وأيد العمل لهذا المشروع من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة R01 - NR5339 وجامعة الخدمات الموحدة للعلوم الصحية ، R061LD.

1. العزلة وإعداد الشرايين بيال <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الفئران هو تخدير وتأمين ادخال قسطرة في شريان ويروي مع الأزرق ايفانز 1 ٪ في برنامج تلفزيوني 1X. سفن بيال صمة عار تماما مع صبغة زرقاء ايفانز جعلها أسهل للعزل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج المخ وتخزينها في -70 درجة مئوية لحين الحاجة إليها. على النحو الأمثل ، يجب أن تكون مخزنة العقول لا تزيد على 2 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مجهر تشريح الشرايين إزالة حنوني (متوسط ​​قطرها 35-50 ميكرون) من سطح الدماغ. سحب قبالة بعناية جميع الشرايين الزرقاء الملطخة من سطح الظهرية والجانبية من القشرة باستخدام ملقط الجميلة ذات الرؤوس. إزالة الأنسجة الزائدة القشرية ملتصقة قبل ان يضع في تثبيتي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الشرايين التي تحصد في بارافورمالدهيد الباردة 2 ٪ في برنامج تلفزيوني 0.1M لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الشرايين لتصب sectioning المتوسطة التضمين على تجميد القرص / تشاك (وضعت في -20 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الفرع شرين منبسطة على تشوك aالثانية وانتظر حتى التجميد. المكان بقوة تصل السفينة الأيمن على القرص تجميد ناظم البرد على تضمين وسائل الاعلام مع غيض من الشريان باتجاهك. لأنه عقد مع ملاقط حتى يتم تجميد بقوة عليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع القرص مع تجميد السفينة في الرأس ناظم البرد وقطع 8 ميكرومتر حلقات شرين حنوني مع ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل المقاطع شرين على الكروم والبوتاسيوم والجيلاتين SUBBED الشرائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الشرائح أعد في مربع الشريحة في الثلاجة عند 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> 2. ER - α يلطخ مناعي اليوم 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الثلاجة ، لتحقيق كل درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لغسل الشرائح صب 1-1،5 مل 0.1M PBS (ما يكفي لتغطية جميع الفروع) اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة ، واستنزاف وكرر الإجراء مرتين أكثر من ذلك. كل حافة الشريحة لديها علامة مسعور. وبالتالي ، يبقى السائل على سطح الشريحة. مع كل الغسيل يسكب السائلالخروج واستبدال الطازجة PBS M 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في 1 مل من كلوريد الأمونيوم 50mM لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحد من مضان الذاتية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كتلة الشرائح في 0.1 ٪ تريتون - X 100 زائد 1 ٪ مصل الماعز العادي (خ ع) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. للحد من المنظمات غير محددة وملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات مع الجسم المضاد الأولي (الأرنب النسائل المتعددة المضادة للER - α ؛ 1:500) في برنامج تلفزيوني + 0.1 ٪ تريتون - X + 1 ٪ بين عشية وضحاها NGS في 4 درجات مئوية. </li></ol> اليوم 2 <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح من الثلاجة ، لتحقيق كل درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الأخضر ولاية أوريغون 488 أرنب الثانوية للسامية في NGS 1 ٪ +0.1 ٪ تريتون - X100 + برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. من هذه الخطوة ، يجب القيام بالخطوات التالية في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح في دقيقة 0.1M 3x10 برنامج تلفزيوني. كما هو موضح في 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد ظلntilated هود ، ضع قطرة من 1 4 ، 6 - 2 - diamidino phenylindole (دابي) ، بالإضافة إلى وسائل الإعلام المتزايدة على السفن ثم ضع زلة تغطي أكثر من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مسمار البولندية واضحة لختم حواف الغطاء زلة. لا تتحرك الشرائح حتى تجف تماما ، والتي تأخذ حوالي 24 ساعة. </li></ol> 3. التصوير الرقمي الإسفار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير ER - α في السفينة حنوني شريحة نستخدم الكسوف نيكون المجهر الرقمي 80i الفلورسنت مع المرشحات لمدة 3 ألوان (الأزرق والأخضر والأحمر) مجهز بكاميرا رقمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضاف شرائح محضرة مع شرائح سفينة حنوني الملون تحت المجهر وضبط لتصور المناطق fluorescently المسمى الفائدة. تبدأ عند التكبير ثم إلى زيادة X100 X600 التكبير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكاميرا لالتقاط الصور في دابي (الأزرق) وFITC (الأخضر) قنوات للنواة الخلية (دابي) وER - α (أوريغون الأخضر) باستخدام نيكون التركيز العمق البرامج الموسعة لتحويل عرض متعددةق قطاعات السفينة الى 2 - D الصور. </li></ol> 4. ممثل النتائج : نحن المترجمة مستقبلات هرمون الاستروجين في الأوعية الشريانية α حنوني باستخدام مسابر الفلورسنت والتصور الأمثل الذي نعيش فيه من مستقبلات باستخدام المجهر مضان الرقمية. للكشف عن وجود مستقبلات ، أرنب الضد الأولية النسائل المتعددة والخضراء ولاية أوريغون كانت تستخدم الأجسام المضادة الثانوية 488 المسمى لصورة المستقبلات في الشرايين حنوني المعزولة من سطح الدماغ. أيضا ، وهو وصمة عار النووية (دابي) كانت تستخدم لتحديد نواة الخلية وتحديد ما إذا كان بإمكاننا اكتشاف المستقبلات الموجودة في نواة منذ أن تم الإبلاغ عن ER - α أن يكون حاضرا في cyotosol الخلية والنواة. بالإضافة إلى ذلك ، أجرينا تجارب للتحقق من صحة تأكيدي خصوصية الضد الابتدائية وملزمة للتحقق من الثانوية إلى الضد الأولية. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="الشكل 1"/><br/&gt; الشكل 1. مناعي لتلطيخ ER - α (الخضراء) وcounterstaining مع دابي (الأزرق) في حلقة الشريان حنوني المعزولة من الدماغ الفئران الإناث. ويبين الشكل 1A دمج الصور يدل على وجود بعض الاستروجين intranuclear مستقبلات - A (السهم) التين و1B 1C هي صورة مركزة من ER - α الذي هو مزيج من Z - المكدس الصور. أخذت الصور في التكبير وX600 من الحلقة قطع من السفينة نفسها في مستويين مختلفين. تشير الأسهم مستقبلات الاستروجين α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="الشكل 2"/> الشكل 2. تلطيخ مناعي للمجموعات التحكم في حلقة الشريان حنوني المعزولة من الدماغ الفئران الإناث. ويبين الشكل 2D السفينة دون الضد الأولية. ويبين الشكل 2E السفينة دون الضد الثانوية (لاحظ تألق ذاتي متميزة جنبا الى جنب مع البطانية). أخذت الصور في التكبير وX600 من الحلقة قطع من السفينة نفسها في احطائرات NT.

<ol>
	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

الآراء التي أعرب عنها هي تلك التي من المؤلفين ولا تعكس السياسة الرسمية أو الموقف من جامعة الخدمات الموحدة لعلوم الصحة ، وزارة الدفاع ، أو حكومة الولايات المتحدة.

سابقا ، وأظهرت لنا أنه بعد عابرة العالمية إصابات الدماغ الإقفاري هو الاكتئاب بشكل ملحوظ قدرة الشريان حنوني لتغيير الإطارات استجابة لكلا موسعات 7 و 8 و 9 في الفئران vasoconstrictors ovariectomized الشباب. المزمنة امتلاء الاستروجين يستعيد ردود حركي 7-9. كذلك ، تأخر استبدال الاستروجين يعكس الآثار المفيدة لهرمون الاستروجين على توسيع الاوعيه الدمويه قدرة الشريان حنوني 10 يقودنا إلى التساؤل عما إذا استنزاف طويلة الأمد الاستروجين يؤثر ER - α الكثافة في cerebrovasculature. خططنا لاستخدام العلامات مناعي الغربية جنبا إلى جنب مع النشاف لتقييم التغيرات في التعبير ER - α استجابة لهرمون الاستروجين استنزاف المزمنة. لأن كان لدينا بعض الصعوبة في التصور مجموعات منفصلة من المستقبلات تعديل الأسلوب الذي كنا نظهر هنا. ولذلك ، كان هدفنا الأساسي في هذه الدراسة لتطوير أول طريقة بسيطة نسبيا لتحسين البصرسعودة من المستقبلات في الشرايين حنوني. في اتفاق مع عدة تقارير 6،11،12 وجدنا أنه من الضروري إجراء تعديلات لنوع من الأنسجة كنا التحقيق ، وسماكة العينة ، وتوزيع ER - α في السفينة ، فضلا عن درجة غير محددة وملزمة . لدينا وسيلة فعالة جدا لتصور وجود ER - α في شرائح حنوني السفينة. ولكن كما سبق وأشار آخرون إلى نجاح استخدام هذه الأساليب تعتمد بشكل كبير على نوعية وتركيز الأجسام المضادة ، ومكان التحت خلوية من البروتينات التثبيت والفائدة والبروتوكولات وحظر التعامل مع النسيج 12. قبل التصور الاستعدادات السفينة قضينا لدينا الوقت للعمل على كل هذه المتغيرات. وأبرزت كيف أننا كنا في حاجة إلى تعديل بعض من نهجنا في هذه الورقة. حددنا لتصور مثالي ER - α في الشرايين حنوني وهذا قدم بعض التحديات.أولا ، بلغ متوسط ​​حجم الشريان الفئران حنوني ما بين 35-50 ميكرومتر صنع العزلة وإزالة من سطح الدماغ صعبة بعض الشيء. وجدنا أن نضح مع ايفانز صبغة زرقاء قبل التضحية يجعل من السهل تشريح الشرايين. يمكن أن تؤثر على الأزرق ايفان مضان ، لكننا نرى أن الاستفادة من استخدام هذه الصبغة تفوق سلبياته طفيفة. في بروتوكول لدينا هي تغسل سفن عدة مرات. هذا يقلل من الصبغة المتبقية في السفن ، ويقلل من الآثار المحتملة للصباغة على مضان. وقد واجهنا صعوبة أخرى أن سمك شرائح حنوني السفينة التي تصور واضح لمستقبلات صعبة. بالإضافة إلى ذلك ، لم نتمكن من الحصول على صور واضحة على نحو خاص بسبب الأرجح إلى حقيقة أن تناثرت ER - α طوال عدة طبقات الخلية. حاولنا العمل مع شرائح طولية السفينة (كما فعل آخرون) ، ولكن نظرا لحجم حنوني الصغيرة كان من الصعب التعامل مع السفن ومنع السفن من التواء في حين تصاعدحتى على الشرائح باستخدام المجهر. أخيرا ، فإننا تعديل بنجاح أسلوبنا باستخدام ناظم البرد وقطع السفينة العابرة للحكيم في لحلقات 8 ميكرومتر سميكة. الحلقات هي أسهل في التعامل معها ويمكن تركيبه على عدة شريحة واحدة. حصلت مرة واحدة ونحن السفن شعرنا أنه من الضروري اختبار فعالية فلاش first تجميد الأنسجة ثم إصلاح السفن ، كما اقترح Danseshatalb والزميلة 11. على الرغم من أن وجدنا أقل هامشيا المناعي الخلفية ، لاحظنا أيضا أن مستقبلات أقل الملون بشكل مكثف مما تصور من مستقبلات أكثر صعوبة. وبالتالي ، فإننا نفضل أن أول من تجميد كامل الدماغ وتخزينها لحين الحاجة إليها (بين عموما 1-2 أشهر). نحن ثم سحب السفن قبالة صفه وإصلاح السفن قبل التقطيع مع ناظم البرد. كما علينا أن نظهر هنا. خطوة واحدة اللازمة لتشغيل الضوابط الأولية مع كل من وحدة الأضداد الثانويةلتحديد نوعية وخلفية المناعي. الاستروجين يمكن أن الأجسام المضادة لمستقبلات α يكون من الصعب التعامل معها. في الواقع ، حاولنا 3 الأجسام المضادة الأولية مختلفة (1 حيدة النسيلة والنسائل المتعددة 2) قبل كانوا راضين نحن مع نجاح تلطيخ مستقبلات لدينا. كجزء من الرقابة لدينا ونحن أول من التحقق من نوعية الأجسام المضادة الأولية عن طريق السهو من إضافة الأجسام المضادة الأولية. ويبين الشكل 2D السفينة دون الضد الأولية. لا يوجد أي تلطيخ ومجرد إشارة الخلفية قليلا. منذ الضد الرئيسي هو النسائل المتعددة ، هناك بعض منتشر تلوين الخلفية غير محددة. ثانيا ، قمنا بإضافة الأجسام المضادة الأولية ، ولكن ليس على الأجسام المضادة الثانوية (الشكل 2E) يمكن للمرء أن يرى هامشا لطيفة تمثل autofluoresence على طول الحدود البطانية للأوعية الدموية. وهذا يتفق مع العمل والزميلة دان 5. ومع ذلك ، فإن أيا من نقاط صغيرة من المناعي التي تمثل ER - α ، ولا المرجع ظهور حبيباتيمكن lecting وجود العديد من المستقبلات دون أن يتم الكشف عن مجموعة من الأجسام المضادة في المرحلتين الابتدائية والثانوية. لاحظنا وجود نمط متميز من autofluoresence على طول هوامش البطانية للأوعية الدموية. هذه التجارب المستقلة لخصوصية جسم مهمة لأنها تؤكد خصوصية الضد لER - α والأجسام المضادة الثانوية بربط الأولية. في الختام ، كما يتبين من قبل الآخرين 4 و 5 الأوعية الدموية في الدماغ تحتوي على العديد من ER - α النوع الفرعي المستقبلات. في أيدينا ، وإعداد 8μm شرائح مقطعية عرضية من الشرايين حنوني معزولة يعزز تلطيخ وتصور من المستقبلات. استخدام الطرق التقليدية المجهري مبائر لفحص العينات. لديها القدرة لعرض مقاطع من المسلسل البصرية العينات سميكة هو المهم الاستفادة من المجهري متحد البؤر. ومع ذلك ، يمكن شراء مجهر مبائر جيد أن تكون مكلفة جدا. باستخدام الموسعة العمق (EDF) والبرمجيات ، وجدنا أنيمكن أن تقلل من تكاليف المعدات لدينا. باستخدام المجهر الفلورسنت مع EDF حصلنا على صور واضحة وقادرة على تصور حنوني الشرياني ER - α على عدة مستويات باستخدام Z - المداخن. وهناك فائدة كبيرة من البرامج EDF هو أنه يسمح التقاط الصور بطريقة فعالة لخلق صورة 3 - D من الصور. ربما للمختبرات التي لا يستطيعون الوصول إلى مجهر مبائر أو الأموال لشراء واحدة المجهر الرقمي الفلورسنت مع البرامج المخصصة يكون خيارا عمليا وأقل تكلفة وفقا لأهداف محقق.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td></tr><tr><td> زرقة إيفانس </td><td> سيغما </td><td> E - 2129 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> سيغما </td><td> P - 5493 </td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> فيشر العلمية </td><td> T353 </td></tr><tr><td> الأنسجة تيك مجمع أكتوبر </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> كلوريد الأمونيوم </td><td> سيغما </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> تريتون X - 100 </td><td> سيغما </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> الماعز العادي المصل </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER - α جسم الأرنب النسائل المتعددة </td><td> سانتا كروز </td><td> H - 184 </td></tr><tr><td> أوريغون الأخضر 488 أرنب المضادة مفتش الماعز </td><td> Invitrogen </td><td> O - 11038 </td></tr><tr><td> تصاعد Vectashieldالمتوسطة لل مضان مع دابي </td><td> ناقلات مختبر </td><td> H - 1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

وتتوسط العديد من الآثار الاستروجين على التفاعل الأوعية الدموية من خلال التفاعل مع مستقبلات الاستروجين 1 ، 2 ، 3. رغم أن عضوين أنواع فرعية موجودة (مستقبلات هرمون الاستروجين وα β) ، وقد تم التعرف على الاستروجين مستقبلات α في العضلات والسلس على حد سواء في الخلايا البطانية قطاعات الشرياني حنوني به تلطيخ الفلورسنت جنبا إلى جنب مع ليزر متحد البؤر المسح المجهري 4. علاوة على ذلك ، يقع ER - α في نوى والسيتوبلازم الشرايين القاعدي الفئران 5. المستقبلات وفيرة ويتألق الزاهية ، ولكن تصور واضح لمجموعات منفصلة من المستقبلات من الصعب على الأرجح بسبب الأعداد الموجودة في طبقات الخلية العديد من قطاعات السفينة حنوني. بالإضافة إلى ذلك ، العديد من التقارير باستخدام تقنيات المناعى يقترن المجهري مبائر سيئة بالتفصيل الاحتياجات الحرجة للاستنساخ التجارب 6. هدفنا لهذا المقال هو لوصف تقنية بسيطة لتحسين رانه تلطيخ وتصور ER - α باستخدام مستعرضة شرائح الشرايين حنوني الحصول على أدمغة الفئران من الإناث. يروي لنا first الفئران مع ايفانز صبغة زرقاء من التعرف بسهولة الشرايين السطحية حنوني الذي نحن عزل تشريح تحت المجهر. استخدام ناظم البرد لشريحة 8 أقسام ميكرومتر عبر الشرايين يسمح لنا للحصول على أقسام السفينة رقيقة جدا ان طائرات سفينة مختلفة تصور أكثر وضوحا. قطع عبر السفينة بدلا من استخدام قطعة صغيرة السفينة في الاستفادة من عرض أسهل من طبقات العضلات البطانية وسلس. بالإضافة إلى ذلك ، استخدام مجهر مناعي الرقمية مع تمديد البرنامج عمق تنتج صورا واضحة من 10-12 سفينة طائرات مختلفة وأقل كلفة من استخدام مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Estrogen Receptor-Î± in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope at JoVE.com

Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

هدف هذه المقالة هو لاظهار طريقة لتحسين كشف مناعي α من مستقبلات هرمون الاستروجين (ERα) في الشرايين حنوني شرائح الفئران باستخدام المجهر الرقمي مناعي.

تصوير مستقبلات الاستروجين في الشرايين α بيال فأر باستخدام مجهر رقمي مناعي

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

12.3K Views.  Uniformed Services University of the Health Sciences. هدف هذه المقالة هو لاظهار طريقة لتحسين كشف مناعي α من مستقبلات هرمون الاستروجين (ERα) في الشرايين حنوني شرائح الفئران باستخدام المجهر الرقمي مناعي.

Video: Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; التنمية

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

تنفيذ نظام متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS) على تي: الياقوت وOPO بالليزر القائم ستاندرد الليزر الضوئي مجهر

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

التصور النوعي والكمي للطبقة خالية من الخلايا في الشرايين من العضلات الفئران المشمرة

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

بروتوكول الآلي السريع لالعضلات تحليل الألياف السكان في الجرذ العضلات المقاطع العرضية عن طريق سلسلة الميوسين الثقيلة المناعية

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

كشف "يغاندس إستروجين" في "منتجات العناية الشخصية" استخدام "الإستروجين الخميرة الشاشة الأمثل" "المختبر التدريس الجامعي"

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

تقنيات Phenotyping ميكرون-مقياس الذرة حزم وعائية استناداً إلى التصوير المقطعي بالأشعة السينية ميكروكومبوتيد

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

عزل خلايا كبد الفئران الأولية مع التحكم في التروية متعدد المعلمات

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...