National Institutes of Health R01-NR5339 hibe ve Sağlık Bilimleri R061LD üniformalı Hizmetleri Üniversitesi tarafından desteklenen bu proje için çalışma oldu.

1. İzolasyon ve Hazırlık pial Arterler <ol><li> Sıçan, anestezi eklemek ve 1 1X PBS içinde% Evans mavisi ile bir arter ve serpmek içine bir kateter güvenli iken. Pial damarların daha kolay izole Evans mavi boya ile leke. </li><li> Gerekli ° C kadar -70 beyin ve mağaza ayıklayın. Optimal, beyinleri, artık 2 ay daha saklanmalıdır. </li><li> Diseksiyon mikroskop kullanarak beynin yüzey pial arteriyollerin (ortalama çapı 35-50 mikron) çıkarın. Dikkatlice ince uçlu forseps kullanarak korteksin dorsal ve lateral yüzeyinden tüm mavi lekeli arteriyollerin çekin. Fiksatif yerleştirmeden önce aşırı yapışık kortikal doku çıkarın. </li><li> % 2 0.1M PBS içinde 30 dakika süreyle soğuk paraformaldehid hasat arteriyollerin sabitleyin. </li><li> Kesit için arteriyollerin hazırlamak için disk donma / mandren (-20 ° C&#39;de) gömme orta dökün. </li><li> Chuck düz Place arteriyol bölümünde And dondurmak için bekleyin. Size dönük olacak şekilde arter ucu ile medya gömme Kriyostat dondurma diskte sıkıca geminin yere kadar doğru. Cımbız ile sağlam donmuş kadar tutun. </li><li> Kriyostat kafasının içine gemi ile donma disk yerleştirin ve Kriyostat ile 8 mikron pial arteriyol halkaları kesmek. </li><li> Krom-potasyum-jelatin Altyazılı slayt Mount arteriyol bölümleri. </li><li> 4 ° C gecede hazırlanan slaytlar slayt kutusunda buzdolabında saklayın. </li></ol> 2. ER-α Immunofluorescent Boyama 1. Gün <ol><li> Slaytlar buzdolabından çıkarın, oda sıcaklığında her getirmek. </li><li> Slaytları yıkamak için 1-1.5 ml 0.1M PBS (tüm bölümleri kapsayacak şekilde), 10 dakika boyunca oturup, drenaj ve iki kat daha fazla işlem tekrar dökün. Slayt her kenarı hidrofobik bir belirteç vardır. Sonuç olarak, slayt yüzeyinde sıvı kalır. Her yıkama sıvı dökülürve taze 0,1 M PBS ile değiştirilir. </li><li> Endojen floresan azaltmak için 50mm amonyum klorür 30 dakika oda sıcaklığında 1 ml slaytlar inkübe edin. </li><li> 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 &#39;de açıklandığı gibi </li><li> % 0.1 Triton-X 100 artı, 30 dakika süreyle PBS% 1 normal keçi serumu (NGS) Blok slaytlar. non-spesifik bağlama azaltmak için. </li><li> Örnekleri PBS +% 0.1 Triton-X geceleme 4 +% 1 NGS ° C; primer antikor (1:500 tavşan poliklonal anti-ER-α) ile inkübe </li></ol> 2. Gün <ol start="7"><li> Slaytlar buzdolabından çıkarın, oda sıcaklığında her getirmek. </li><li> 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 &#39;de açıklandığı gibi </li><li> % 1 NGS karanlıkta, oda sıcaklığında 2 saat boyunca% 0,1 Triton-X100 + PBS Oregon Green 488 ikincil anti-tavşan ile inkübe edin. Bu adım, bir sonraki adımları karanlıkta yapılmalıdır. </li><li> 0.1M PBS 3x10 dk slaytlar yıkayın. 2.2 &#39;de açıklandığı gibi </li><li> Ve altındantilated davlumbaz, 4 &#39;yerine 1 damla, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) artı sonra montaj gemilerin medya ve numune üzerinden bir kapak slip yerleştirin. </li><li> Kapak kayma kenarları mühür Açık tırnak cilası sürün. Yaklaşık 24 saat sürer slaytlar, tamamen kuruyana kadar hareket etmeyin. </li></ol> 3. Dijital Floresans Görüntüleme <ol><li> Pial damar görüntüleme ER-α biz bir dijital kamera ile donatılmış 3 renk (mavi, yeşil ve kırmızı) için filtreler ile Nikon Eclipse 80i dijital floresan mikroskop kullanmak dilim için. </li><li> Lekeli pial damar kesimleri ile mikroskop altında hazırlanan slaytlar takın ve ilgi floresan ile işaretlenmiş alanları görselleştirmek için ayarlamak. Sonra x600 büyütme artış x100 büyütme başlayın. </li><li> Çoklu görünüm dönüştürmek için DAPI (mavi) ve hücre çekirdekleri (DAPI) ve Nikon Genişletilmiş Derinlik Odak yazılımı kullanarak ER-α (Oregon Yeşil) FITC (yeşil) kanalları görüntüleri yakalamak için fotoğraf makinesini kullanın2-D görüntü içine damar segmentlerinin. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Biz flüoresan millerini kullanarak pial arter damarlarında lokalize östrojen reseptör-α ve reseptör dijital floresan mikroskobu kullanarak görselleştirme optimize. Reseptör, bir tavşan poliklonal primer antikor ve bir Oregon Green 488 etiketli ikincil antikor görüntü beynin yüzey izole pial arterlerde reseptörleri için kullanılan varlığını saptamak için. Ayrıca, nükleer bir leke (DAPI) hücre çekirdekleri tespit ve ER-α hücre cyotosol ve çekirdeğinde bulunan rapor beri çekirdeğinde bulunan reseptörleri tespit eğer belirlemek için kullanılmıştır. Buna ek olarak, birincil antikor özgüllüğü doğrulamak ve doğrulayıcı birincil antikor ikincil bağlayıcı doğrulamak için deneyler yaptılar. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig1.jpg" alt="Şekil 1"/><br/&gt; Şekil 1 Immunofluorescent ER-α için boyama (yeşil) ve kadın sıçan beyin izole bir pial arter halka DAPI (mavi) ile counterstaining. Şekil 1A, bazı intranükleer östrojen varlığını düşündüren Birleştirilen görüntülerin reseptör-a (ok). Şekil 1B ve 1C, Z-yığın görüntüler bir arada ER-α odaklı görüntü. Görüntüler x600 büyütme ve farklı düzlemlerde aynı geminin kesim halka. Oklar östrojen reseptör-α göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/3203/3203fig2.jpg" alt="Şekil 2"/> Şekil 2 kadın sıçan beyin izole bir pial arter halka kontrol grupları için Immunofluorescent boyama. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Şekil 2E ikincil antikor olmadan (endotel tarafı boyunca notu farklı otofloresans) damar gösterir. Görüntüler x600 büyütme ve differe aynı geminin kesim halkant uçaklar.

<ol>
	<li>Smiley, D. A., Khalil, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+compounds,+estrogen+receptors+and+vascular+cell+signaling+in+the+aging+blood+vessels.">Estrogen compounds, estrogen receptors and vascular cell signaling in the aging blood vessels.</a> Curr. Med. Chem. 16, 1863-1887 (2009).</li><li>Miller, V. M., Duckles, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+actions+of+estrogens:+functional+implications.">Vascular actions of estrogens: functional implications.</a> Pharmacol. Rev. 60, 210-241 (2008).</li><li>Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrovascular+effects+of+oestrogen:+multiplicity+of+action.">Cerebrovascular effects of oestrogen: multiplicity of action.</a> Clin. Exp. Parmacol. Physiol. 34, 801-808 (2007).</li><li>Stirone, C., Duckles, S. P., Krause, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+estrogen+receptor-a+incerebral+blood+vessels:+regulation+by+estrogen.">Multiple forms of estrogen receptor-a incerebral blood vessels: regulation by estrogen.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E184-E192 (2003).</li><li>Dan, P., Cheung, J. C., Scriven, D. R., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope-dependent+localization+of+estrogen+receptor-alpha,+but+not+-beta,+in+en+face+arterial+endothelium.">Epitope-dependent localization of estrogen receptor-alpha, but not -beta, in en face arterial endothelium.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284, 1295-1306 (2003).</li><li>Fritschy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+my+antibody+staining+specific?+How+to+deal+with+pitfalls+of+immunohistochemistry.">Is my antibody staining specific? How to deal with pitfalls of immunohistochemistry.</a> Eur. J. Neurosci. 28, 2365-2370 (2008).</li><li>Watanabe, Y., Littleton-Kearney, M. T., Traystman, R. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+post-ischemic+pial+and+microvascular+dilation.">Estrogen restores post-ischemic pial and microvascular dilation.</a> Am. J. Physiol. Heart and Circ. 281, H155-H160 (2001).</li><li>Li, M., Zeynalov, E., Li, X., Miyazaki, C., Koehler, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+estrogen+on+postischemic+pial+artery+reactivity+to+ADP.">Effects of estrogen on postischemic pial artery reactivity to ADP.</a> Microcirculation. 16, 403-413 (2009).</li><li>Qin, X. Y., Hurn, P. D., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+restores+postischemic+sensitivity+to+thromboxane+mimetic+U46619+in+rat+pial+artery.">Estrogen restores postischemic sensitivity to thromboxane mimetic U46619 in rat pial artery.</a> Cereb. Blood. Flow. Metab. 25, 1041-1046 (2005).</li><li>Miyazaki, C., Koelher, R. C., Littleton-Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+HET0016+and+estrogen+on+pial+artery+vasodilatory+capacity.">Effects of HET0016 and estrogen on pial artery vasodilatory capacity.</a> FASEBJ Abstracts. , (2007).</li><li>Daneshtalab, N., Dore, J. J. E., Smeda, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection:+procedures+in+immunohistochemical+studies.">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: procedures in immunohistochemical studies.</a> J. Pharmacol. Toxical. Methods. 61, 127-135 (2010).</li><li>Lorincz, A., Nusser, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+immunoreactants.">Specificity of immunoreactants.</a> J. Neurosci. 28, 9083-9086 (2008).</li></ol>

Ifade edilen görüşler yazarlarına aittir ve üniformalı Hizmetler Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Savunma Bakanlığı, ya da Amerika Birleşik Devletleri hükümeti, resmi politika veya konumunu yansıtmamaktadır.

Daha önce, geçici global iskemik beyin hasarı sonrası vazodilatörler 7, 8 ve vazokonstriktörlere 9 yanıt olarak çapını değiştirmek için pial arter kapasitesi belirgin genç ovarektomize sıçanlarda depresif olduğunu gösterdi. Kronik östrojen replasmanı vazomotor yanıtları 7-9 geri yükler. Ayrıca, östrojen replasman gecikme, bize uzun süreli östrojen eksikliği cerebrovasculature ER-α yoğunluğu etkileyip etkilemediğini sorgulamaya yol açan pial arter vazodilatör kapasitesi 10 östrojen yararlı etkilerini tersine çevirir . Biz batı kronik östrojen tükenmesi yanıt ER-α ifade değişiklikleri değerlendirmek için blot ile birlikte immunofluorescent etiketleme kullanılması planlandı. Reseptörleri ayrık gruplar görselleştirme bazı zorluk vardı Çünkü biz burada göstermek yöntemi değiştirilebilir. Bu nedenle, bu çalışmada birincil hedefimiz ilk görsel optimize etmek için nispeten basit bir yöntem geliştirmek içinpial arteriollerde reseptörleri Ag + referans. Çeşitli raporlar ile anlaşma 6,11,12 biz problama doku tipi için ayarlamalar, örnek kalınlığı, gemi ER-α dağılımı yanı sıra non-spesifik bağlayıcı derecesi yapmak için gerekli bulundu. . Bizim metodumuz pial gemi dilimleri ER-α varlığı görselleştirmek için çok etkili. Ancak diğerleri bu yöntemlerin başarılı kullanımı, daha önce belirttiğimiz gibi antikorların özgüllük ve konsantrasyonları, faiz, fiksasyon ve engelleme protokolleri ve doku taşıma 12 proteinlerin hücre içi konumu son derece bağlıdır. Geminin hazırlıkları görselleştirme önce biz tüm bu değişkenler zaman geçirdim. Biz nasıl biz bu yazıda bazı yaklaşım ayarlamak için gerekli sermiştir. Optimal pial arteriyollerin ER-α görselleştirmek için yola çıkan ve bu birkaç zorluklar sundu.Birincisi, bir sıçan pial arter ortalama büyüklüğü 35-50 mikron arasında beyin yüzeyinden izolasyon ve çıkarılması biraz zor. Biz Evans mavi boya öncesi kurban etmek daha kolay damar diseksiyonu yapar perfüzyon bulundu. Evan mavi floresan etkileyebilir, ancak biz bu boya kullanılarak avantajı küçük dezavantajları fazla olduğunu hissediyorum. Protokolde gemilerin birkaç kez yıkanır. Bu gemilerin içinde kalan boya ve floresan boya olası etkilerini en aza indirir azaltır. Karşılaştığımız bir diğer zorluk pial damar segmentlerinin kalınlığı zor reseptörler açık görselleştirme yapılmış olmasıydı. Ayrıca, muhtemelen birçok hücre katmanları ER-α dağılmış olduğu gerçeğini nedeniyle, özellikle net görüntüler elde edemezler. Uzunlamasına damar dilimleri (diğerleri gibi) ile çalışan çalıştı, ancak montaj sırasında küçük pial boyutu nedeniyle gemilerin işlemek ve gemilerin sıkılmasını önlemek zorduhatta bir mikroskop kullanılarak slides on. Son olarak, başarılı bir Kriyostat kullanarak ve 8 mikron kalınlığında halkalar çapraz damar kesme tekniği değiştirilmiş. Halkalar kolay ve çeşitli bir slayt monte edilebilir. Bir kere biz, biz sonra gemilerin tespit Danseshatalb ve ark 11 tarafından önerilen doku dondurma ilk flaş etkinliğini test etmek üzere gerekli hissettim gemilerin satın aldı . Marjinal olarak daha az arka plan immünofloresan rağmen, biz de reseptörleri daha az yoğun görselleştirme reseptörlerinin daha zor hale boyanmış olduğunu kaydetti. Sonuç olarak, (genellikle 1-2 ay arasında) kadar gerekli tüm beyin dondurmak ve saklamak için ilk tercih. Daha sonra gemilerin açıklandığı gibi çekin ve gemilerin Kriyostat dilimleme önce düzeltmek. Burada göstermek gibi. Bir birincil ve ikincil antikor ayrı ayrı hem de denetimlerini çalıştırmak için gerekli bir adımözgüllük ve arka plan immünofloresan belirlemek için. Östrojen reseptör-α antikorları ile çalışmak zor olabilir. Reseptör boyanması başarı ile memnun önce Aslında, biz 3 farklı birincil antikorlar (1 monoklonal ve poliklonal 2) çalıştı. Kontrollerin bir parçası olarak, öncelikle birincil antikor yanı sıra ihmal birincil antikor özgüllük doğrulandı. Şekil 2D primer antikor olmadan geminin gösterir. Herhangi bir boyama ve sadece küçük bir arka plan sinyali vardır. Birincil antikor poliklonal olduğundan, bazı diffüz non-spesifik bir arka plan boyama vardır. İkincisi, biz birincil antikor eklendi, ancak ikincil antikor (Şekil 2E). Bir damarların endotel sınırları boyunca autofluoresence temsil eden güzel bir marj görebilirsiniz. Bu çalışma ile Dan ve iştirakçi 5 tutarlı. Ancak, ER-α temsil immünofloresan küçük noktaların, ne de granüler bir görünüm ref nesayısız reseptörlerinin varlığı lecting birincil ve ikincil antikorlar hem de birleşimi olmadan tespit edilebilir. Biz farklı bir desen damarların endotel kenarları boyunca autofluoresence kaydetti. ER-α antikor özgüllük onaylamak ve ikincil antikor birincil bağlar antikor özgüllük Bu bağımsız testler önemlidir. Sonuç olarak, diğerleri 4 gösterdiği gibi, 5 beyin kan damarları çok sayıda ER-α alt-tipi reseptörler içerir . Bizim ellerde, izole pial arterlerden 8μm kesit dilimleri hazırlanıyor reseptörlerinin boyama ve görselleştirme artırır. Geleneksel yöntemler örnekleri incelemek konfokal mikroskopi kullanın. Konfokal mikroskopi kalın kesitlerle seri optik bölümleri görüntülemek için kapasitesine sahip önemli bir yararı. Ancak, iyi bir konfokal mikroskop satın alma, çok pahalı olabilir. Genişletilmiş Derinlik (EDF) yazılımı kullanılarak, biz bulundu.ekipman maliyetleri azaltabilir. EDF ile floresan mikroskop kullanarak, net görüntüler elde edilir ve Z-yığınları kullanarak çeşitli düzeylerde pial arteriyel ER-α görselleştirmek mümkün. EDF yazılım önemli bir yararı, bir şekilde etkili görüntüleri 3 boyutlu bir resim oluşturmak için görüntü yakalama izin verir. Konfokal mikroskop ya da fonların bir tahsis yazılımı ile dijital floresan mikroskop satın almak için erişimi olmayan laboratuarlar için araştırmacının hedeflerine bağlı olarak pratik ve daha az maliyetli bir seçenek olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifi Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> EVANS MAVİ </td><td> Sigma </td><td> E-2129 </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> Sigma </td><td> P-5493 </td></tr><tr><td> Paraformaldehit </td><td> Fisher Scientific </td><td> T353 </td></tr><tr><td> Doku-Tek Ekim Bileşik </td><td> VWR </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Amonyum klorid </td><td> Sigma </td><td> A9434 </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T9284 </td></tr><tr><td> Normal Keçi Serumu </td><td> Invitrogen </td><td> 16210-064 </td></tr><tr><td> ER-α tavşan poliklonal antikor </td><td> Santa Cruz </td><td> H-184 </td></tr><tr><td> Oregon yeşil 488 keçi anti-tavşan IgG </td><td> Invitrogen </td><td> O-11.038 </td></tr><tr><td> Vectashield montajorta DAPI ile floresans </td><td> Vektör Lab. </td><td> H-1200 </td></tr></tbody></table>

imaging of estrogen receptor-&alpha; in rat pial arterioles using a digital immunofluorescent microscope

Birçok vasküler reaktivite östrojen etkileri, östrojen reseptörleri 1, 2, 3 ile etkileşimi aracılığıyla . Iki alt türleri (östrojen reseptör-α ve β) mevcut olmasına rağmen, östrojen reseptör-α hem düz kas ve endotel hücreleri konfokal lazer tarama mikroskopisi 4 ile birlikte floresan boyama kullanarak pial arter segmentlerinin tespit edilmiştir. Ayrıca, ER-α çekirdekleri ve sıçan baziler arterler 5 sitoplazmasında yer almaktadır. Bol reseptörleri ve parlak floresan, ancak ayrık gruplar reseptörler açık görselleştirme olasılıkla pial damar segmentinin birçok hücre katmanları bulunan numaralar nedeniyle zordur. Ayrıca, immünohistokimyasal teknikler kullanarak çok sayıda rapor kötü konfokal mikroskopi ayrıntılı deneyler 6 çoğaltılması için kritik gereksinimleri ile eşleştirilmiş. Bu makalede amacımız t optimize etmek için basit bir tekniği tarif etmek içinER-α boyama ve görselleştirme, kadın sıçan beyinlerinde elde pial arteriyollerin kesitsel dilim kullanarak. Önce bir diseksiyon mikroskobu altında izole yüzey pial arterler kolaylıkla belirlemek için Evans mavi boya ile sıçan serpmek. Arterlerin 8 mikron kesitler dilim Kriyostat farklı gemi uçaklar daha net görselleştirildiği ince damar bölümleri elde etmek için sağlar. Küçük bir damar segmentinin kullanmak yerine gemi boydan boya kesen, endotelyal ve düz kas tabakaları daha kolay izleme bir avantaja sahiptir. Buna ek olarak, uzun derinliği yazılım 10-12 farklı damar uçakların net görüntüler üretir ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanımı daha az masraflı olan bir dijital immunofluorescent mikroskop kullanımı.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging of Estrogen Receptor-ÃŽÂ± in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope at JoVE.com

Imaging of Estrogen Receptor-&#945; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Bu makalenin amacı, dijital bir immunofluorescent mikroskop kullanılarak sıçan pial arteriyel dilim östrojen reseptör-α immunofluorescent algılama (ERα) optimize etmek için bir yöntem göstermektir.

Rat pial arteriollerde Östrojen Reseptör-α Dijital Immunofluorescent Mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

Many of estrogen's effects on vascular reactivity are mediated through interaction with estrogen receptors 1, 2, 3. Although two sub-types exist (estrogen ...

imaging-estrogen-receptor-rat-pial-arterioles-using-digital

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging of Estrogen Receptor-&alpha; in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

12.4K Görüntüleme.  Uniformed Services University of the Health Sciences. Bu makalenin amacı, dijital bir immunofluorescent mikroskop kullanılarak sıçan pial arteriyel dilim östrojen reseptör-α immunofluorescent algılama (ERα) optimize etmek için bir yöntem göstermektir.

Video: Imaging of Estrogen Receptor-α in Rat Pial Arterioles using a Digital Immunofluorescent Microscope

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

Mikroskop Uygun Bakım ve Temizlik

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Biyoloji

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Using Digital Image Correlation to Characterize Local Strains on Vascular Tissue Specimens

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and product development. Stress-strain relationships are typically obtained from mechanical testing data to enable comparative assessment among samples and in some cases identification of constitutive mechanical properties. However, errors may be introduced through the use of average strain measures, as significant heterogeneity in the strain field may result from geometrical non-uniformity of the sample and stress concentrations induced by mounting/gripping of soft tissues within the test system. When strain field heterogeneity is significant, accurate assessment of the sample mechanical response requires measurement of local strains. This study demonstrates a novel biomechanical testing protocol for calculating local surface strains using a mechanical testing device coupled with a high resolution camera and a digital image correlation technique. A series of sample surface images are acquired and then analyzed to quantify the local surface strain of a vascular tissue specimen subjected to ramped uniaxial loading. This approach can improve accuracy in experimental vascular biomechanics and has potential for broader use among other native soft tissues, engineered soft tissues, and soft hydrogel/polymeric materials. In the video, we demonstrate how to set up the system components and perform a complete experiment on native vascular tissue.

We describe the use of digital image correlation to characterize the local surface strain field on vascular tissue samples subjected to uniaxial tensile testing. These measurements facilitate precise quantification of the sample mechanical response and the generation of constitutive stress-strain relations.

Dijital Görüntü Korelasyon kullanma Vasküler Doku Örneklerinin Yerel düzensizliğin karakterize etmek

Characterization of the mechanical behavior of biological and engineered soft tissues is a central component of fundamental biomedical research and ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

Sapphire ve OPO Lazer Bazlı Standart Lazer Tarama Mikroskobu: Bir Ti bir Tutarlı Anti-Stokes Raman saçılması (CARS) Sisteminin Uygulanması

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo cell-free layer width and its spatiotemporal variations can provide a comprehensive understanding of hemodynamics in microcirculation. In this study, we used an intravital microscopic system coupled with a high-speed video camera to quantify the cell-free layer widths in arterioles in vivo. The cremaster muscle of Sprague-Dawley rats was surgically exteriorized to visualize the blood flow. A custom-built imaging script was also developed to automate the image processing and analysis of the cell-free layer width. This approach enables the quantification of spatiotemporal variations more consistently than previous manual measurements. The accuracy of the measurement, however, partly depends on the use of a blue filter and the selection of an appropriate thresholding algorithm. Specifically, we evaluated the contrast and quality of images acquired with and without the use of a blue filter. In addition, we compared five different image histogram-based thresholding algorithms (Otsu, minimum, intermode, iterative selection, and fuzzy entropic thresholding) and illustrated the differences in their determination of the cell-free layer width.

This study demonstrates the surgical preparation of the rat cremaster muscle for the visualization of the in vivo cell-free layer. Considerable factors affecting the accuracy of the cell-free layer width measurement are discussed in this study.

Sıçan Cremaster&#39;ın Muscle arteriyollerde Hücre-serbest Katman Görselleştirme ve

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle composition. Various time-consuming methods have traditionally been used to study fiber populations in many fields of research. However, recently developed immunohistochemical methods based on myosin heavy chain protein expression provide a quick alternative to identify multiple fiber types in a single section. Here, we present a rapid, reliable and reproducible protocol for improved staining quality, allowing automatic acquisition of whole cross sections and automatic quantification of fiber populations with ImageJ. For this purpose, embedded skeletal muscles are cut in cross sections, stained using myosin heavy chains antibodies with secondary fluorescent antibodies and DAPI for cell nuclei staining. Whole cross sections are then scanned automatically using a slide scanner to obtain high-resolution composite pictures of the entire specimen. Fiber population analyses are subsequently performed to quantify slow, intermediate and fast fibers using an automated macro for ImageJ. We have previously shown that this method can identify fiber populations reliably to a degree of &#177;4%. In addition, this method reduces inter-user variability and time per analyses significantly using the open source platform ImageJ.

Here, we present a protocol for rapid muscle fiber analyses, which allows improved staining quality, and thereby automatic acquisition and quantification of fiber populations using the freely available software ImageJ.

Miyosin Ağır Zincir İmünohistokimya kullanma Sıçan kas Çapraz Bölüm kas Elyaf Nüfus Analizi İçin Hızlı Otomatik Protokolü

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Micron-scale Phenotyping Techniques of Maize Vascular Bundles Based on X-ray Microcomputed Tomography

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a 'sample preparation protocol' for maize materials (i.e., stem, leaf, and root) suitable for ordinary microcomputed tomography (micro-CT) scanning. Based on high-resolution CT images of maize stem, leaf, and root, we describe two protocols for the phenotypic analysis of vascular bundles: (1) based on the CT image of maize stem and leaf, we developed a specific image analysis pipeline to automatically extract 31 and 33 phenotypic traits of vascular bundles; (2) based on the CT image series of maize root, we set up an image processing scheme for the three-dimensional (3-D) segmentation of metaxylem vessels, and extracted two-dimensional (2-D) and 3-D phenotypic traits, such as volume, surface area of metaxylem vessels, etc. Compared with traditional manual measurement of vascular bundles of maize materials, the proposed protocols significantly improve the efficiency and accuracy of micron-scale phenotypic quantification.

We provide a novel method to improve the X-ray absorption contrast of maize tissue suitable for ordinary microcomputed tomography scanning. Based on CT images, we introduce a set of image-processing workflows for different maize materials to effectively extract microscopic phenotypes of vascular bundles of maize.

X-ışını Microcomputed tomografi üzerinde dayalı Mısır Vaskular demetleri mikron çaplı fenotipleme teknikleri

It is necessary to accurately quantify the anatomical structures of maize materials based on high-throughput image analysis techniques. Here, we provide a ...