך laminectomy היא פגיעה של חוט השדרה. זה יכול להתרחש במהלך ההליך עצמו או על ידי נזק שנגרם עקב שברי עצמות חדות השאיר אחריו ביצוע ההליך. כדי להימנע אלה, להבטיח את הנקודות של המספריים מיקרו מעוקל תמיד פונה הרחק חוט לבחון היטב את עמוד השדרה laminectomized מנת להבטיח כי כל שברי עצמות נמחקים וזה הקצוות מבנה השדרה הנותרים אין בגלוי בולטות או משוננים. כאמור, זיהוי של בזרימת יהיה אפשרי אם אור זורחת בעליזות ישירות על חוט השדרה חשוף במהלך ההזרקה. בזרימת סביר להניח שיקרה עם 30 מחטים מד (לעומת 33 מד) ואם זריקה נעשה מהר מדי. אף על פי פרוטוקול זה נתן לנו תוצאות טובות, אחרים דיווחו כבר תקופות ההמתנה (עד 5 דקות) לפני retracting מחט הזריקה הבאה 8,9. כמו כן, מחטים מד קטן עדיפים, אבל יש לנו ציין כי כמה תאים lysed בקלות רבה מדי, כאשר עברו 33 מחטים מד. כדי למקסם את היעילות, צוות ההשתלות איוש ארבע תחנות שונות (עכבר הכנה, laminectomy, הזרקה, ותפרים) רצוי. יתר על כן, התזמון עבור כל הליך צריך להיות מותאם כדי לצמצם את זמן התאים מחכים על הקרח. לדוגמה, אנו ההשתלה בעכברים שלנו בקבוצות של ארבעה (מספר מנות לטעון כל המזרק), האדם הזרקת התאים מתחיל להעמיס את המזרק לאחר העכבר השלישי היה laminectomized והאדם בהכנת עכברים צריך להרדים את הפעולות הבאות הקבוצה אחרי העכבר השני של הקבוצה הקודמת כבר laminectomized. באופן זה, אנו יכולים השתלת תאים (או בקרת מדיה) תוך 40 עכברים כ 3 שעות, למרות כל עכבר ייקח כ 30-40 דקות. החלפת תא טיפולים לטיפול בהפרעות מערכת העצבים המרכזית חלק כרגע בניסויים קליניים 10. אין תחליף במודלים vivo של NSC השתלת פרוטוקול שלנו engraftment של NSCs לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination המושרה ויראלי מאפשר את השימוש מודל חשוב של טרשת נפוצה ניתן להתאים בקלות מודלים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב / ציוד </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> הפניקס Parmaceuticals </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Xylazine הידרוכלוריד </td><td> MP Biomedicals </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> נאיר </td><td> הכנסייה &amp; דווייט ושות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10  μl המילטון מזרק w / נשלף מחט </td><td> המילטון החברה </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> מחטים המילטון, 30G או 33 G, ½ אינץ&#39;, 30 מעלות שפוע </td><td> המילטון החברה </td><td> 7803-077803-05 </td><td> בדקו את הכדאיות של התאים הבאים מעבר דרך מחטים לזהות את מד הטובה ביותר לשימוש </td></tr><tr><td> מיקרו מספריים </td><td> העולם מכשירי דיוק </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> קטנים גרפה מלקחיים </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> דגם 1772 יוניברסל מחזיק </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> דגם 1773 מחזיק אלקטרודה </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> 902 דגם stereotaxic קטן חיה </td><td></td></tr><tr><td> Stereotaxic </td><td> KOPF מכשירים </td><td> דגם 960 אלקטרודה שמאל הספק </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactated האצבעות </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> סטייפלס </td><td> פיין המדע </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> אזמלים, בגדלים 10,11 </td><td> דיג </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Ethicon </td><td> 1676G </td><td> גודל 5-0, 3 / 8 &quot;מעגל, 19mm מחט, חוט 45cm קלוע </td></tr><tr><td> רפלקס 7 קליפ פצע המוליך </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7mm פצע קליפים רפלקס </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> אולסן-Hegar בעל מחט </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

עכברים שהודבקו בזן JHM neurotropic של נגיף הפטיטיס העכבר (MHV) לפתח התוצאות פתולוגיים וקליני דומה בחולים עם טרשת demyelinating המחלה נפוצה (MS). הראינו כי השתלת NSCs לתוך מיתרי השדרה של תוצאות עכברים חולים שיפור משמעותי בחידוש יצירת המיאלין והן על התוצאה הקלינית. החלפת תא טיפולים לטיפול במחלות נוירולוגיות כרוניות כיום מציאות במודלים vivo הם חיוניים להבנת יחסי הגומלין בין התאים engrafted ורקמות microenvironment המארח. מצגת זו מספקת שיטה המותאמת השתלת תאים לתוך חוט השדרה של JHMV עכברים נגועים. בקיצור, אנו מספקים נוהל i) הכנת NSCs לפני ההשתלה, ii) טרום ניתוחית לטפל בעכברים, ג) החשיפה של חוט השדרה דרך laminectomy, ד) הזרקה של stereotactic NSCs, ו ד) שלאחר הניתוח טיפול .

Watch this Scientific Journal Video about Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus at JoVE.com

Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

השתלה של תאים העכבר גזע עצביים (NSCs) לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination הוקמה מפורט. הכנה של NSCs, laminectomy של החוליה החזי 9 (T9), וכן השתלת NSCs מתוארת יחד עם הטיפול לפני ואחרי הניתוח של העכברים.

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K Views.  University of California, Irvine. השתלה של תאים העכבר גזע עצביים (NSCs) לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination הוקמה מפורט. הכנה של NSCs, laminectomy של החוליה החזי 9 (T9), וכן השתלת NSCs מתוארת יחד עם הטיפול לפני ואחרי הניתוח של העכברים.

Video: Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a chemically defined serum-free culture system known as the neurosphere assay (NSA). In this assay, the majority of differentiated cell types die within a few days of culture but a small population of growth factor responsive precursor cells undergo active proliferation in the presence of epidermal growth factor (EGF) and/ basic fibroblastic growth factor (bFGF). These cells form colonies of undifferentiated cells called neurospheres, which in turn can be subcultured to expand the pool of neural stem cells. Moreover, the cells can be induced to differentiate, generating the three major cell types of the CNS i.e. neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. This assay provides an invaluable tool to supply a consistent, renewable source of undifferentiated CNS precursors, which could be used for in vitro studies and also for therapeutic purposes.
This video demonstrates the NSA method to generate and expand NSCs from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting the brain from the adult mouse, micro-dissection of the periventricular region, tissue preparation and culture in the NSA. The harvested tissue is first chemically digested using trypsin-EDTA and then mechanically dissociated in NSC medium to achieve a single cell suspension and finally plated in the NSA. After 7-10 days in culture, the resulting primary neurospheres are ready for subculture to reach the amount of cells required for future experiments.

This video protocol demonstrates the neurosphere assay method to generate and expand neural stem cells from the adult mouse periventricular region, and provides technical insights to ensure one can achieve reproducible neurosphere cultures.

בידוד הרחבה של תאים בוגרים עכבר גזע עצביים שימוש Assay Neurosphere

Isolation and expansion of the putative neural stem cells (NSCs) from the adult murine brain was first described by Reynolds and Weiss in 1992 employing a ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

פיתוחו של פרוטוקול מעודן עבור השתלת Subretinal טרנס-scleral של תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית האנושי בעיניים עכברוש

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

התמיינות של תאי גזע עובריים בעכבר לתוך Interneuron קורטיקלית מבשרי

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

השתלת Homochronic של סימנים מקדימים Interneuron לתוך מוח העכבר כמחנכת מוקדם

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

השתלת כימוגנטית מהונדס בקליפת המוח ושלתי לתוך המוחות המוקדמים של העכבר לנטאל

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic mechanisms have been intensively studied. 5-hydroxymethylcytosine displays dynamic features during embryonic and postnatal development of the brain, plays a regulatory function in gene expression, and is involved in multiple neurological disorders. Here, we describe the detailed methods including immunofluorescence staining and&#160;DNA dot-blot to detect 5-hydroxymethylcytosine in cultured cells and brain tissues of mouse.

Here, we present a protocol to detect 5-hydroxymethylcytosine in cells and brain tissues, utilizing immunofluorescence staining and DNA dot-blot methods.

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

משלוח פנים-עורקי של תאי גזע עצביים למוח עכברוש ועכבר: יישום איסכמיה מוחין

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...