Die Autoren bedanken sich bei A Viksø-Nielsen (Novozymes) für die Gabe des cellulolytischer Enzyme danken. Diese Arbeit wurde von FP7 VERLÄNGERUNG und BBSRC Projekte BB/G016178 und BB/G016194 finanziert.

1. Vorbereitung der Proben Wir normal arbeiten mit Stielen entweder krautige oder holzige Pflanzen. Im Falle von krautigen Materialien, die wir wachsen die Pflanzen zur Reife, und nach Samenentwicklung wir sammeln trockenen Stängel einmal Seneszenz ist abgeschlossen. Die Stiele sind in 4 mm Segmente geschnitten und in 2 ml Fläschchen mit drei Mahlkugeln. Im Falle von holzigen Stoffen, sind die Proben zu groben Sägemehl mit einem Kurs Holz-Datei Boden und dann in einer Kugelmühle für die weitere Verarbeitung. Die Proben werden in einem Rack im Schleifen / Formatierung Station (Abbildung 1) platziert. Diese Station sequenziell mahlt, mischt und wiegt jede Probe. Die Anzahl der Wiederholungen pro Probe notwendig ist durch die Prüfung das Mahlgut in einer Reihe von Vorversuchen, wo die intrinsische Variabilität für eine bestimmte Partikelgröße bestimmt wird gegründet. Die 2 ml-Fläschchen sind an der Unterseite durchbohrt und die Materialien werden durch Vibration des Fläschchens über den gewählten gut verzichtet. Die vibrierende Arm wird durch ein Feedback aus der Bilanz unter Berücksichtigung der genaue Dosierung des Pulvers gesteuert. Der Roboter verzichtet 4 mg / well in einer Standard-Analyse und 4 Wiederholungen sind in den meisten Fällen erforderlich. Dies erlaubt 20 Pflanzenproben / Platte analysiert werden. 2. Vorbehandlung Sobald die Proben formatiert sind, werden die 96-Well-Platten durch eine automatisierte Liquid-Handling-System (Abbildung 2) verarbeitet. Hier eine milde Vorbehandlung ist auf die pflanzlichen Materialien durch Zugabe von 350 ul von sauren oder alkalischen Lösungen und Erhitzen der Platte auf eine angepasste Block durchgeführt. Zur Vermeidung von Verdunstung während der Analyse sind die 96-Well-Platten mit einer Silikon-matt versiegelt. Die Temperatur und der Zeit der Vorbehandlung kann nach den Materialien untersucht geändert werden. Die maximale Temperatur, jedoch beträgt 100 ° C. Ein alternatives Verfahren zur Prüfung von härteren Vorbehandlungen ist es, die Materialien off line Vorbehandlung und die Beseitigung der pretreatmet aus dem Prozess. 3. Hydrolyse <ol><li> Nach den Materialien vorbehandelt werden, der Roboter automatisch entfernt die Vorbehandlung Lösung und wäscht, alle Brunnen, 5-mal mit 850 ul 25 mM Acetatpuffer. Die Spülungen werden durch Zugabe von Puffer, um die Vorbehandlung Lösung und anschließendem Entfernen 50% des Gesamtvolumens nach Abzug der Feststoffe in der Probe zu begleichen durchgeführt. Die Höhe der Anspruch ist bei der Hälfte der flüssigen Masse zu vermeiden Absaugen von Feststoffen aus dem Grund des Brunnens gesetzt, es gibt vernachlässigbaren Verlust von Festkörpern mit Hilfe dieses Ansatzes. Nach diesen wäscht die pH-Wert im gut 4,5 und das Material ist bereit für die enzymatische Hydrolyse. </li><li> Ein Enzym-Gemisch mit einer Lösung von Cellulasen und Hemicellulasen wird vom Roboter aufgenommen. In jede Vertiefung, ist 850 ul der Enzymmischung verzichtet und die Platte wird in einem 50 ° C Schüttelinkubator verschoben. Die Standard-Hydrolyse ist für 8 h durchgeführt, aber diesmal können, um den Zweck des Experiments angepasst werden. Die Standard-Enzymbeladung für Gräser eingesetzt ist 7 FPU / g Material. </li></ol> 4. Nachweis von reduzierenden Zuckern Bestimmung von reduzierenden Zuckern nach Hydrolyse freigesetzt wurde durchgeführt unter Verwendung eines modifizierten 3-methyl-2-benzothiazolinon Hydrozone (MTBH) Methode 3. MBTH wurde als das am besten geeignete Methode ausgewählt, weil es am einfachsten zu automatisieren und die am wenigsten anfällig für Störungen durch Verbindungen wie Proteine ​​wurde. Wir modifizierten diese hochempfindliche Methode für den Einsatz auf der Roboter-Plattform, so dass es genau quantifizieren könnten Zucker in den Konzentrationen in der Biomasse-Hydrolysate, mit einem Gesamtvolumen von 250 ul, die für eine herkömmliche optische 96-Well-Platte ist. Alle folgenden Schritte werden automatisch durchgeführt von drei unabhängigen Bestimmungen der reduzierenden Zucker wurden für jedes Verzuckerung Reaktion durchgeführt. <ol><li> 30 ul Hydrolysat wurde aus dem tiefen Loch-Platte aufgenommen und mit 45 ul 25 mM Natriumacetat-Puffer in einem skirted PCR 96-Well-Platte. </li><li> 25 ul 1N NaOH und 50 ul einer Lösung mit 0,43 mg / ml MBTH und 0,14 mg / ml DTT wurden hinzugefügt. </li><li> Nach dem Mischen wurde die PCR-Platte bei 60 ° C für 20 min in einem Thermocycler oder ein ähnliches Gerät, das genau die gleiche Menge an Wärme liefert, um alle 96 Wells. </li><li> Die daraus resultierende Reaktion auf eine optische Platte übertragen. </li><li> 100 l von oxidierenden Reagenz (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% Amidosulfonsäure und 0,1% HCl). Gut mischen und zu entwickeln für mindestens 1 h </li><li> Jede Platte sollte auch Standard-Reaktionen von 50 nmol, 100 nmol und 150 nmol Glukose. Die optische Platten werden bei 620 nm gelesen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Beispiele für verschiedene Arten von Analysen sind in Abbildung 3 und 4 dargestellt. Alle Ergebnisse wurden mit Hilfe der automatisierten Plattform erhalten. Abbildung 3 restellt die Zunahme der reduzierenden Zuckern von 8 h Inkubationen vom Boden aus Pappelholz mit steigenden Mengen von cellulolytischen Enzyme freigesetzt. Abbildung 4 zeigt die Auswirkungen des sauren und alkalischen Vorbehandlung auf Pappel Proben. Die NaOH Vorbehandlung ist effizienter, die verdünnte H2SO4 Vorbehandlung bei der Erleichterung der Freisetzung von Zucker bei der Hydrolyse. Die Höhe der Zucker nach der Hydrolyse gemessen abnimmt, wenn die Vorbehandlung durchgeführt wird unter Verwendung von NaOH-Konzentrationen höher als 1M. <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Robotic-Station für Schleif-und 96-Well-Format von Biomasse <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Liquid Handling Station für die Hochdurchsatz-Analyse Verzuckerung <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Einfluss verschiedener Enzym Belastungen auf die Freisetzung von reduzierenden Zuckern Mittel aus Pappel-Proben <img src="/files/ftp_upload/3240/3240fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Auswirkung der unterschiedlichen Vorbehandlungen auf die Verzuckerung der Pappel Proben. A. Zucker nach pretreament mit unterschiedlichen Prozentsätzen von H2SO4 bei 90 ° C für 30 Minuten freigegeben. B. Zucker nach NaOH Vorbehandlungen bei der gleichen Temperatur und Zeit freigesetzt, als die Säure Vorbehandlung .

<ol>
	<li>Carpita, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Biogenesis+of+the+Cell+Walls+of+Grasses.">Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses.</a> Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).</li><li>Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustainable+liquid+biofuels+from+biomass:+the+writing's+on+the+walls.">Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls.</a> New Phytol. 178, 473-485 (2008).</li><li>Anthon, G. E., Barrett, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+reducing+sugars+with+3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.">Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone.</a> Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).</li><li>Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+saccharification+assay+for+determination+of+digestibility+in+plant+materials.">Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials.</a> Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).</li></ol>

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Grinding &amp; Wiegen Roboter </td><td> Labman Automation </td><td></td></tr><tr><td> 2 ml Mikro-Schlauch mit Kappen </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72,694 </td></tr><tr><td> 5 mm Edelstahl Perlen </td><td> Qiagen Ltd </td><td> 69989 </td></tr><tr><td> 1.2ml Abgene Platz auch Speicherplatten </td><td> Fischer Scientific Ltd </td><td> TUL-050-050C </td></tr><tr><td> Whatman Deckel für 96 Quadratmeter Well-Platten </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 7704-0104 </td></tr><tr><td> Flüssige Hanling Roboter </td><td> Tecan Group Ltd </td><td> Freedom Evo 200 </td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> S/9231/PB17 </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> BPE359-500 </td></tr><tr><td> Natriumacetat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S8750-500G </td></tr><tr><td> Essigsäure </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> A/0420/PB17 </td></tr><tr><td> Novozyme 188 </td><td> Novozyme </td><td> DCN00214 </td></tr><tr><td> Celluclast 1.5L </td><td> Novozyme </td><td> CCN03122 </td></tr><tr><td> 96-Well-PCR vollen Rock Platten </td><td> Sarstedt Ltd </td><td> 72.1980.202 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> G/0450/53 </td></tr><tr><td> 3-Methyl-2-benzothiazolinon Hydrazon Hydrochlorid Hydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 129739-25G </td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9163-1G </td></tr><tr><td> Corning Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> TKT-521-050H </td></tr><tr><td> Ammoniumeisen (III)-Sulfat Dodecahydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F1668-250G </td></tr><tr><td> Sulfaminsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 242772-500G </td></tr><tr><td> Salzsäure </td><td> Fisher Scientific Ltd </td><td> 12462-0026 </td></tr></tbody></table>

high-throughput saccharification assay for lignocellulosic materials

Polysaccharide, aus denen sich Pflanzen Lignozellulose aufgeschlüsselt werden können, um eine Reihe von Zuckern, die später bei der Errichtung einer Bioraffinerie eingesetzt werden können produzieren. Diese Rohstoffe wäre eine neue industrielle Plattform, die sowohl nachhaltig als auch klimaneutral ist, um die derzeitige Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen zu ersetzen. Die Widerspenstigkeit der Dekonstruktion in Lignocellulose-Materialien beobachtet wird von mehreren intrinsischen Eigenschaften der pflanzlichen Zellwände produziert. Kristalliner Cellulose ist in Matrix-Polysaccharide wie Xylane und Arabinoxylane eingebettet, und die ganze Struktur ist umhüllt von der phenolischen Polymer Lignin, das ist auch schwierig zu 1 zu verdauen. Um die Verdaulichkeit von pflanzlichen Materialien, die wir benötigen, um die wichtigsten Engpässe für die Verzuckerung der Zellwände und auch Bildschirm-Mutante und Populationen zu entdecken, um die Variabilität in Verzuckerung 2 auszuwerten verbessern. Diese Aufgaben erfordern einen hohen Durchsatz Ansatz und hier präsentieren wir eine analytische Plattform, die Verzuckerung Analyse in einer 96-Well-Platte-Format durchführen können. Diese Plattform wurde entwickelt, um das Screening von Lignocellulose Verdaulichkeit von großen Populationen von verschiedensten Pflanzenarten ermöglichen. Wir haben den Reaktionsvolumina für die schonende Vorbehandlung, partielle enzymatische Hydrolyse und Zuckerbestimmung skaliert, damit eine große Zahl schnell in ein automatisiertes System beurteilt werden. Diese vollautomatische Plattform arbeitet mit Milligramm-Mengen von Biomasse, die Durchführung Kugelmühle unter kontrollierten Bedingungen, um die pflanzlichen Materialien zu einem standardisierten Partikelgröße in reproduzierbarer Weise zu reduzieren. Sobald die Proben Boden sind, verzichtet die automatisierte Formatierung Roboter angegeben und erfasst Mengen an Material in die entsprechenden Vertiefungen der 96-well-Platte (Abbildung 1). Normalerweise verzichten wir aus dem gleichen Material in 4 Vertiefungen zu haben 4 Wiederholungen für die Analyse. Sobald die Platten mit dem Pflanzenmaterial in das gewünschte Layout gefüllt sind, werden sie manuell in einen Liquid-Handling-Station (Abbildung 2) bewegt. In dieser Station werden die Proben auf eine milde Vorbehandlung entweder mit verdünnter Säure oder alkalischen unterzogen und über Nacht bei Temperaturen von bis zu 90 ° C. Die Vorbehandlung Lösung wird anschließend entfernt und die Proben werden mit Puffer gespült, um sie zu einem geeigneten pH-Wert für die Hydrolyse zurückzukehren. Die Proben werden dann mit einem Enzym-Gemisch für eine variable Länge der Zeit bei 50 ° C inkubiert Ein Aliquot wird aus dem Hydrolysat entnommen und der reduzierenden Zucker werden automatisch von der MBTH kolorimetrischen Methode bestimmt.

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials at JoVE.com

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.

High-Throughput-Assay Verzuckerung für Lignocellulose-Materialien

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

high-throughput-saccharification-assay-for-lignocellulosic-materials

Research

JoVE Journal

Biology

13.2K Aufrufe.  University of York. Eine einfache, schnelle Methode zur Bestimmung der Verzuckerung Potenzial einer großen Zahl von pflanzlicher Biomasse Proben beschrieben. Die automatisierte Plattform für diese Analyse umfasst die Vorbereitung der pflanzlichen Biomasse für die Analyse in 96-Well-Platten und die anschließende Performance der Vorbehandlung, Hydrolyse und Quantifizierung der Zucker freigesetzt.

Serie: High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput Hefeplasmid Überexpression Bildschirm

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Forschung

Biologie

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed "high-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension", or SHAPE, allows prediction of RNA secondary structure with single nucleotide resolution. This approach utilizes chemical probing agents that preferentially acylate single stranded or flexible regions of RNA in aqueous solution. Sites of chemical modification are detected by reverse transcription of the modified RNA, and the products of this reaction are fractionated by automated capillary electrophoresis (CE). Since reverse transcriptase pauses at those RNA nucleotides modified by the SHAPE reagents, the resulting cDNA library indirectly maps those ribonucleotides that are single stranded in the context of the folded RNA. Using ShapeFinder software, the electropherograms produced by automated CE are processed and converted into nucleotide reactivity tables that are themselves converted into pseudo-energy constraints used in the RNAStructure (v5.3) prediction algorithm. The two-dimensional RNA structures obtained by combining SHAPE probing with in silico RNA secondary structure prediction have been found to be far more accurate than structures obtained using either method alone.

High-throughput selective 2' hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) utilizes a novel chemical probing technology, reverse transcription, capillary electrophoresis and secondary structure prediction software to determine the structures of RNAs from several hundred to several thousand nucleotides at single nucleotide resolution.

RNA Secondary Structure Prediction Mit High-Throughput-SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

Hochdurchsatz-Screening mit einem Funktionshomemade Dual-Luciferase Assay-Schein

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Titration of Luciferase-expressing Recombinant Viruses

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with viruses that do not form plaques. As an alternative to plaque assays, we have developed a high-throughput titration method that allows for the simultaneous titration of a high volume of samples in a single day. This approach involves infection of the samples with a Firefly luciferase tagged virus, transfer of the infected samples onto an appropriate permissive cell line, subsequent addition of luciferin, reading of plates in order to obtain luminescence readings, and finally the conversion from luminescence to viral titers. The assessment of cytotoxicity using a metabolic viability dye can be easily incorporated in the workflow in parallel and provide valuable information in the context of a drug screen. This technique provides a reliable, high-throughput method to determine viral titers as an alternative to a standard plaque assay.

This article presents a high-throughput luciferase expression-based method of titrating various RNA and DNA viruses using automated and manual liquid handlers.

Hochdurchsatz-Titration von Luciferase-exprimierenden rekombinanten Viren

Standard plaque assays to determine infectious viral titers can be time consuming, are not amenable to a high volume of samples, and cannot be done with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Rückgewinnung von Adult Zebrafisch-Herzen für Hochdurchsatz-Anwendungen

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an array of hundreds of queried 3&#8217;UTRs. Target identification is based on the dual-luciferase assay, which detects binding at the mRNA level by measuring translational output, giving a functional readout of miRNA targeting. 3&#8217;LIFE uses non-proprietary buffers and reagents, and publically available reporter libraries, making genome-wide screens feasible and cost-effective. 3&#8217;LIFE can be performed either in a standard lab setting or scaled up using liquid handling robots and other high-throughput instrumentation. We illustrate the approach using a dataset of human 3&#8217;UTRs cloned in 96-well plates, and two test miRNAs, let-7c and miR-10b. We demonstrate how to perform DNA preparation, transfection, cell culture and luciferase assays in 96-well format, and provide tools for data analysis. In conclusion 3&#39;LIFE is highly reproducible, rapid, systematic, and identifies high confidence targets.

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3&#039;LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

Nachweis von miRNA Targets in Hochdurchsatz-Verwendung des 3&#39;LIFE Assay

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag Analyse - ein hoher Durchsatz, Echtzeit-PCR-Assay für Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

Hochdurchsatz-<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energieumsatz-Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...