وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI62983 (AYK) ، AI22535 (الباوند).

1. فأري موديل P. الزنجارية الاستعمار ونشر GI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم التعامل مع الفئران C3H/HeN (6-8 WKS القديمة ، أنثى ، هارلان) مع المضادات الحيوية عن طريق الفم لاستنزاف النباتات المتعايشة ثم أحادية المستعمر مع السلطة الفلسطينية كما هو موضح سابقا 4. </li></ol> 2. حصاد الفئران المحتويات اللمعية الأعوري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج a تنظيف هاون الفولاذ المقاوم للصدأ في حمام النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران خنقا غاز ثاني أكسيد الكربون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأمين الذبيحة الماوس على متن الستايروفوم والدش مع الايثانول 95 ٪. جعل شق طولي خط الوسط عن طريق الجلد من القص في العجان. يعكس الجلد والغشاء البريتوني لفضح تجويف البطن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يقطع الأعور بأكمله. عقد الأعور بالملقط هاون على الفولاذ المقاوم للصدأ. قص طرفي الأعور مع مقص تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود طرف ماصة P1000 مليئة 1 مل من العازلة flushate الأعور (10 ملي TrisHCl ، 1 ملم و 200 كلوريد الصوديوم EDTA ملم) 5 في النهاية القريبة من الأعور. تدفق العازلة flushate الأعور ومحتويات اللمعية الأعوري هاون في الفولاذ المقاوم للصدأ. وسوف 1 مل من العازلة flushate الأعور يكون كافيا لصرف كل محتويات الأعور. والأعور محتويات flushate تجميد فور اتصالهم مع هاون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طحن محتويات flushate الأعور مع مدقة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأرض مكان المجمدة محتويات اللمعية الأعور في أنبوب 50 مل البولي بروبلين المخروطية المغمورة في حمام الثلج / الايثانول الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من خلال 2،2 2،7 لكل الماوس إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المحل في -80 درجة مئوية. </li></ol> 3. عزل الحمض النووي الريبي البكتيرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 الدافئة حجم (استنادا إلى الحجم النهائي من محتويات two اللمعية الأعور ، ما يقرب من 3 مل) من حمض الفينول / الكلوروفورم (5:1 ، V / V) الواردة في أنبوب 50 مل أوك ريدج الطرد المركزي مع غطاء المضمون في parafilm في 65 ° C حمام الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي 0.5 حجم المخزن تحلل (2 ٪ SDS ، EDTA 16 ملم و 200 ملم كلوريد الصوديوم) 6 الواردة في أنبوب البولي بروبلين 50 مل المخروطية لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى الغليان العازلة تحلل محتويات اللمعية الأعور. التجانس. يغلي لمدة 5 دقائق مع vortexing الدورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 درجة مئوية محتويات الأعور / تحلل عينات للحمض 65 درجة مئوية الفينول / كلوروفورم الطرد المركزي في أوك ريدج أنبوب. ختم غطاء مع parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة مع vortexing الدورية (كل دقيقة 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بدقة المرحلة المائية (تجنب أي من واجهة بيضاء) إلى 50 مل الطازجة الطرد المركزي أوك ريدج. وحجم المرحلة المائية بحوالي 50 ٪ من إجمالي حجم محتويات الأعور ، تحلل العازلة ، وحامض الفينول / الكلوروفورم. إضافة حجم مساو من حامض الفينول / الكلوروفورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم غطاء مع parafilm ومزيج جيد من قبل vortexing بسرعة عالية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 3،7-3،9 حتى يكون هناك أي واجهة مرئية البيضاء بين المرحلتين المائي والعضوي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بدقة المرحلة المائية العذبة لأجهزة الطرد المركزي 50 مل أوك ريدج. إضافة حجم مساو من كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (24:1 ، V / V). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم غطاء ومزيج جيد من قبل vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 15 دقيقة. إزالة المرحلة المائية (من حيث الحجم سيكون حوالي 50 ٪ من حجم رد الفعل الكل) إلى 15 مل أنبوب البولي بروبلين المخروطية وإضافة حجم مساو من الأيزوبروبانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان ° -20 لما لا يقل عن 2 ساعة أو بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة الطرد المركزي في 2500 غرام عند 4 درجات لمدة 45 دقيقة. وسوف هلام مثل بيليه النموذج في الجزء السفلي من الأنبوب. إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 70 ٪. الدوامة. أجهزة الطرد المركزي في 10000 عينة في غرام عند 4 درجات لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وعكس أنبوب للسماح للجفاف بيليه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend بيليه في الحمض النووي الريبي في 200 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه. </li></ol> 4. الدناز المعاملة (توربو الدنا الحر ، والنظم البيولوجية التطبيقية) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ميكرولتر من 20 10X العازلة الدناز توربو و 2 ميكرولتر الدناز توربو ومزيج بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 كاشف ميكرولتر من معلق تعطيل الدناز وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، والخلط أحيانا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 10000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 دقيقة ، وطاف لنقل أنبوب microfuge جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجلد واحد من حمض (4 °) الباردة الفينول / الكلوروفورم ومزيج دقيق من قبل لvortexing 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 12500 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية لأنبوب جديد وإضافة 1 حجم كلوروفورم / كحول أيزو أميلي (49:1 V / V) ، الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 12500 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المرحلة المائية (حوالي 50 ٪ من إجمالي حجم رد الفعل) إلى أنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.1 حجم خلات الصوديوم 3M ، ودرجة الحموضة 5.5 و2.5 كميات من الجليد الباردة الإيثانول بنسبة 100 ٪. الدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في احتضان ° -20 لما لا يقل عن 2 ساعة أو على -80 درجة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ز الطرد المركزي في 12000 لمدة 30 دقيقة على 4 درجات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه مع 1 مل من الجليد الباردة الايثانول 70 ٪ بحلول الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 10000 غرام عند 4 درجات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف الجافة والهواء لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه. قد تحتاج إلى 65 درجة في مكان حمام الماء لresuspend وحل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لاختبار فعالية العلاج الدناز ، يمكن إجراء RT - PCR القياسية لتضخيم رد فعل من البروتين الريباسي (أو غيرها من الجينات المرجعي) للعينات المعالجة وغير المعالجة ، وذلك باستخدام أي ضوابط RT. </li></ol> 5. RNA الخطوة تنظيف (Qiagen ، RNeasy كيت) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرجوع إلى صفحات 56-57 من كتيب صغير Qiagen RNeasy (4 الطبعة الخامسة ، نيسان 2006). اتبع كما هو مبين. </li></ol> 6. ممثل النتائج كمية من الحمض النووي الريبي مجموع البكتيرية استرداد باستخدام هذا البروتوكول هو حوالي 2-3 ميكروغرام من اثنين cecums. استعاد الجيش الملكي النيبالي هو كمية ونوعية كافية لqPCR اللاحقة ، التنميط النسخ ، والتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. ويتم تقييم روتيني RNA النقاء من خلال قياس نسبة 260nm/280nm 7 من العينة ، ولكن هذا الأسلوب لا يقدم أي معلومات حول سلامة الحمض النووي الريبي. وBioanalyzer اجيلنت هو منصة على microfluidics قائم على القياس الكمي ، التحجيم والسيطرة النوعية من الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، والبروتينات والخلايا ، ويستخدم لقياس سلامة المعروف باسم الحمض النووي الريبي RNA النزاهة رقم (رين) 8. استخراج الحمض النووي الريبي لهذا البروتوكول ، وتنتج نسبة تتراوح 260/280 1،7-2،0 والقيم RIN 7.0 ≥. ويرد مثال لتحليل Bioanalyzer اجيلنت من الحمض النووي الريبي البكتيرية تعافى من هذا البروتوكول في الشكل 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="الشكل 1"/> الشكل 1. اجيلنت Bioanalyzer مخطط رحلاني وهلام تشبه صورة عينة الحمض النووي الريبي مجموع الزائفة الزنجارية معزولة وتعافى من محتويات الأعور الفئران. RIN 8.0.

<ol>
	<li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li><li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endemicity,+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units.">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li><li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia.">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li><li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples.">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li><li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR.">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li><li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations.">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li><li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li><li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins.">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة استخراج الحمض النووي الريبي وصفها هنا يسمح لاسترداد كميات كافية من الحمض النووي الريبي عالية الجودة الزائفة الزنجارية تحصد من مجموع الجهاز الهضمي الفئران. لا يقتصر هذا الأسلوب لP. يمكن أن يحتمل الزنجارية ويمكن تطبيقها على غيرها من البكتيريا. فإن الانتعاش من الكائنات الجرثومية كافية من الأمعاء تختلف بشكل كبير من كائن إلى كائن. نموذجنا في الفئران ، P. الزنجارية تستوطن عادة في الجهاز الهضمي عند الفئران المستويات بين 5 × 07 حتي 05 أكتوبر × 10 8 CFU / ز 4 البراز. منذ محتويات انتشال ما يقرب من 0.5 الأعوري غرام ، ويقدر عدد P. الزنجارية انتشال اثنين من cecums بين 5 × 10 س CFU 07-05 أغسطس 10. إذا تم استخدام الكائنات الحية الدقيقة الأخرى ، سيكون من الحكمة أن تحقق مستويات GI الاستعمار ومن ثم حساب عدد cecums اللازمة لاسترداد العدد المستهدف من هراري. من المهم أيضا أن نلاحظ أنه عند استخدام هذا النموذج خاص الفئران ، الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية غير المصابين مع السلطة الفلسطينية ليس لديهم كميات قابلة للقياس الكمي من الحمض النووي الريبي معزولة عن محتوياتها الأعور. لدينا نموذج الفئران من الاستعمار الزائفة الزنجارية الجهاز الهضمي ومحاولات نشر لمحاكاة المرضية P. تجرثم الدم في مرضى السرطان وزرع الخلايا الجذعية الزنجارية. في هذه الفئة من السكان المريض ، وغالبا ما يتم المنضب المتعايشة النباتات الثانوية للعلاج بالمضادات الحيوية أو العلاج الكيميائي (مثل استنزاف للمضادات الحيوية في النباتات المتعايشة GI) مما أدى إلى فرط نمو الميكروبات المسببة للأمراض (مثل أحادية بالاشتراك مع الزنجارية P.) ونشر بعد ذلك لاحقا بعد قمع المناعي. مزايا وقيود من هذا النموذج الفأري بالفعل تم تناولها سابقا 4. الغرض من هذه الدراسة الحالية هو تقديم منهجية لعزل الحمض النووي الريبي مجموع الميكروبية من الجهاز الهضمي. ويمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول على نماذج الفئران الأخرى التي دراسة جوانب أخرى من الجراثيم المرضية في الجهاز الهضمي (أي النباتات المتعايشة التفاعلات والتأثيرات الجرثومية على مرض التهاب الامعاء ، الخ). ميزة واحدة من هذا الأسلوب هو دمج خطوات متعددة بما في ذلك تجميد تحلل / ذوبان الجليد ، واختلال الميكانيكية (مع تحطيم التجانس ومدافع الهاون / مدقة) ، الغليان ، وتحلل المواد الكيميائية (مثل الحزب الديمقراطي الصربي). على الرغم من العديد من الخطوات تحلل ، قد تكون بعض الكائنات الحية الدقيقة (لاسيما إيجابية الجرام البكتيريا والفطريات / الخميرة) تتطلب تعطيل ميكانيكية إضافية. وينبغي بعد الساخنة تحلل / حامض الفينول كلوروفورم الحضانة (الخطوة 3.5) ، وبالإضافة إلى ذلك من الخرز (0.1 ملم للبكتيريا و / أو 0،5-0،7 مم للخميرة) والخطوة اللاحقة حبة الضرب يكون كافيا لهذه الكائنات ليز 9 ، 10. نظرا للطبيعة المعقدة للمواد المستخرجة من الفئران الأعور ، وكرر الباردة acid-phenol/chloroform الاستخراج (الخطوة 3،7-3،9) مطلوبة للغاية من أجل تحقيق الجودة ومقبولة رنا سلامة المصب لتفاعلات أخرى. وقد بين 3-5 قلع acid-phenol/chloroform الباردة يلزم قبل واجهة بيضاء بين المرحلتين المائي والعضوي هو القضاء. أخيرا ، فإن الجمع بين كل من العلاج والدناز (الخطوة 4) وبروتوكول RNeasy تنظيف (الخطوة 5) ضرورية لإزالة تلويث الحمض النووي والصغيرة غير مرنا (5S والحمض الريبي النووي النقال). كما ذكر سابقا ، وذلك باستخدام الحمض النووي الريبي تعافى هذا البروتوكول هو كمية ونوعية كافية لتحديد ملامح النسخ اللاحقة 3 ، qPCR (غير منشورة) ، والجيش الملكي النيبالي التجارب تسلسل (غير منشور).

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th></tr><tr><td> الهاون والمدقة </td><td> الصياد </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> الخالط </td><td> اومني </td><td> TM - 125 </td></tr><tr><td> أنابيب الطرد المركزي البلوط ريدج (50 مل) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> حمض الفينول / الكلوروفورم </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> كلوروفورم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> كحول أيزو أميلي </td><td> سيغما الدريخ </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> الأيزوبروبانول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> إثيل pyrocarbonate (DEPC) </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> الدناز </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy كيت </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M خلات الصوديوم </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> الإيثانول بنسبة 100 ٪ </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna isolation of pseudomonas aeruginosa colonizing the murine gastrointestinal tract

الزائفة الزنجارية نتيجة العدوى (السلطة الفلسطينية) في قسط كبير من المراضة والوفيات في المضيفين مع الجهاز المناعي للخطر ، مثل المرضى الذين يعانون من سرطان الدم وحروق شديدة ، أو زرع الأعضاء 1. في المرضى المعرضين للخطر عالية لتطوير التهابات مجرى الدم السلطة الفلسطينية ، والجهاز الهضمي (غي) المسالك هو الخزان الرئيسي للاستعمار 2 ، ولكن الآليات التي التحولات السلطة الفلسطينية من جرثومة استعمار an أعراض لالغازية ، وعادة ما يكون مميتا ، الممرض غير واضحة. سابقا ، وأجرينا في التجارب المجراة التنميط النسخ التي تتعافى من السلطة الفلسطينية مرنا الخلايا البكتيرية المقيمين في cecums المستعمرة 3 الفئران من أجل تحديد التغييرات في تعبير الجينات البكتيرية خلال التعديلات في حالة المضيف المناعية. كما هو الحال مع أي نسخ التجربة التنميط ، في خطوة تحد من معدل في عزلة كميات كافية من مرنا ذات جودة عالية. بالنظر إلى وفرة من الإنزيمات ، والحطام ، وبقايا الطعام ، والجسيمات في الجهاز الهضمي ، والتحدي هو الحمض النووي الريبي من العزلة الرهيبة. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لعزل موثوق بها وقابلة للتكرار من الحمض النووي الريبي البكتيرية تعافى من الجهاز الهضمي الفئران. هذا الأسلوب يستخدم نموذجا راسخة الفئران الاستعمار GI السلطة الفلسطينية والعدلات المحرض نشر 4. وأكد غي الاستعمار مرة واحدة مع السلطة الفلسطينية ، والفئران ويتم استرداد محتويات الموت الرحيم والأعور والمجمدة فلاش. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام مزيج من التعطيل والغليان الميكانيكية ، والفينول / كلوروفورم الاستخراج والمعالجة الدناز ، واللوني للتقارب. وأكد الكمية والنقاء بواسطة القياس الطيفي (Nanodrop تكنولوجيز) وbioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز) (الشكل 1). يمكن بسهولة هذا الأسلوب من الجراثيم GI RNA العزلة أن تتكيف مع غيرها من البكتيريا والفطريات كذلك.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract at JoVE.com

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

وهناك طريقة يمكن الاعتماد عليها لعزل الحمض النووي الريبي ل<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; تعافى من cecums الفئران الموصوفة. استعاد الجيش الملكي النيبالي هو كمية ونوعية كافية لqPCR اللاحقة ، التنميط النسخ ، والتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن تكييف هذه التقنية لعزل الحمض النووي الريبي من الميكروبات المعوية الأخرى.

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

19.1K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. وهناك طريقة يمكن الاعتماد عليها لعزل الحمض النووي الريبي ل الزائفة الزنجارية تعافى من cecums الفئران الموصوفة. استعاد الجيش الملكي النيبالي هو كمية ونوعية كافية لqPCR اللاحقة ، التنميط النسخ ، والتجارب تسلسل الحمض النووي الريبي. ويمكن تكييف هذه التقنية لعز?...

Video: RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

شارك في نماذج من الثقافة الزائفة الزنجارية الأغشية الحيوية نمت على خلايا حية إيرواي الإنسان

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

استخدام متوسط ​​البلغم الاصطناعي لاختبار فعالية المضادات الحيوية لمكافحة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في شروط أكثر ملاءمة لالرئة التليف الكيسي

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

على المدى الطويل المزمن<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; عدوى مجرى الهواء في الفئران

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

الزائفة الزنجارية المستحثة الرئة الإصابات نموذج

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

تأتي إلى "جانب الضوء": "في فيفو" الرصد الزائفة الزّنجاريّة بيوفيلم الالتهابات في "الجروح المزمنة" في "نموذج مورين أصلع السكري"

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

النسخ المتماثل لمطلوب، "مكتبة نونريدوندانت" من سلالة الزّنجاريّة Pseudomonas PA14 ينقول طفرات الإدراج

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

ثقافة البديل مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية من Alginate لها

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...