העבודה על פרויקט זה נתמך על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות R01-NR5339 ואוניברסיטת שירותי במדים של למדעי הבריאות, R061LD.

1. בידוד הכנת העורקים Pial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד העכברוש הוא להכניס הרדים ומאובטח קטטר לתוך עורק ו perfuse עם 1% אוונס כחול 1X PBS. כלי Pial כתם היטב עם צבע כחול אוונס שהופך אותם קל יותר לבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח לאחסן ב -70 ° C עד הצורך. באופן אופטימלי, המוח צריך להיות מאוחסן לא יותר מ 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח ולהסיר arterioles pial (ממוצע 35-50 מיקרומטר קוטר) מפני השטח של המוח. משוך בזהירות את כל כחול מוכתם arterioles מפני השטח הגבי ו לרוחב של קליפת המוח באמצעות קנס שקצהו מלקחיים. הסרת עודפי רקמת קליפת המוח חסיד לפני הצבת ב מקבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את arterioles שנבצרו paraformaldehyde קר 2% ב 0.1M PBS למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את arterioles עבור חתך לשפוך בינוני הטבעה על הקפאת דיסק / צ&#39;אק (קבוצה ב -20 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עורקיק מקום בסעיף שטוח על צ&#39;אקnd להמתין עד להקפיא. המקום היטב את כלי הימני על הדיסק cryostat הקפאה על הטבעה התקשורת עם קצה של העורק פונה אליך. תחזיק את זה עם פינצטה עד שהוא קפוא היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הדיסק הקפאה עם הכלי לתוך הראש cryostat וחותכים 8 מיקרומטר טבעות עורקיק pial עם cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בסעיפים עורקיק על כרום, אשלגן ג&#39;לטין שקופיות לספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השקופיות מוכן בתיבת שקופיות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li></ol> 2. ER-α Immunofluorescent מכתים יום 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מהמקרר, להביא כל לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את השקופיות לשפוך 1-1.5 מ&quot;ל 0.1M PBS (מספיק כדי לכסות את כל חלקי) בואו לשבת במשך 10 דקות, מסננים וחוזרים על התהליך פעמיים נוספות. כל קצה של השקופית יש סמן הידרופובי. כתוצאה מכך, הנוזל נשאר על פני השטח של השקופית. עם כל נוזל כביסה היא שפכההחוצה והחליפו עם טרי 0.1 M-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שקופיות 1 מ&quot;ל של אמוניום כלוריד 50mm למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להפחית את הקרינה אנדוגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות דקות 0.1M 3x10 PBS. כפי שמתואר 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות חסום 0.1% טריטון X-100 בתוספת 1% נסיוב עז רגילה (NGS) ב-PBS למשך 30 דקות. כדי להפחית את הלא ספציפית מחייב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות עם הנוגדן הראשוני (ארנב polyclonal אנטי ER-α; 1:500) ב-PBS + 0.1% + טריטון X-NGS 1% לילה בשעה 4 ° C. </li></ol> יום 2 <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השקופיות מהמקרר, להביא כל לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות דקות 0.1M 3x10 PBS. כפי שמתואר 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם אורגון גרין 488 ארנבת אנטי משני NGS 1% 0.1% טריטון-X100 + PBS לשעה 2 בחושך בטמפרטורת החדר. מ בשלב זה, הפעולות הבא חייב להיעשות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות דקות 0.1M 3x10 PBS. כפי שמתואר 2.2 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת veמכסה המנוע ntilated, ירידה של מקום 1 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) פלוס מדיה גובר על כלי ולאחר מכן במקום להחליק לכסות על המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מסמר ברור למרק כדי לאטום את הקצוות של להחליק את המכסה. אל תזיז את השקופיות עד יבש לחלוטין, אשר לוקח בערך 24 שעות. </li></ol> 3. Digital Imaging פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה ER-α מכלי pial פרוסה אנו משתמשים Eclipse Nikon 80i מיקרוסקופ דיגיטלי ניאון עם מסננים עבור 3 צבעים (כחול, ירוק ואדום) מצויד במצלמה דיגיטלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את שקופיות שהוכנו עם פלחי מוכתם כלי pial מתחת למיקרוסקופ ולהתאים לדמיין את האזורים שכותרתו fluorescently של עניין. התחל בהגדלה של x100 אז כדי להגדיל הגדלה X600. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במצלמה ללכוד תמונות ב DAPI (כחול) FITC (ירוק) עבור ערוצי גרעיני תאים (DAPI) ו ER-α (אורגון הירוק) באמצעות ניקון תוכנה מורחבת פוקוס עומק להמיר להציג מספרים של מגזרים כלי לתוך 2-D תמונות. </li></ol> 4. נציג תוצאות: אנו מקומי קולטן אסטרוגן α בכלי עורקי pial באמצעות בדיקות ניאון אופטימיזציה להדמיה שלנו של הקולטן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיגיטלית. כדי לזהות נוכחות של הקולטן, נוגדן ארנבת העיקרי polyclonal ו הירוק אורגון 488 נוגדנים משני שכותרתו שימש התמונה קולטנים בעורקים pial מבודד מפני השטח של המוח. כמו כן, גרעיני כתם (DAPI) שימש כדי לזהות את גרעין התא לקבוע אילו יכולנו לזהות קולטנים הממוקמים בגרעין מאז ER-α דווחה להיות נוכח cyotosol את התא לגרעין. בנוסף, אנו מאשרות ניסויים כדי לאמת את הספציפיות של הנוגדן הראשוני כדי לוודא קשירה של משנית הנוגדן הראשוני. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="איור 1"/><br/&gt; באיור 1. מכתים Immunofluorescent עבור ER-α (ירוק) ו counterstaining עם DAPI (כחול) בטבעת עורק pial מבודד המוח חולדה ממין נקבה. איור 1 א &#39;מציג את תמונות הממוזגת להציע את נוכחותם של כמה intranuclear קולטן אסטרוגן (חץ). איור 1B ו 1C הם תמונה ממוקדת של ER-α שהוא שילוב של Z-ערימת תמונות. תמונות צולמו בהגדלה X600 והם מהזירה חתך של כלי השיט באותה מטוסים שונים. החצים מצביעים על קולטן אסטרוגן α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="איור 2"/> באיור 2. מכתים Immunofluorescent לקבוצות לשלוט בטבעת עורק pial מבודד המוח חולדה ממין נקבה. איור 2 ד מציג את כלי בלי נוגדן ראשוני. 2E איור מראה את הספינה ללא נוגדנים המשני (autofluorescence לב מובהק לצד אנדותל). תמונות צולמו בהגדלה X600 והם מהזירה חתך של כלי השיט באותה different מטוסים.

<ol>
	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

הדעות המובאות הן של המחברים ואינן משקפות את המדיניות או העמדה הרשמית של האוניברסיטה שירותים במדים של מדעי הבריאות, משרד ההגנה, או ממשלת ארצות הברית.

בעבר הראינו כי לאחר פגיעה מוחית העולמי איסכמי חולף יכולת העורק pial לשנות בקוטר בתגובה שניהם vasodilators 7, 8 ו 9 vasoconstrictors מדוכא ניכר בחולדות ovariectomized צעירים. גודש אסטרוגן כרונית משחזר התגובות וזומוטורים 7-9. יתר על כן, האסטרוגן עיכוב הופכת את ההשפעות המיטיבות של אסטרוגן על יכולת pial עורק vasodilatory 10 מוביל אותנו לשאלה אם לטווח ארוך דלדול אסטרוגן משפיע על ER-α הצפיפות cerebrovasculature. תכננו להשתמש בשילוב עם תיוג immunofluorescent המערבי סופג כדי להעריך את השינויים בביטוי ER-α בתגובה דלדול אסטרוגן כרונית. כי היו לנו כמה קשיים להדמיה של קבוצות נפרדות של קולטנים שינינו את השיטה שבה אנחנו מדגימים כאן. לכן, המטרה העיקרית שלנו במחקר זה היה הראשון לפתח שיטה פשוטה יחסית, כדי לייעל את הראייהשנפלו על הקרקע הפורייה של קולטנים arterioles pial. בהסכם עם מספר דיווחים 6,11,12 מצאנו לנכון לבצע התאמות עבור סוג של רקמה היינו חיטוט, עובי המדגם, התפלגות ER-α בתוך כלי, כמו גם את מידת הלא ספציפית מחייב . השיטה שלנו מאוד יעיל כדי להמחיש את נוכחותו של ER-α בתוך פרוסות כלי pial. אבל כפי שאחרים ציינו בעבר את השימוש המוצלח של שיטות אלו תלויה מאוד ספציפיות ועל ריכוזים של הנוגדנים, את מיקומו subcellular של חלבונים של קיבוע הריבית, ופרוטוקולים חסימת וטיפול ברקמה 12. לפני ויזואליזציה של כלי ההכנות שלנו בילינו זמן לעבוד על כל אלה משתנים. יש לנו הדגיש כמה אנחנו צריכים לשנות כמה הגישה שלנו במאמר זה. יצאנו באופן אופטימלי לדמיין ER-α ב arterioles pial וזה הציג כמה אתגרים.ראשית, הגודל הממוצע של העורקים עכברוש pial הוא בין 35-50 מיקרומטר ביצוע בידוד והסרה ממשטח המוח מסובך במקצת. מצאנו כי זלוף עם אוונס כחול לצבוע לפני להקריב עושה דיסקציה של העורקים קל. כחול של אוון יכול להשפיע הקרינה, אבל אנחנו מרגישים את היתרון של שימוש לצבוע עולים חסרונות קלים שלה. בפרוטוקול שלנו הכלים נשטפים מספר פעמים. זה ממזער את צבען שיורית הכלים ומקטין את ההשפעות האפשריות של צבע על הקרינה. קושי נוסף נתקלנו היה עובי של המגזרים כלי pial עשה ויזואליזציה ברורה של קולטנים קשה. בנוסף, לא יכולנו לקבל תמונות ברורות במיוחד, כנראה בגלל העובדה ER-α היו פזורים מספר שכבות תאים. ניסינו לעבוד עם פרוסות כלי האורך (כמו אחרים), אך בשל גודל pial קטן היה קשה להתמודד עם הכלים למנוע פיתול של כלי בעת הרכבהבשקופיות גם באמצעות מיקרוסקופ. לבסוף, אנו שונה בהצלחה הטכניקה שלנו באמצעות cryostat חיתוך כלי צולבות חכם ל -8 טבעות מיקרומטר עבה. הטבעות יותר קל לטפל וכמה יכול להיות מותקן בשקופית אחת. לאחר שרכשנו את כלי הרגשנו צורך לבדוק את האפקטיביות של ההבזק הראשון מקפיא את הרקמה אז תיקון כלי כפי שהוצע על ידי Danseshatalb ושותפים 11. אמנם מצאנו immunofluorescence רקע שולית פחות, אנחנו גם ציין כי הקולטנים מוכתמים פחות אינטנסיבי עושה ויזואליזציה של קולטנים קשה יותר. כתוצאה מכך, אנו מעדיפים הראשון להקפיא את המוח כולו לאחסן עד הצורך (בדרך כלל בין 1-2 חודשים). לאחר מכן לשלוף את כלי כמתואר ולתקן את כלי לפני חיתוך עם cryostat. כפי שאנו מראים כאן. אחת היא צעד הכרחי כדי להפעיל פקדי עם ראשוני והן משני הנוגדנים בנפרדכדי לקבוע הספציפיות immunofluorescence רקע. קולטן אסטרוגן α נוגדנים יכול להיות קשה לעבוד איתו. למעשה, ניסינו 3 נוגדנים העיקרי שונים (1 ו 2 חד שבטיים polyclonal) לפני שאנחנו מרוצים ההצלחה של מכתים הקולטן שלנו. במסגרת בקרות שלנו לאמת תחילה את הספציפיות של הנוגדן הראשוני על ידי השמטה של ​​תוספת של הנוגדן הראשוני. איור 2 ד מציג את כלי בלי נוגדן ראשוני. אין מכתים ופשוט אות הרקע מעט. מאז הנוגדן העיקרי הוא polyclonal, יש כמה כתמים מפוזר שאינו ספציפי ברקע. שנית, הוספנו את הנוגדן הראשוני, אך לא את הנוגדן משני (איור 2E). ניתן לראות מרווח יפה המייצג את autofluoresence לאורך גבולות אנדותל של כלי. זה עולה בקנה אחד עם עבודתו של דן וחבריו 5. עם זאת, לא נקודות קטנות של immunofluorescence המייצגים ER-α, ולא נ&quot;צ הופעה פרטניתlecting נוכחות של קולטנים רבים ניתן להבחין ללא שילוב של שני נוגדנים ראשוניים ומשניים. ציינו דפוס מובהק של autofluoresence בשולי האנדותל של כלי הדם. אלו בדיקות עצמאיות עבור סגוליות נוגדנים חשובים כפי שהם מאשרים את הספציפיות של הנוגדן עבור ER-α לבין נוגדנים משני נקשר הראשי. לסיכום, כפי שהוכח על ידי אחרים 4, 5 כלי הדם במוח מכילים מספר רב של ER-α תת סוג הקולטנים. בידיים שלנו, הכנת 8μm פרוסות חתך צלב מן העורקים pial מבודד משפר מכתים ויזואליזציה של הקולטנים. שיטות מסורתיות להשתמש מיקרוסקופיה confocal לבחון את הדגימות. לאחר היכולת להציג קטעי אופטי סדרתי מתוך דגימות עבה היא יתרון חשוב של מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, רכישה של מיקרוסקופ confocal טוב יכול להיות מאוד יקר. באמצעות תוכנה מורחבת (EDF) עומק, מצאנו כייכול להפחית את עלויות הציוד שלנו. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם EDF השגנו תמונות ברורות והם מסוגלים לדמיין pial עורקי ER-α בכמה רמות באמצעות Z-ערימות. יתרון משמעותי של התוכנה EDF היא שזה מאפשר לכידת תמונה באופן יעיל ליצור תמונה 3-D מן התמונות. עבור מעבדות שאין להם גישה מיקרוסקופ confocal או הקרנות לרכוש אחד מיקרוסקופ פלואורסצנטי דיגיטלי עם תוכנה הופקעו עשויה להיות אפשרות מעשית פחות יקר בהתאם המטרות של החוקר.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> אוונס BLUE </td><td> סיגמא </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> סיגמא </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> T353 </td></tr><tr><td> רקמות-Tek מתחם אוקטובר </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> אמוניום כלוריד </td><td> סיגמא </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> עיזים רגיל סרום </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α ארנב polyclonal נוגדן </td><td> סנטה קרוז </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> אורגון 488 ירוק עז נגד ארנב IgG </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield הרכבהבינוני פלואורסצנציה עם DAPI </td><td> וקטור מעבדה </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

רבים מן ההשפעות של אסטרוגן על תגובתיות כלי הדם מתווכות דרך האינטראקציה עם קולטני אסטרוגן 1, 2, 3. אמנם לשתי תת סוגים קיימים (קולטן אסטרוגן α ו β), קולטן אסטרוגן α זוהתה השריר הן חלק בתאי האנדותל של מגזרים עורקי pial באמצעות מכתים פלורסנט בשילוב עם לייזר confocal מיקרוסקופיית 4. יתר על כן, ER-α נמצא הגרעינים ואת בציטופלסמה של basilar העורקים חולדה 5. הקולטנים נמצאים בשפע לזרוח באור בהיר, אבל ברור להדמיה של קבוצות נפרדות של קולטנים קשה כנראה עקב המספרים ממוקם שכבות תאים רבים של קטעי כלי pial. בנוסף, דיווחים רבים תוך שימוש בטכניקות immunohistochemical יחד עם מיקרוסקופיה פרט confocal גרוע בדרישות קריטי עבור שעתוק של ניסויים 6. מטרתנו במאמר זה היא לתאר טכניקה פשוטה כדי לייעל tהוא מכתים ויזואליזציה של ER-α באמצעות חתך פרוסות arterioles pial לקבל מן המוח חולדה ממין נקבה. אנחנו הראשונים perfuse חולדות עם אוונס כחול צבע לזהות בקלות העורקים משטח pial שבו אנו לבודד תחת מיקרוסקופ לנתח. השימוש cryostat לחתוך 8 חתכים מיקרומטר העורקים מאפשרת לנו להשיג חלקים לכלי כל כך רזה כי מטוסים כלי שיט שונים דמיינו יותר בבירור. חיתוך לרוחב כלי השיט, במקום השימוש קטע כלי קטן יש את היתרון של צפייה קלה יותר של שכבות השריר אנדותל וחלק. בנוסף, השימוש של מיקרוסקופ דיגיטלי עם תוכנה immunofluorescent עומק המורחבת מייצרת תמונות ברורות של 10-12 מטוסים כלי שיט שונים הוא יקר פחות מאשר השימוש במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Estrogen Receptor-Î± in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope at JoVE.com

Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה לייעל את זיהוי immunofluorescent של קולטן אסטרוגן α (ERα) על פרוסות עכברוש pial עורקים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי immunofluorescent.

הדמיה של קולטן אסטרוגן α ב Arterioles Pial עכברוש באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי Immunofluorescent

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

12.3K Views.  Uniformed Services University of the Health Sciences. מטרת מאמר זה היא להדגים שיטה לייעל את זיהוי immunofluorescent של קולטן אסטרוגן α (ERα) על פרוסות עכברוש pial עורקים באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי immunofluorescent.

Video: Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

הגדרת מיקרוסקופ גיליון אור פשוט עבור<em&gt; בטוטו</em&gt; הדמיה של<em&gt; ג elegans</em&gt; פיתוח

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

יישום של מערכת קוהרנטית אנטי סטוקס פיזור ראמאן (CARS) על טי: ספיר OPO לייזר מבוסס תקן לייזר מיקרוסקופ סריקה

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

ויזואליזציה וכימות של שכבה חסרת התא ב arterioles של השריר עכברוש Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

זיהוי ליגנדים אסטרוגניים במוצרי טיפוח אישי באמצעות של שמרים אסטרוגן מסך ממוטב עבור המעבדה הוראה לתואר ראשון

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...