1. Preparação <ol><li> Prepare xilazina-cetamina solução (ketamina é uma substância controlada. Registros detalhados devem ser mantidos e soluções armazenadas em um local seguro e trancado). </li><li> Limpar e esterilizar equipamentos. </li><li> Prepare área da cirurgia, limpando com o agente de assepsia e, em seguida, cobrir com papel toalha estéril, e configurar o micromanipulador. </li></ol> 2. Preparação de células para transplante <ol><li> As células devem ser ressuspendidas a uma concentração de 100.000 células / l E e, apesar de apenas 250.000 células são transplantadas por mouse, um excesso de células é necessário para fins de seringa de carga (preparar pelo menos 300 mil células por camundongo que receberam células). </li><li> Lave as células a serem transplantadas 3 vezes em HBSS num frasco de 50 ml. Contar as células antes do spin-final. </li><li> Após a centrifugação final para baixo, e deixar decantar HBSS frasco em posição de cabeça para baixo para evitar que gotas de alcançar o sedimento. </li><li> Seca paredes interiores com um UV-irradiados Kimwipe, estéril. Não permita que o pellet para secar. </li><li> Segurando o tubo na posição vertical, lenta e delicadamente ressuspender as células em metade do volume final desejado de HBSS. </li><li> Medir o volume total por pipetagem a maioria da suspensão em uma ponta da pipeta e então ajustando o dial na pipeta até a suspensão inteira está na ponta da pipeta. Isso vai te dizer o quanto HBSS mais é necessário para a concentração desejada. </li><li> Traga de volume para a quantidade desejada, adicionando HBSS. </li><li> Coloque de volta no gelo. Verificar a viabilidade das células se deve ser sobre o gelo por mais de 2 hrs. </li></ol> 3. Preparação de ratos para a cirurgia e transplante <ol><li> Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em ~ 100 mL doses ou por um anestésico equivalente. Todo o processo de preparação cirúrgico para sutura terá de 30-40 minutos. </li><li> (Opcional: aplique fita numerada, colorido para a cauda de cada rato para assegurar a identificação) </li><li> Raspar a área dorsal do mouse a partir da parte inferior das costas para o pescoço, e estendendo dois centímetros da linha média bilateral, com tosquiadeiras elétricas. O cabelo deve ser cortado o mais próximo possível (pode ser necessário para ir sobre a área várias vezes). </li><li> Para remover os pêlos restantes, aplique uma camada fina de creme de depilação (Nair) com uma gaze aplicador derrubado. </li><li> Depois de 1-2 minutos, limpe Nair off com gaze umedecida levemente com água e sabão. A área preparada deve ser limpa a pele nua, sem peças perdidas de cabelo que poderiam entrar na ferida durante o procedimento cirúrgico subseqüente. Esterilizar a área preparada com solução de iodeto. </li></ol> 4. Laminectomia <ol><li> Mudam freqüentemente e / ou esterilizar as luvas durante o procedimento. Posição ao lado do mouse dorsal com a cabeça apontando para a esquerda (se você for destro). Drape animais para garantir a esterilidade e que apenas a área raspada está exposto. Faça uma incisão vertical (~ 1,3 cm) sobre o local laminecomy spanning de cerca de vértebras torácicas T8 a T12. </li><li> Com a pinça zu na mão esquerda, prender firmemente a coluna vertebral em T9 (Figura 1A) e levante o mouse até a exagerar a curvatura da coluna vertebral. </li><li> Use o bisturi para marcar a junção entre T10 e T11, o espaço entre as duas saliências espinhosas. Ainda expor a junção com cuidado a demolição da camada muscular para expor o osso (ver Figura 1B, C). </li><li> Use a tesoura para mais músculo clara distância da lâmina e em torno do pedículo com snips pequenos. Isto irá abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Lenta e delicadamente inserir uma lâmina da tesoura para essa lacuna e snip do pedículo. Certifique-se a curvatura da tesoura é sempre posicionados lateralmente, longe do cabo. Repita no outro lado. (Ver Figura 1D, E) </li><li> Levante a lâmina para expor o cabo e cuidadosamente snip-lo. Não se esqueça de deixar qualquer fragmentos de ossos livre ou irregulares para trás. (Ver Figura 1F) </li><li> Antes da injeção, limpar o sangue para fora com cotonetes estéreis. </li></ol> 5. Injeção de células <ol><li> Coloque a agulha com agulha porca para a seringa Hamilton e limpá-los através de lavagem com água várias vezes, então 70% de etanol e, finalmente, HBSS. Inserir êmbolo após cada enchimento com água, etanol 70%, ou HBSS. </li><li> Prepare a seringa Hamilton para carregar celular através da remoção do êmbolo e soltando a porca agulha e puxando a agulha para longe da seringa para evitar contrapressão. Garantir que a manipulação cuidadosa da agulha e porca é feito com luvas estéreis. </li><li> Carga 15μl de células em pipeta ponta e pressione a ponta firmemente na extremidade traseira da seringa para carregar as células dentro da seringa. </li><li> Insira o êmbolo aproximadamente 5mm e, em seguida, apertar a porca da agulha. </li><li> Deprimem êmbolo unaté alguns da suspensão de células foi visto saindo da agulha. </li><li> Certifique-se que não há bolhas na seringa e colocar a seringa na posição horizontal para evitar que as células de fazer um gradiente de gravidade. </li><li> Agarrar o mouse laminectomized pelo músculo spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9 (Figura 2B, C). </li><li> Prender o hemostat para o braço esquerdo micromanipulador (vertical) para que as patas da frente do rato estão no ar e suas patas traseiras tocando levemente uma plataforma de toalhas de papel estéreis, nas Figuras 2A e 2B. </li><li> Conecte a seringa no braço direito micromanipulador (em um ângulo de 70 °) e deslize a seringa na posição mais baixa possível, antes de aperto. </li><li> Estabilizar o mouse fixando sua cauda contra as toalhas de papel e abaixe lentamente a seringa (Figura 2B). </li><li> Abaixe a agulha em direção ao cabo e insira a um milímetro agulha no hemisfério oposto através da linha média dorsal (Figura 2C). A ponta da agulha deve ser na substância cinzenta perto do canal central. </li><li> Injecte lentamente 2.5μl de células. Injetar a uma taxa de 1μl / 5 segundos. Depois de injetar as células, espere uns 10 segundos e retirar a agulha 1 / 10 de uma volta em um momento cada 10 segundos até que a agulha está fora do cordão. Preste atenção ao efluxo possível de suspensão celular. </li><li> Rapidamente retirar a seringa e retire-a do braço micromanipulador. Lay a seringa horizontalmente. </li><li> Solte o mouse e transferência para a mesa sutura. </li><li> Repita os passos 5,7-5,14 para cada rato até que a seringa é esvaziada. Esterilizar as ferramentas (no esterilizador) ea agulha (limpando com álcool) entre os animais. Descartar pilhas e recarregar se aglomeração é visível. </li><li> Limpe a seringa como no passo 5,1 entre as cargas. </li></ol> 6. Suturas e pós-operatório de cuidados <ol><li> Suturar a incisão. Agulha de sutura é inserida na fáscia superficial em ambos os lados da incisão. O fio é amarrada através de, puxando fáscia superficial juntos (Figura 3A), cobrindo assim a medula espinal exposta no local da lâmina removido. Não sutura do músculo cutâneo ligado à pele ou do músculo esquelético das costas. Puxe a linha através de todo, deixando cerca de 1 / 2 &quot;. Usando o porta-agulha, três nós são formados e linha é cortada o mais próximo do nó possível. </li><li> Fechar a incisão através da aplicação de 2-3 grampos (dependendo do tamanho da incisão) para a pele (Figura 3B). Puxe cuidadosamente a pele longe do mouse para evitar grampear o músculo subjacente. </li><li> Usando um 26G3 / 8 agulha injetar 0,5 ml de Ringer Lactato de sub-cutânea na região lombar longe da incisão. </li><li> Colocar o mouse de volta em sua gaiola. Para garantir que ele é capaz de respirar confortavelmente enquanto sob anestesia, o mouse deve ser colocado de lado na gaiola, evitando o contato entre o local da cirurgia e roupa de cama gaiola. Gaiolas devem ser colocados em almofadas de aquecimento. </li><li> Ratos são monitorados após a anestesia desgasta fora para garantir subsídios sangramento, suturas permanecem fechadas, e que os ratos voltar ao pré-cirurgia de mobilidade. </li><li> Tratar ratos um tempo com a buprenorfina analgésico (0,05-0,1 mg / kg) após a cirurgia. </li><li> Garantir camundongos deficientes têm acesso suficiente a alimentos e água: garrafas de água estão equipados com bicos estendida 3,5 polegadas e ratos que são incapazes de andar de mão são alimentados de água e / ou de alto teor calórico suplemento dietético (Nutri-Cal, Tomlyn). </li></ol> 7. Resultados representativos: Resultados desejados será identificável pela falta de efluxo da suspensão de células durante a injeção e pelo aparecimento intactas da medula espinhal após o procedimento. Para este fim, é vital ter uma iluminação brilhante e direta na coluna do rato durante a laminectomia e durante a injeção. A iluminação ideal é facilitada pela iluminação de fibra óptica (Figura 2A). <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1 - Laminectomia (A) Uma vez vértebra T9 está solidamente realizada com a pinça Graefe, (B, C) ​​pontuação da coluna vertebral com bisturi entre T10 e T11 para facilitar a entrada da tesoura micro.. (D) Deslize cuidadosamente a tesoura micro através do espaço entre T10 e T11 (setas e inset, E) e cortar os pedículos de cada lado (traços, E) para libertar a lâmina dorsal. (F) Virar a lâmina até rostralmente e cortá-lo. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Injeção de NSCs. (A) A configuração geral do micromanipulador com o hemostat segurando o mouse conectado ao braço esquerdo e na seringa Hamilton no braço direito em um ângulo de 70. (B) O hemostat segurar o spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9. (C) A agulha é reduzido através de tele linha média e na matéria cinzenta no hemisfério oposto, proximal ao canal central. <img src="/files/ftp_upload/2834/2834fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Suturas e fechamento da ferida. (A) Suturas são aplicados à fáscia superficial em ambos os lados da incisão. (B) A incisão é fechada com grampos 03/02, conforme necessário (um grampo mostrado em uma ferida que necessitam 3).

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Não há conflitos de interesse declarados.

Um transplante bem executado vai depender principalmente na laminectomia cuidadoso e injeção das células. A armadilha primário para evitar durante uma laminectomia é o prejudicial da medula espinhal. Isso pode ocorrer durante o procedimento em si ou por danos causados ​​por fragmentos de ossos afiados deixado para trás após o procedimento. Para evitar essas, garantir que os pontos da tesoura curva micro são sempre de costas para o cabo e examinar cuidadosamente a espinha laminectomized para garantir que todos os fragmentos de ossos são limpos e que as bordas da estrutura remanescente vertebral não tem abertamente salientes ou irregulares. Como mencionado anteriormente, a detecção de efluxo será possível se a luz está brilhando e diretamente na medula espinal exposta durante a injecção. Efluxo é mais provável que isso aconteça com 30 agulhas (versus 33 gauge) e se a injeção é feita muito rapidamente. Embora este protocolo tem nos dado bons resultados, outros têm relatado mais períodos de espera (até 5 minutos) antes de retrair a agulha de injeção seguinte 8,9. Além disso, as agulhas bitola menor são preferíveis, mas temos observado que algumas células são facilmente lisadas quando passou por 33 agulhas. Para maximizar a eficiência, a equipe de transplante lotação as quatro estações diferentes (mouse prep, laminectomia, injeção, e suturas) é desejável. Além disso, o tempo para cada processo deve ser otimizado para minimizar o tempo as células estão esperando no gelo. Por exemplo, nós transplante de nossos ratos em grupos de quatro (o número de doses em cada carga da seringa), a pessoa injetar as células começa a carregar a seringa após o mouse terceiro foi laminectomized ea pessoa deve preparar os ratos anestesiar o seguinte grupo após o segundo rato do grupo anterior foi laminectomized. Desta forma, podemos transplante de células (ou controle de mídia) em 40 camundongos em cerca de 3 horas, apesar de cada rato terá aproximadamente 30-40 min. Terapias com células de substituição para o tratamento de algumas doenças do SNC estão actualmente em ensaios clínicos 10. Não há substituto para modelos in vivo de transplante e NSC nosso protocolo para o enxerto de NSCs na medula espinhal de ratos com desmielinização induzida viral facilita o uso de um modelo importante de MS e também pode ser facilmente adaptado para outros modelos.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente / equipamentos </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> Ketaject </td><td> Parmaceuticals Phoenix </td><td> NDC 57319-542-02 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de xilazina </td><td> Biomedicals MP </td><td> 158307 </td><td></td></tr><tr><td> Nair </td><td> Church &amp; Dwight Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td>  10 mL Hamilton Seringa agulha w / Removable </td><td> Empresa Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas Hamilton 30G, ou 33 G, ½ polegada, 30 ° chanfro </td><td> Empresa Hamilton </td><td> 7803-077803-05 </td><td> Testar a viabilidade de suas células após a passagem através de agulhas para identificar o melhor calibre para uso </td></tr><tr><td> Micro Tesoura </td><td> Precision Instruments mundo </td><td> 555500S </td><td></td></tr><tr><td> Pinça Graefe pequena </td><td> FST </td><td> 11053-10 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Titular modelo 1772 Universal </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modelo de suporte do eletrodo 1773 </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modelo 902 estereotáxica de pequenos animais </td><td></td></tr><tr><td> Estereotáxica </td><td> KOPF Instruments </td><td> Modelo 960 transportadora eletrodo esquerdo </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> Ethicon </td><td> 95057-064 </td><td></td></tr><tr><td> Lactato de Ringer </td><td> Hospira </td><td> NDC 0409-7953-03 </td><td></td></tr><tr><td> Staples </td><td> Ciência fina </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Hemostat </td><td> FST </td><td> 13010-12 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturis, tamanhos 10,11 </td><td> Pescador </td><td> 268878, 268879 </td><td></td></tr><tr><td> Suturas </td><td> ETHICON </td><td> 1676G </td><td> tamanho 5-0, 3 / 8 &quot;círculo, agulha de 19mm, fio trançado 45 centímetros </td></tr><tr><td> Reflex 7 aplicador de clipe ferida </td><td> FST </td><td> 12031-07 </td><td></td></tr><tr><td> 7 milímetros Reflex clips ferida </td><td> FST </td><td> 12032-07 </td><td></td></tr><tr><td> Olsen-Hegar porta-agulha </td><td> FST </td><td> 12502-12 </td><td></td></tr></tbody></table>

surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus

Camundongos infectados com a cepa JHM neurotrópica do mouse vírus da hepatite (MHV) Desenvolver resultados patológicos e clínicos semelhantes aos pacientes com a doença desmielinizante Esclerose Múltipla (MS). Nós mostramos que o transplante de NSCs na medula espinhal de ratos doentes resultados em uma melhora significativa em ambos os remielinização e no resultado clínico. Terapias com células de substituição para o tratamento de doenças neurológicas crônicas são agora uma realidade e em modelos in vivo são vitais para a compreensão das interacções entre as células enxertadas e microambiente tecido hospedeiro. Esta apresentação fornece um método adaptado para o transplante de células na medula espinhal de ratos infectados JHMV. Em resumo, nós fornecemos um procedimento para i) preparação de NSCs antes do transplante, ii) pré-operatório de ratos, iii) a exposição da medula espinhal através de laminectomia, iv) a injeção estereotáxica de NSCs, e iv) cuidados pós-operatórios .

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Surgical Transplantation of Mouse Neural Stem Cells into the Spinal Cords of Mice Infected with Neurotropic Mouse Hepatitis Virus

O transplante de células-tronco do mouse neural (NSCs) na medula espinhal de ratos com desmielinização estabelecida é detalhado. A preparação de NSCs, a laminectomia de vértebra torácica 9 (T9), e transplante de NSCs é descrito juntamente com os cuidados pré e pós-operatório dos ratos.

Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

Mice infected with the neurotropic JHM strain of mouse hepatitis virus (MHV) develop pathological and clinical outcomes similar to patients with the ...

surgical-transplantation-mouse-neural-stem-cells-into-spinal-cords

Research

JoVE Journal

Neuroscience

23.2K visualizações.  University of California, Irvine. O transplante de células-tronco do mouse neural (NSCs) na medula espinhal de ratos com desmielinização estabelecida é detalhado. A preparação de NSCs, a laminectomia de vértebra torácica 9 (T9), e transplante de NSCs é descrito juntamente com os cuidados pré e pós-operatório dos ratos.