The authors would like to thank Drs. Roger Cone and Chao Zhang for their contributions to validating the application of this assay as previously published. This work was supported by NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للجامعة أريزونا مكتب للسلوك المسؤول من البحوث وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي 1. تربية اسماك الزرد والصيانة الأجنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد E3 المتوسط ​​الجنين 8. جعل 60X حل سهم، ويحل 34.8 غرام كلوريد الصوديوم، 1.6 غرام بوكل، 5.8G CaCl 2 ● 2H 2 O، و9.78 ز MgCl 2 ● 6H 2 O في 1.95 L ddiH 2 O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك ضبط مستوى الصوت إلى 2 لتر باستخدام ddiH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد 1X E3 المتوسط ​​الجنين، وتمييع 16.5 مل 60X الأسهم في 1 L ddiH20. إضافة 100 ميكرولتر 1٪ الميثيلين الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منزل ذكر وأنثى الأسهم الحضنة (7-18 شهرا من العمر) على حدة لتحقيق أقصى قدر من الخصوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحويل الأنوار 1-2 ساعة قبل يوم قبل أن يتم المطلوب البيض. إعداد التزاوج (1 الذكور و1-2 إناث) في جأقفاص rossing كما هو موضح سابقا 9. أقفاص عبور تسمح للبيض للهروب الافتراس لأنها تمر من خلال قاعدة مثقبة من إدراج دبابات التي تقام في الأسماك البالغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لتربية الموقوتة، (كما ستكون هناك حاجة لدراسات شملت morpholino حقن)، فصل الذكور والإناث الأسماك التي كتبها مقسم البلاستيك الشفاف، إزالة هذا في الصباح أن يؤدي إلى زرع توقيت البيض والإخصاب. لmorpholino الدراسات وإجراء عمليات حسابية القدرة على تقييم عدد من الأسماك الجنينية المطلوبة لكل معاملة. دون تقدير لحجم تأثير أو الاختلاف، يمكن تشغيل محاكمة الأولية مع ن = 8. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب البيض من القفص معبر في طبق بتري (100-150 الأجنة / 10 سم طبق بتري). السماح للبيض لتستقر في قاع الطبق وتخلصي من الماء. إزالة أي المياه المتبقية باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة. إضافة مرة أخرى E3 المتوسط ​​الجنين في الخطوة 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل بالعربيةعرجاء ماصة المتاح مصقول للبيضة في المستقبل، ونقل الأسماك. باستخدام مقص، وقطع نقل المتاح ماصة تخرج في تخريج 0.25 مل. لإزالة حواف خشنة، والبولندية لهب قطع أكثر من طرف على موقد بنسن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الأسماك الجنينية إلى 4 أيام بعد الإخصاب (إدارة الشرطة الاتحادية) في 10 سم أطباق بتري في الزرد المتوسطة E3 الجنين في 28.5 ○ C. كل يوم مرتين، واستخدام اللهب مصقول تخرج نقل المتاح ماصة لإزالة أي بويضة غير مخصبة أو الأجنة الميتة (ظهور الأبيض مبهمة). مرة واحدة كل يوم، استبدال E3 المتوسط ​​الجنين. تخلصي E3 المتوسط ​​الجنين، وإزالة السائل المتبقي باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة، وإضافة مرة أخرى قبل تحسنت (28.5 ○ C) E3 المتوسط ​​الجنين. </li></ol> 2. إعداد الفحص الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير محلول الفحص وفقا للجدول 1. محلول معقم مرشح فحص باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر. قبل لفحص بدء، تدفئة حل فحص العقيمة في 28.5 ○ Cحمام الماء. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصر </td><td> ٪ من إجمالي </td><td> الحجم (ميكرولتر / 10 مل) </td></tr><tr><td> 60X E3 الأجنة المتوسطة </td><td> 1،667 </td><td> 166.7 </td></tr><tr><td> منزوع الأيونات المزدوج (DDI) H 2 0 </td><td> 96،233 </td><td> 9623.3 </td></tr><tr><td> الامار الأزرق </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 ملي هيدروكسيد الصوديوم </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الفحص المتوسطة 3. إجراء الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأجنة الزرد 3 مرات مع العقيمة التي تمت تصفيتها E3 المتوسط ​​الجنين. الجمع بين جميع الأجنة الزرد قابلة للحياة من مخلب في دورق. تصفية العقيمة 75 مل E3 المتوسط ​​الجنين. باستخدام طرف غرامة نقل المتاح ماصة، وإعادةنقل أكبر قدر من المتوسط ​​الجنين E3 من الأجنة الزرد وقت ممكن. إضافة إلى الوراء 20 مل العقيمة التي تمت تصفيتها E3 المتوسط ​​الجنين. إزالة واستبدال E3 المتوسط ​​الجنين 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 1 الأسماك في كل من 93 بئرا من الأسود 96-جيدا وقفت أسفل لوحة واضحة. نقل الأسماك الجنينية لوحة من قبل التقاط فردي الجنين داخل اللهب مصقول تخرج من البلاستيك القابل للتصرف نقل ماصة (الخطوة 1.5) وإخراج بلطف في البئر. نقل E3 المتوسط ​​الجنين المأخوذة من دورق يحتوي على الأسماك تشطف في 3 آبار فارغة. هذا يضمن أن بئر فارغة تعرضوا لنفس الماء بالضبط كما الآبار التي تحتوي على الأسماك. يجب على الآبار التي تحتوي على الأسماك والآبار فارغة تكون على الاقل ½ الكامل (200 ميكرولتر) في ختام هذه الخطوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال E3 الجنين المتوسطة مع الحل فحص في جميع الآبار 96، بما في ذلك آبار فارغة. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة 1 عمود في وقت لكل من الأعمدة 12 في 96 لوحة جيدا. باستخدام طرف غرامة التخلص منها عبرفر ماصة، وإزالة E3 المتوسط ​​الجنين من كل جيدا في عمود واحد من لوحة (8 آبار). الحرص على عدم لمس الجنين الزرد. إضافة 300 ميكرولتر من محلول الفحص على كل جانب من التي تمت إزالة المياه. تكرار إزالة E3 المتوسط ​​الجنين واستبدال مع حل فحص لجميع الأعمدة 12 لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: لاختبار تغير معدل الأيض ردا على المجمع، وجعل الحل الذي هو 100 مرات (100X) تركيز العلاج المطلوب. من المذكرة، وضمان أن الحل 100X لا يتجاوز 10٪ DMSO للحد من تركيز DMSO النهائية بما لا يزيد عن 0.1٪. إضافة 3 ميكرولتر من الحل 100X إلى كل من الآبار العلاج. ملاحظة: إجراء العمليات الحسابية القدرة على تقييم عدد من الآبار العلاج. ومع ذلك، من دون تقدير لحجم الاستجابة أو الاختلاف، يمكن تشغيل محاكمة تمهيدية في 8 مجمع المعالجة و8 مركبة تعامل آبار المراقبة التي تحتوي على الأسماك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر من السيطرة على السيارة لسيطرة (لا دروز العلاج) الآبار التي تحتوي على الأسماك. لضمان الاستجابة الفلورسنت إلى المركب هو نتيجة للإجراءات داخل الأسماك، وتطبيق العلاجات الدوائية والمركبات إلى 3 آبار فارغة في 96 لوحة جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الأسماك شغل وحة على قارئ لوحة الفلورسنت مع الطول الموجي الإثارة في 530 نانومتر والطول الموجي الانبعاثات في 590 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان لوحة في حاضنة ترطيب مجموعة إلى 28.5 ○ C (الحفاظ على لوحة في الظلام طوال فحص لتجنب photobleaching من محلول الفحص). يمكن تشغيل مقايسة لفترات من الزمن تتراوح من 1 ساعة إلى 24 ساعة. مدة الاختبار يعتمد على الهدف من الدراسة. لاختبار استجابة لمركب غير مستقر قصير المفعول قد تكون قصيرة المدة الأنسب. بعد، لاختبارات مجمع مستقرة أو اختبارات التأثيرات الجينية، وتعظيم مدة الفحص هو الأفضل لاستغلال المزايا المرتبطة إشارة تراكمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نقطة زمنية محددة مسبقا (انظر الخطوة 3.6 للمساعدة في تحديد التوقيت)قراءة مضان لوحة مليئة الأسماك مرة أخرى مع نفس الإعدادات كخطوة 3.5. </li></ol> 4. تقييم التغير النسبي في الإسفار أسوشيتد مع العلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب التغير في مضان من كل بئر من خلال طرح مضان في وقت 0 من مضان في ختام الدراسة. يجب آبار بلا الأسماك (الفراغات) لديها قيم بالقرب من 0، أقل بكثير من القيم من الآبار التي تحتوي على الأسماك. تغيير في الإسفار = الإسفار في ختام - مضان في وقت 0 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتأكد من التغير النسبي في مضان، وحساب متوسط ​​التغير في مضان لآبار المراقبة ثم يقسم التغير في مضان من كل بئر من متوسط ​​التغير في مضان من آبار المراقبة. وتجدر الإشارة، يمكن التحكم تكون إما الضوابط سيارة أو الضوابط الوراثية. <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li><li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter/driver+genes+by+CRISPR/Cas9-mediated+genome+engineering.">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545 (2014).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li><li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile.">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li><li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish.">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li><li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals.">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li><li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish.">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li><li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment.">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Zebrafish, A practical approach. , (2002).</li><li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature.">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li><li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity.">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li><li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost.">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li><li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner.">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li><li>Flynn, E. J., Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+(Danio+rerio).">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li><li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening.">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549 (2012).</li><li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+obesogenic+test:+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity.">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

سوف التلوث بالبكتيريا أو الفطريات يحد بشكل كبير من تطبيق هذا الاختبار. الأزرق الميثيلين في المتوسط ​​الجنين E3 يحد من إمكانية التلوث الفطري. في جميع أنحاء الجنين تربية فمن الأهمية بمكان أن الرعاية التي اتخذت لإزالة الأجنة الميتة مرتين كل يوم. بالإضافة إلى ذلك، فمن ا?...

الفأر هو حاليا النموذج السائد للأبحاث السمنة. كانت فترة جيل قصيرة والأدوات الجينية المتاحة في الماوس لا مثيل لها حتى الآن. ومع ذلك، فقد الزرد أيضا فاصل الجيل قصيرة (3-4 أشهر)، ويفوق حتى الماوس في سهولة التلاعب الجيني 1،2. يحافظ على الزرد ما يقرب من 90٪ من الجينات الثدييات، في حين يتجاوز بكثير الماوس في عدد من ذرية والإمكانات للاستخدام في شاشات الوراثية والمخدرات 3. للاستفادة من إمكانات من طراز الزرد للدراسات في السمنة، ويجب وضع المقايسات للتحقيق في العوامل التي تؤثر على تنظيم وزن الجسم، بما في ذلك نفقات الطاقة. كما تتم معالجة الأيض من خلال β للأكسدة وحمض الكربوكسيليك دورة الأكسجين ويستهلك وينتج NADH 2. وهكذا، NADH 2 هو مؤشر مباشر على تدفق الأيض من خلال المسارات الأيضية (التمثيل الأيضي الأكسدة). في poikilotherms، H + تسرب من خلال غشاء الميتوكوندريا الداخلية، التي uncouples NADH 2 الأكسدة من ATP التوليف، هو 4-5 أضعاف أقل مما كانت عليه في متجانسات الحرارة 4. وفقا لذلك، في NADH الزرد 2 يرتبط بإحكام جدا لإنتاج ATP من خلال الفسفرة التأكسدية. هنا، نحن تصف مقايسة الذي يقيس NADH 2 الإنتاج في الزرد اليرقات كوكيل للإنفاق الطاقة 5. استهلاك الأوكسجين هو المعيار الذهبي لقياس استهلاك الطاقة. ومع ذلك، وإلى الاستفادة القصوى من إمكانيات إنتاجية عالية من الزرد، ويجب أن تكون المقايسات من نفقات الطاقة قابلة للالإنتاجية العالية. نظم استهلاك الأوكسجين التي تعتمد على غرفة مغلقة تعميم نظام محدودة في الإنتاجية من قبل عدد من الغرف المتاحة 6. فتح O الهواء 2 استهلاك / CO 2 فحوصات الإنتاج كما تم تطبيقه في الزرد 5،7. هذه 96-جيدا في الهواء الطلق لوحة قاعدةنظم د قابلة للإنتاجية عالية. للأسف، تبادل الغازات مع البيئة يحد حساسية هذه المقايسات. نشرنا مؤخرا تطبيق مقايسة التي تراقب NADH 2 باستخدام مؤشر الأكسدة alamarBlue 5. هذا الاختبار يتغلب على القيود في سرعة وحساسية مشتركة لتحليل استهلاك الأوكسجين في الزرد. الزرد أصبحت نموذجا متزايد الأهمية للدراسات كله توازن الطاقة في الجسم. في جزء منه، لأن الزرد هي قابلة للاستخدام في شاشات الوراثية إلى الأمام وشاشات المخدرات. وعلاوة على ذلك، تستهدف التلاعب الجيني، بما في ذلك ضربة قاضية واضعا في، ويمكن تطبيقها بسرعة. لقد أظهرنا سابقا أن هذا الاختبار يمكن دمجه مع تطبيق حمام المخدرات وضربة قاضية وراثية أو خروج المغلوب لتحديد المركبات والجينات التي تغير معدل الأيض 5. وعلاوة على ذلك، تم تصميم هذا الاختبار لاستغلال مزايا الإنتاجية العالية المتأصلة في الزرد. </P&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Manufactured by Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Manufactured by E&amp;amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput danio rerio energy expenditure assay

الزرد هي كائن نموذجا هاما مع المزايا الكامنة التي لديها القدرة على جعل الزرد نموذجا يطبق على نطاق واسع لدراسة توازن الطاقة والسمنة. صغر حجم الزرد يسمح لفحوصات على الأجنة التي ستجري في شكل لوحة 96- أو 384-جيدا والتكنولوجيات Morpholino وكريسبر أساس تعزيز سهولة التلاعب الجيني، والعلاج من تعاطي المخدرات من خلال تطبيق الحمام غير قابلة للحياة. وعلاوة على ذلك، الزرد مثالية لشاشات الوراثية إلى الأمام السماح لاكتشاف الجين الرواية. نظرا لحداثة النسبية للالزرد كنموذج للسمنة، فمن الضروري لتطوير الأدوات التي تستغل بشكل كامل هذه الفوائد. هنا، نحن تصف طريقة لقياس استهلاك الطاقة في الآلاف من الزرد الجنينية في وقت واحد. قمنا بتطوير كامل منصة صفيحة ميكروسكوبية الحيوانات التي نستخدمها لوحات 96-جيدا لعزل الأسماك الفردية ونقيم التراكمي إنتاج NADH 2 باستخدام المتاحة تجاريا زراعة الخلايا جدوى إعادةوكيل alamarBlue. في متغيرات الحرارة ترتبط بإحكام العلاقة بين NADH 2 إنتاج واستهلاك الطاقة. هذا الاختبار نفقات الطاقة يخلق القدرة على الشاشة بسرعة التلاعب الدوائية أو الوراثية التي تغير مباشرة نفقات الطاقة أو تغيير الاستجابة لدواء التطبيقية (على سبيل المثال محسسات الأنسولين).

حل الاختبار لا يزيد مضان في غياب الأسماك الجنينية (الشكل 1). ومع ذلك، فإن فحص حساس جدا لتغيرات صغيرة في معدل الأيض داخل البئر. سمكة واحدة داخل بئر يخلق إشارة مختلفة إلى حد كبير من الآبار فارغة في حدود 1 ساعة (P &lt;0.0001). الشكل 2 يوفر التمثيل البصري من الإشا?...

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay at JoVE.com

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

عالية الإنتاجية<em&gt; دانيو Rerio</em&gt; طاقة الإنفاق الفحص

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

12.6K Views.  Vanderbilt University Medical Center. Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery. 

Video: High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in humans, but more tools and research efforts are needed to better elucidate the mechanisms involved. For over a century, the genetically highly tractable model of Drosophila has been instrumental in the discovery of key genes and molecular pathways that proved to be highly conserved across species. Many biological processes and disease mechanisms are functionally conserved in the fly, such as development (e.g., body plan, heart), cancer, and neurodegenerative disease. Recently, the study of obesity and secondary pathologies, such as heart disease in model organisms, has played a highly critical role in the identification of key regulators involved in metabolic syndrome in humans.
Here, we propose to use this model organism as an efficient tool to induce obesity, i.e., excessive fat accumulation, and develop an efficient protocol to monitor fat content in the form of TAGs accumulation. In addition to the highly conserved, but less complex genome, the fly also has a short lifespan for rapid experimentation, combined with cost-effectiveness. This paper provides a detailed protocol for High Fat Diet (HFD) feeding in Drosophila to induce obesity and a high throughput triacylglyceride (TAG) assay for measuring the associated increase in fat content, with the aim to be highly reproducible and efficient for large-scale genetic or chemical screening. These protocols offer new opportunities to efficiently investigate regulatory mechanisms involved in obesity, as well as provide a standardized platform for drug discovery research for rapid testing of the effect of drug candidates on the development or prevention of obesity, diabetes and related metabolic diseases.

High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

This is a high fat diet feeding protocol to induce obesity in Drosophila, a model for understanding fundamental molecular mechanisms implicated in lipotoxicity. It also provides a high throughput triacylglyceride assay for measuring fat accumulation in Drosophila and potentially other (insect) models under various dietary, environmental, genetic or physiological conditions.

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

Heart disease is the number one cause of human death worldwide. Numerous studies have shown strong connections between obesity and cardiac malfunction in ...

Genetics

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

<meta charset="utf8"></head><body>منصة "محلية الصنع" ميسورة التكلفة وفعالة للدراسات السلوكية لذبابة الفاكهة ، وبروتوكول مصاحب لقياس تدفق الميتوكوندريا في اليرقات

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

منصة "محلية الصنع" ميسورة التكلفة وفعالة للدراسات السلوكية لذبابة الفاكهة ، وبروتوكول مصاحب لقياس تدفق الميتوكوندريا في اليرقات

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Behavior

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental factors, and the toxicological and pharmacological effects of numerous substances. Few methods currently implemented are amenable to high throughput measurement. The Microplate Feeder Assay (MFA) was developed for quantifying the consumption of liquid food for individual flies using absorbance. In this assay, flies consume liquid food medium from select wells of a 1536-well microplate. By incorporating a dilute tracer dye into the liquid food medium and loading a known volume into each well, absorbance measurements of the well acquired before and after consumption reflect the resulting change in volume (i.e., volume consumed). To enable high throughput analysis with this method, a 3D-printed coupler was designed that allows flies to be sorted individually into 96-well microplates. This device precisely orients 96- and 1536-well microplates to give each fly access to up to 4 wells for consumption, thus enabling food preference quantification in addition to regular consumption. Furthermore, the device has barrier strips that toggle between open and closed positions to allow for controlled containment and release of a column of samples at a time. This method enables high throughput measurements of consumption of aqueous solutions by many flies simultaneously. It also has the potential to be adapted to other insects and to screen consumption of nutrients, toxins, or pharmaceuticals.

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

The microplate feeder assay offers an economical, high throughput method for quantifying liquid food consumption in Drosophila. A 3D-printed device connects a 96-well microplate in which flies are housed to a 1536-well microplate from which flies consume a feeding solution with a tracer dye. The solution volume decline is measured spectrophotometrically.

A عالية الإنتاجية ميكروبليت المغذية المقايسة للقياس الكمي للاستهلاك في Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>التقييم الوظيفي للميتوكوندريا في فرشاة سحلية كبد الميتوكوندريا

Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of metabolic pathways. Therefore, experimentally assessing mitochondrial functionality can provide insight into variations among different populations or disease states. Additionally, it is valuable to assess whether isolated mitochondria are healthy enough to proceed with experiments. One characteristic often used to compare mitochondrial function in different samples is the rate of oxygen consumption. Oxygen consumption and subsequent calculation of the respiratory control ratio in either intact cells or mitochondria isolated from tissue can serve all three purposes. Using mitochondria isolated from the livers of brush lizards in conjunction with a phosphorescent probe that is sensitive to the fluctuations in oxygen concentration of a solution, we measured oxygen consumption using a fluorescent plate reader. This method is not only quick and efficient but also can be conducted with a small amount of mitochondria and without the need for specialized equipment. The step-by-step protocol described here increases the accessibility of mitochondrial functional assessment to researchers.

<meta charset="utf8"></head><body>تقييم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا باستخدام مقايسة الفلورسنت القائمة على قارئ اللوحة

Assessment of oxygen consumption provides integral information about mitochondrial function. Using a phosphorescent probe with a fluorescent plate reader, accurate and reproducible data can be obtained easily without specialized equipment. This assay enables any lab to measure the oxygen consumption of isolated mitochondria and calculate respiratory control ratios.

تقييم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا باستخدام مقايسة الفلورسنت القائمة على قارئ اللوحة

Mitochondria serve many important functions, including cellular respiration, ATP production, controlling apoptosis, and acting as a central hub of ...

Biochemistry

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

عالية الإنتاجية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تغذية حمية الدهون عالية وإنتاجية عالية بالانزيم ترياسيلجليسيريدي في Melanogaster المورفولوجية

منصة "محلية الصنع" ميسورة التكلفة وفعالة للدراسات السلوكية لذبابة الفاكهة ، وبروتوكول مصاحب لقياس تدفق الميتوكوندريا في اليرقات

منصة "محلية الصنع" ميسورة التكلفة وفعالة للدراسات السلوكية لذبابة الفاكهة ، وبروتوكول مصاحب لقياس تدفق الميتوكوندريا في اليرقات

A عالية الإنتاجية ميكروبليت المغذية المقايسة للقياس الكمي للاستهلاك في Drosophila

عالية الإنتاجية الفحص لفحص تفضيلات بيضة زرع الفردي

تقييم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا باستخدام مقايسة الفلورسنت القائمة على قارئ اللوحة

تقييم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا باستخدام مقايسة الفلورسنت القائمة على قارئ اللوحة

تقييم استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا باستخدام مقايسة الفلورسنت القائمة على قارئ اللوحة

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

الأيض تحليل الملف من الأجنة الزرد