يمكن أن تكون هذه الطريقة مفيدة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات البيولوجيا العصبية مثل كيفية عمل المحطات الطرفية في الجسم الحي. والميزة الرئيسية لهذه المجموعة من التقنيات هي أننا نظهر نهجًا مجانية للدقامات وظيفة مسارات الشم باستخدام الشراغوف Xenopus كنموذج حيواني. إثبات هذا الإجراء سيكون أنا، بياتريس تيرني، وباولو Pacciolla.
بدء الإجراء عن طريق الترسيب اثنين من قطعة من ورقة تصفية السليلوز النوعية في 0.02٪ MS2 22 محلول التخدير، ووضعها تحت نطاق تشريح. ثم اختيار الشرغوف من الخزان وتزج في طبق من محلول مخدر. يجب على الشرغوف التوقف عن السباحة في غضون دقيقتين إلى أربع دقائق.
تحقق من التخدير السليم من خلال عدم وجود رد فعل على المحفزات الميكانيكية المطبقة على مستوى الذيل باستخدام الملاقط. ضع الشرغوف المُغفَل على ورقة التصفية ضمن النطاق. ضع الحيوان مع الجانب الظهري الذي يواجه صعودًا حتى يمكن تصور هياكل الدماغ.
للتجارب السلوكية، استخدم مقص veni لتنصيب كلا الأعصاب لقمع جميع المعلومات الرائحة التي تصل إلى لمبة الشم. تحميل ماصة الزجاج poled مع اثنين microliters من الكالسيوم الأخضر حل دكسترين واحد، ووضعها في الميكروين. ضع الشرغوف المُغفَّر تحت المجهر المُتشَحِف على ورق الفلتر، ثم حرك طرف الماصات إلى التجويف الرئيسي لكبسولة الأنف، ثمّ سلّم 0.15 إلى 0.3 ميكرولترات من الصبغة.
اترك الشرغوف في مكانه لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. باستخدام ماصة باستور، بالتنقيط 0.02٪ MS2 22 حل على أجزاء أكثر تخبط من الحيوان لتجنب التجفيف. نقل الحيوان إلى خزان الانتعاش حيث يجب أن يتعافى الشرغوف السباحة العادية في غضون 10 دقيقة أو نحو ذلك.
مراقبة الفلورس على مستوى طبقة الكبيات من لمبة الشم في اليوم التالي للحقن. إعداد الشرغوف تخدير للتصوير عن طريق إزالة الجلد فوق المصباح الشمي أولاً. استخدم مقص veni لإجراء شق شقي على جلد الشرغوف على حافة الجهاز العصبي المركزي على مستوى لمبة الشم.
تجنب تمديد القطع إلى tectum، والتي يمكن التعرف عليها بسهولة من قبل موقع العصب البصري. الحفاظ على رطبة الحيوان عن طريق تطبيق قطرات من 0.02٪MS2 22 حل باستخدام ماصة باستور ثم قرصة الجلد قطع باستخدام ملاقط وسحبه على الجهاز العصبي. تحقق من الإزالة الناجحة عن طريق عدم وجود الخلايا الصباغية فوق لمبة الشم.
وضع الشرغوف في بئر من طبق المغلفة حارس الخلية. ضع غطاء زجاجي مغطى بشحون فراغ عالية لتغطية الجزء العلوي من اللتكوم حتى نهاية الذيل. تأكد من أن المصباح الشمي و placodes تبقى عرضة للوسيط خارج الخلية.
ملء طبق pitri مع حل Xenopus رينجر يحتوي على 100 tubocurarine micromolar لمنع تقلصات العضلات. ضع الطبق الذي يحمل الشرغوف تحت مجهر مستقيم. قم بتوصيل الخزان الذي يحتوي على حل Xenopus Ringer مع الطبق باستخدام أنابيب البولي إيثيلين للحصول على وفرة مستمرة من محلول زينوبوس رينجر.
بدء perfusing حل Xenopus رينجر. الحفاظ على مستوى الحل في ثابت الطبق طوال التجربة. تقييم استمرارية الشرغوف من خلال مراقبة الدورة الدموية من خلال الأوعية.
ابدأ التصوير المباشر باستخدام هدف التكبير المنخفض لتصور الشرغوف. حرك محور المايكرومانيبولاتر لوضع الشعيرات الدموية التي تقدم محلول الرائحة على الجزء العلوي من كبسولة أنفية واحدة ، وتشكيل زاوية 90 درجة مع العصب الشمي. العثور على لمبة الشم تقع ipsilaterally إلى كبسولة الأنف.
قم بالتبديل إلى هدف المياه عالية التكبير مع مسافة عمل طويلة. تحقق من انبعاث الفلوريس من قبل الهياكل I.Glomerular ينبغي أن يكون واضحا. تبدأ الأنابيب 20 ملليلتر من محلول الأحماض الأمينية الطازجة في خزان مرتفعة.
ثم خذ ستة أنواع من الضفادع الغذائية المحرومة من خزان السكن، ووضعها في لترين من مياه الشرغوف النظيفة لتقليل التعرض للروائح. وضع طبق ستة جيدا معدلة على الترانونوميناتور LED الأبيض. املأ كل بئر بـ 10 ملليلتر من مياه الشرغوف.
ضع ضفادع واحدة في البئر، ثم اتركها لتستريح لمدة ثلاث دقائق على الأقل. ابدأ الحصول على الصور والحصول على الأفلام التي تحتوي على فترات القاعدية والتحفيز والاسترداد. يمكن الكشف عن استجابة جذابة كحركة نحو فوهة تقديم حل الأحماض الأمينية.
إعادة الحيوانات إلى خزانها بعد التصوير. تتبع مواقع الرأس الشرغوف داخل مساحة 35 ملليمتر في 35 ملليمتر، أو ما يعادلها من حجم في بكسل، يسمح بتحليل كمي للسلوك الموجه الشمي. يمثل الخط المنقط المنطقة القريبة لمدخل حل الرائحة.
يتم بناء قطع الأراضي الفردية من حركات الشرغوف باستخدام إحداثيات س Y التي تم الحصول عليها عن طريق تحليل الصور. يجب أن تستنسخ مؤامرات الحركة المستخرجة صور الفيديو بأمانة. يتم استخدام منطقة ذات أهمية من دائرة نصف قطرها 8.75 ملليمتر تركزت على مدخل حل لتصنيف قرب الحيوانات من مصدر الرائحة.
المزيد من الوقت الذي يقضيه في محيط فوهة الرائحة يشير إلى الاستوائية الإيجابية. الوقت الذي يقضيه الضفادع بالقرب من فوهة خلال فترات محددة، على سبيل المثال، 15 فترات ثانية، يسمح بتحديد القدرة على الكشف عن حلول الأحماض الأمينية. يمكن الحصول على السلوك العام للسكان من الضفادع عن طريق رسم توزيع البيانات الفردية.
يمكن الكشف عن التروبيزم الإيجابي عندما يتم إعداد محلول الأحماض الأمينية في ميليمولار واحد أو 160 ميكرومولار. الحيوانات لا تستجيب لتطبيق المياه. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التقنيات النسيجية أو الفيزيولوجيا الكهربائية، للإجابة على أسئلة إضافية مثل تغيير الخصائص المتشابكة بعد الإصابة.
بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا العصبية لاستكشاف معالجة معلومات الشم في الشرغوف Xenopus.
