O trabalho para este projeto foi suportado por concessões do National Institutes of Health R01-NR5339 e da Universidade Militar de Ciências da Saúde-R061LD.

1. Isolamento e preparação de Artérias Pial <ol><li> Enquanto o rato é inserir anestesiados e segura de um cateter em uma artéria e perfundir com 1% de azul de Evans em 1X PBS. Vasos Pial mancha bem com o corante azul de Evans tornando-os mais fáceis de isolar. </li><li> Extrair o cérebro e armazenar a -70 ° C até serem necessárias. Idealmente, o cérebro deve ser armazenado no máximo 2 meses. </li><li> Usando um microscópio de dissecação remover arteríolas pial (média de diâmetro 35-50 mm) da superfície do cérebro. Retire cuidadosamente todas as arteríolas azul manchado de dorsal e lateral da superfície do córtex usando uma pinça de ponta fina. Remover o tecido cortical aderente excesso antes de colocar no fixador. </li><li> Corrigir as arteríolas colhidas em 2% paraformaldeído em 0,1 M PBS fria por 30 min. </li><li> Para preparar as arteríolas para seccionamento derramar meio de incorporação sobre o congelamento do disco / chuck (set a -20 ° C). </li><li> Seção lugar arteríola plana sobre o mandril umand esperar para congelar. Firmemente colocar o navio-up diretamente no disco congelamento criostato sobre a incorporação da mídia com a ponta da artéria voltado para você. Segure-o com uma pinça até que ela está solidamente congelado. </li><li> Coloque o disco de congelamento com o vaso na cabeça criostato e cortar 8 mM anéis arteríola pial com o criostato. </li><li> Montagem das seções arteríola em cromo-potássio-gelatina slides subbed. </li><li> Armazenar as lâminas preparadas em uma caixa de lâminas na geladeira a 4 ° C durante a noite. </li></ol> 2. ER-α coloração imunofluorescência 1 dia <ol><li> Remover os slides da geladeira; trazer cada à temperatura ambiente. </li><li> Para lavar os slides derramar 1-1,5 ml 0,1 M PBS (o suficiente para cobrir todas as seções) deixe descansar por 10 minutos, escorra e repita o procedimento mais duas vezes. Cada borda do slide tem um marcador hidrofóbicas. Conseqüentemente, o líquido permanece na superfície da lâmina. Com cada lavagem o líquido é derramadopara fora e substituído por novas 0,1 M PBS. </li><li> Incubar as lâminas em 1 ml de cloreto de amônio 50 mM por 30 min em temperatura ambiente para reduzir a fluorescência endógena. </li><li> Lavar as lâminas em 0,1 M min 3x10 PBS. como descrito em 2.2 </li><li> Slides bloco em 0,1% Triton X-100 mais 1% de soro de cabra normal (NGS), em PBS por 30 min. para reduzir a ligação não específica. </li><li> Incubar as amostras com o anticorpo primário (coelho policlonal anti-ER-α; 1:500) em PBS + 0,1% Triton-X + NGS 1% durante a noite a 4 ° C. </li></ol> Dia 2 <ol start="7"><li> Remover os slides da geladeira; trazer cada à temperatura ambiente. </li><li> Lavar as lâminas em 0,1 M min 3x10 PBS. como descrito em 2.2 </li><li> Incube com Oregon Verde 488 secundário anti-coelho na NGS 1% 0,1% Triton-X100 + PBS por 2 horas no escuro a temperatura ambiente. A partir deste passo, os próximos passos devem ser feitas no escuro. </li><li> Lavar as lâminas em 0,1 M min 3x10 PBS. como descrito em 2.2 </li><li> Sob uma vecapa ntilated, gota coloque 1 de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), mais meios de montagem de vasos e em seguida, coloque uma lamínula sobre a amostra. </li><li> Aplicar unha clara polonês para selar as bordas da lamínula. Não mova os slides até que esteja completamente seco, o que leva aproximadamente 24 horas. </li></ol> 3. Fluorescência de Imagem Digital <ol><li> Para imagens de ER-α no vaso pial fatia usamos uma Nikon Eclipse 80i microscópio digital fluorescentes com filtros de 3 cores (azul, verde e vermelho) equipado com uma câmera digital. </li><li> Inserir os slides preparados com o manchado segmentos de navios pial sob o microscópio e ajustar para visualizar as áreas de interesse fluorescente etiquetado. Iniciar com ampliação de x100 x600, em seguida, aumentar para ampliação. </li><li> Use a câmera para capturar imagens em DAPI (azul) e (verde) FITC canais de núcleos celulares (DAPI) e ER-α (Oregon Green) usando software Nikon Foco Extended Profundidade para converter visão múltiplas de segmentos de navios em imagens 2-D. </li></ol> 4. Resultados representativos: Nós localizada receptor de estrogênio α-in pial vasos arteriais utilizando sondas fluorescentes e otimizado nossa visualização do receptor usando microscopia de fluorescência digital. Para detectar a presença do receptor, um anticorpo policlonal de coelho primário e um verde Oregon 488 anticorpo marcado secundário foi utilizado para a imagem dos receptores nas artérias pial isoladas a partir da superfície do cérebro. Além disso, uma mancha nuclear (DAPI) foi utilizado para identificar o núcleo das células e determinar se pudéssemos detectar receptores localizados no núcleo desde ER-α tem sido relatada a estar presente na cyotosol celular e do núcleo. Além disso, realizamos experimentos de confirmação para validar a especificidade do anticorpo primário e verificar ligação do secundário ao anticorpo primário. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Figura 1"/><br/&gt; Figura 1. Coloração imunofluorescência para ER-α (verde) e contracoloração com DAPI (azul) em um anel de artéria pial isolado de cérebro de rato fêmea. Fig. 1A mostra as imagens fundidas, sugerindo a presença de alguns estrogênio receptor intranuclear-a. (Seta) Fig. 1B e 1C são a imagem focalizada de ER-α, que é uma combinação de Z-stack imagens. Imagens foram tiradas no x600 e ampliação são de cortar o anel do mesmo navio em diferentes planos. Setas indicam receptor de estrogênio α. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Coloração imunofluorescência para grupos de controle em um anel de artéria pial isolado de cérebro de rato fêmea. Fig. 2D mostra o navio sem o anticorpo primário. Fig. 2E mostra o navio sem o anticorpo secundário (autofluorescência nota distintas ao longo do lado endotelial). Imagens foram tiradas no x600 e ampliação são de cortar o anel do mesmo navio em difereaviões nt.

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	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

As opiniões expressas são de responsabilidade dos autores e não refletem a política ou posição oficial da Universidade Militar de Ciências da Saúde, o Departamento de Defesa, ou o governo dos Estados Unidos.

Anteriormente, mostrou que, após lesão cerebral isquêmico transitório mundial a capacidade da artéria pial para mudar o diâmetro em resposta a ambos os vasodilatadores 7, 8 e 9 vasoconstritores é marcadamente deprimido em jovens ratas ovariectomizadas. Reposição estrogênica crônica restaura respostas vasomotoras 7-9. Além disso, reposição de estrogênio atrasada reverte os efeitos benéficos do estrogênio sobre a capacidade da artéria pial vasodilatador 10 levando-nos a questionar se a longo prazo a depleção de estrogênio afeta ER-α densidade na cerebrovasculature. Nós planejamos usar a rotulagem de imunofluorescência combinado com western blotting para avaliar mudanças na ER-α expressão em resposta à depleção de estrogênio crônica. Porque tivemos alguma dificuldade na visualização de grupos distintos de receptores que modificou o método que demonstramos aqui. Portanto, o nosso principal objetivo neste estudo foi a primeira a desenvolver um método relativamente simples para otimizar o visualização dos receptores nas arteríolas pial. De acordo com vários relatos 6,11,12 achamos necessário fazer ajustes para o tipo de tecido que estávamos investigando, a espessura da amostra, a distribuição de ER-α no reservatório, bem como o grau de ligação não específica . Nosso método é muito eficaz para visualizar a presença de ER-α em fatias navio pial. Mas como outros já anteriormente apontado o uso bem sucedido desses métodos é altamente dependente da especificidade e concentrações dos anticorpos, a localização subcelular das proteínas de fixação de juros, e protocolos de bloqueio e manipulação de tecidos 12. Antes de visualização de preparações nossa embarcação que passou um tempo para trabalhar fora todas estas variáveis. Temos como destaque precisávamos ajustar algumas da nossa abordagem neste artigo. Partimos para otimizar a visualização ER-α nas arteríolas pial e este apresentou alguns desafios.Primeiro, o tamanho médio de uma artéria de ratos pial é entre 35-50 mM fazer isolamento e remoção da superfície do cérebro um pouco complicado. Descobrimos que a perfusão com Evans blue dye antes do sacrifício torna a dissecção das artérias mais fácil. Evan azul pode afetar de fluorescência, mas sentimos que a vantagem de usar este corante superam as suas desvantagens menor. Em nosso protocolo os vasos são lavadas várias vezes. Isso minimiza o corante residual nos vasos e reduz os possíveis efeitos do corante em fluorescência. Outra dificuldade que encontramos foi a de que a espessura dos segmentos navio pial fez clara visualização dos receptores difícil. Além disso, não poderíamos obter imagens particularmente claro provavelmente devido ao fato de que ER-α foi espalhadas várias camadas de células. Nós tentamos trabalhar com fatias navio longitudinal (como outros), mas devido ao pequeno tamanho pial era difícil lidar com os navios e evitar torção dos vasos durante a montagemem lâminas, mesmo usando um microscópio. Finalmente, conseguimos a nossa técnica modificada usando um criostato e corte o vaso cruz-sábio em a 8 anéis mm de espessura. Os anéis são mais fáceis de manusear e várias podem ser montados em um slide. Uma vez que adquiriu os vasos que sentiu a necessidade de testar a eficácia do primeiro flash congelamento do tecido, em seguida, fixar os vasos como sugerido por Danseshatalb e associados 11. Embora não tenhamos encontrado imunofluorescência fundo um pouco menos, também observou que os receptores manchada menos intensamente tornando a visualização dos receptores mais difícil. Conseqüentemente, nós preferimos primeiro a congelar o cérebro inteiro e armazenar até que seja necessário (geralmente entre 1-2 meses). Em seguida, retire os vasos, como descrito e corrigir os vasos antes de cortar com o criostato. como demonstramos aqui. Um passo necessário é para executar os controles com os dois principais eo anticorpo secundário separadopara determinar a especificidade e imunofluorescência fundo. Receptor de estrogênio α-anticorpos pode ser difícil de trabalhar. Na verdade, tentamos três diferentes anticorpos primários (monoclonal 1 e 2 policlonal) antes estávamos satisfeitos com o sucesso de nossa coloração receptor. Como parte de nossos controles, primeiro verificou a especificidade do anticorpo primário por omissão da adição do anticorpo primário. Figura 2D mostra o navio sem o anticorpo primário. Não há coloração e apenas um sinal de fundo pouco. Uma vez que o anticorpo primário policlonal é, há alguma coloração de fundo difusa não-específicas. Em segundo lugar, acrescentou o anticorpo primário, mas não o anticorpo secundário (Fig. 2E). Pode-se ver uma boa margem representando o autofluoresence ao longo das fronteiras endotelial dos vasos. Isto é consistente com a obra de Dan e associados 5. No entanto, nem os pequenos pontos de imunofluorescência que representam ER-α, nem a ref aparência granularselecionar as presença de receptores numerosos podem ser detectadas sem a combinação de ambos os anticorpos primário e secundário. Observamos um padrão distinto de autofluoresence ao longo das margens endotelial dos vasos. Estes testes independentes para a especificidade de anticorpos são importantes, pois confirmam a especificidade do anticorpo para o ER-α eo anticorpo secundário liga-se ao primário. Em conclusão, como demonstrado por outros 4, 5 vasos sanguíneos do cérebro contêm numerosos ER-α sub-tipo de receptores. Em nossas mãos, preparando 8μm cruz fatias seccional de artérias isoladas pial aumenta coloração e visualização dos receptores. Métodos tradicionais usam microscopia confocal para examinar as amostras. Ter a capacidade de ver seriados óptica a partir de amostras de espessura é um benefício importante da microscopia confocal. No entanto, a compra de um microscópio confocal boa pode ser muito caro. Usando software Extended Profundidade (FED), descobrimos quepoderia reduzir nossos custos de equipamento. Usando um microscópio de fluorescência com a EDF foram obtidas imagens claras e são capazes de visualizar pial arterial ER-α em vários níveis usando Z-stacks. Um benefício significativo do software FED é que ela permite captura de imagem de forma a efetivamente criar uma imagem 3-D a partir das imagens. Para laboratórios que não têm acesso a um microscópio confocal ou os fundos para comprar um microscópio fluorescente digitais com software apropriado pode ser uma opção prática e menos onerosa, dependendo dos objetivos do pesquisador.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Azul de Evans </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> PBS 10X </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Tissue-Tek Compound outubro </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Cloreto de amônio </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Soro normal de cabra </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α anticorpo policlonal de coelho </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon verde 488 de cabra anti IgG de coelho </td><td> Invitrogen </td><td> O-11038 </td></tr><tr><td> Vectashield montagemmeio para fluorescência com DAPI </td><td> Vector Lab </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

Muitos dos efeitos do estrogênio sobre a reatividade vascular são mediados através da interação com receptores de estrogênio 1, 2, 3. Apesar de dois sub-tipos de existir (receptor de estrogênio α e β), receptor de estrogênio α-foi identificado em ambos os músculos do suave e nas células endoteliais da pial segmentos arteriais usando coloração fluorescente combinada com microscopia confocal a laser de varredura 4. Além disso, ER-α está localizado no núcleo e no citoplasma das artérias basilar de ratos 5. Os receptores são abundantes e apresentam forte fluorescência, mas clara visualização de grupos distintos de receptores é difícil provavelmente devido ao número de camadas de células localizadas em muitos dos segmentos de navios pial. Além disso, muitos relatórios utilizando técnicas de imuno-histoquímica emparelhado com microscopia confocal mal detalhe os requisitos críticos para a reprodução de experiências 6. Nosso propósito para este artigo é descrever uma técnica simples para otimizar tele coloração e visualização de ER-α usando transversal fatias de arteríolas pial obter cérebros de ratos do sexo feminino. Nós primeiro perfundir ratos com Evans corante azul para identificar facilmente artérias superfície pial que isolar sob um microscópio de dissecação. Uso de um criostato de cortar 8 mM seções transversais das artérias nos permite obtenção de cortes finos vasos de modo que os aviões navio diferentes são mais bem visualizados. Cortando o navio em vez de usar de um segmento de pequenos vasos tem a vantagem de facilitar a visualização das camadas endoteliais e musculares lisas. Além disso, o uso de um microscópio de imunofluorescência digitais com software prorrogado profundidade produz imagens claras de 10-12 aviões navio diferente e é menos dispendioso do que o uso de um microscópio confocal de varredura a laser.

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Imaging of Estrogen Receptor-&amp;#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

O objetivo deste artigo é demonstrar um método para otimizar a detecção de imunofluorescência de receptor de estrogênio α (ERα) em ratos pial fatias arterial utilizando um microscópio digital de imunofluorescência.

Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

12.4K visualizações.  Uniformed Services University of the Health Sciences. O objetivo deste artigo é demonstrar um método para otimizar a detecção de imunofluorescência de receptor de estrogênio α (ERα) em ratos pial fatias arterial utilizando um microscópio digital de imunofluorescência.

Vídeo: Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Cuidados e limpeza do microscópio

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biologia

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Componentes principais do microscópio de luz

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imagem C. elegans Os embriões utilizando um microscópio de epifluorescência e Software de Código Aberto

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Configurando um Microscópio folha de luz simples para<em&gt; Em Toto</em&gt; Imagem de<em&gt; C. elegans</em&gt; Desenvolvimento

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Implementação de um sistema coerente Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) em Ti: Safira e OPO Laser Based Laser Standard Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Um Protocolo Automatizado Rápido para Muscle Fiber Análise População em músculo secções transversais Usando Cadeia miosina pesada Imunohistoquímica

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine disruption. Estrogenic ligands include both natural and manmade &#34;Environmental Estrogens&#34; (EEs) found in many consumer goods including Personal Care Products (PCPs), plastics, pesticides, and foods. EEs disrupt hormone signaling in humans and other animals, potentially reducing fertility and increasing disease risk. Despite the importance of EEs and other Endocrine Disrupting Chemicals (EDCs) to public health, endocrine disruption is not typically included in undergraduate curricula. This shortcoming is partly due to a lack of relevant laboratory activities that illustrate the principles involved while also being accessible to undergraduate students. This article presents an optimized YES for quantifying ligands in personal care products that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates one of the two colorimetric substrates (ortho-nitrophenyl-&#946;-D-galactopyranoside (ONPG) or chlorophenol red-&#946;-D-galactopyranoside (CPRG)) that are cleaved by &#946;-galactosidase, a 6-day refrigerated incubation step to facilitate use in undergraduate laboratory courses, an automated application for LacZ calculations, and R code for the associated 4-parameter logistic regression analysis. The protocol has been designed to allow undergraduate students to develop and conduct experiments in which they screen products of their choosing for estrogen mimics. In the process, they learn about endocrine disruption, cell culture, receptor binding, enzyme activity, genetic engineering, statistics, and experimental design. Simultaneously, they also practice fundamental and broadly applicable laboratory skills, such as: calculating concentrations; making solutions; demonstrating sterile technique; serially diluting standards; constructing and interpolating standard curves; identifying variables and controls; collecting, organizing, and analyzing data; constructing and interpreting graphs; and using common laboratory equipment such as micropipettors and spectrophotometers. Thus, implementing this assay encourages students to engage in inquiry-based learning while exploring emerging issues in environmental science and health.

This article presents an optimized yeast estrogen screen for quantifying ligands in Personal Care Products (PCPs) that bind estrogen receptors alpha (ER&#945;) and/or beta (ER&#946;). The method incorporates two colorimetric substrate options, a six-day refrigerated incubation for use in undergraduate courses, and statistical tools for data analysis.

Detecção de ligantes estrogênicos em produtos de cuidados pessoal usando uma tela de estrogênio de levedura otimizada para o laboratório de ensino de graduação

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat accumulation (steatosis) and inflammation leading to fibrosis. Preclinical models closely recapitulating human NASH/NAFLD are essential in drug development. While liver biopsy is currently the gold standard for measuring NAFLD/NASH progression and diagnosis in the clinic, in the preclinical space, either collection of whole liver samples at multiple timepoints during a study or biopsy of liver is needed for histological analysis to assess the disease stage.
Conducting a liver biopsy mid-study is an invasive and labor-intensive procedure, and collecting liver samples to assess disease level increases the number of research animals needed for a study. Thus, there is a need for a reliable, translatable, non-invasive imaging biomarker to detect NASH/NAFLD in these preclinical models. Non-invasive ultrasound-based B-mode images and Shear Wave Elastography (SWE) can be used to measure steatosis as well as liver fibrosis. To assess the utility of SWE in preclinical rodent models of NASH, animals were placed on a pro-NASH diet&#160;and underwent non-invasive ultrasound B-mode and shear wave elastography imaging to measure hepatorenal (HR) index and liver elasticity, measuring progression of both liver fat accumulation and tissue stiffness, respectively, at multiple time points over the course of a given NAFLD/NASH study.
The HR index and elasticity numbers were compared to histological markers of steatosis and fibrosis. The results showed strong correlation between the HR index and percentage of Oil Red O (ORO) staining, as well as between elasticity and Picro-Sirius Red (PSR) staining of livers. The strong correlation between classic ex vivo methods and in vivo imaging results provides evidence that shear wave elastography/ultrasound-based imaging can be used to assess disease phenotype and progression in a preclinical model of NAFLD/NASH.

This protocol describes the use of an enhanced ultrasound technique to non-invasively observe and quantify liver tissue changes in rodent models of nonalcoholic fatty liver disease.

Aplicação de Ultrassom e Elastografia de Ondas de Cisalhamento em um modelo de rato de NAFLD/NASH

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...

Methods Article

Imagem de receptor de estrogênio α-in Rat Arteríolas Pial usando um Microscópio Digital imunofluorescência