עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).

1. דגם Murine של פ GI aeruginosa להתיישבות והפצת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים C3H/HeN (6-8 wks הישן, נקבה, הרלן) מטופלים עם אנטיביוטיקה דרך הפה כדי לרוקן צומח commensal ולאחר מכן מונו יישבו עם הרשות הפלסטינית כפי שתואר לעיל 4. </li></ol> 2. מסיק Murine תוכן לומינל Cecal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול מרגמה לנקות נירוסטה לתוך אמבט חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים בחנק פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר פגר מאובטחת על לוח קלקר ומקלחת עם אתנול 95%. לעשות חתך אורכי קו האמצע דרך העור מעצם החזה ועד חיץ הנקבים. לשקף את העור הצפק לחשוף את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכרות cecum כולו. החזק את cecum עם מלקחיים מעל המכתש נירוסטה. Snip בשני הקצוות של cecum עם מספריים לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס קצה פיפטה P1000 מלא מ&quot;ל 1 של חיץ flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA ו - 200 mM NaCl) 5 אל הקצה הפרוקסימלי של cecum. פלאש החיץ flushate cecal ותכנים luminal cecal אל תוך המדוכה נירוסטה. 1 מ&quot;ל של חיץ flushate cecal יהיה מספיק הסמקה כל תוכן cecal. Cecal תוכן flushate יהיה להקפיא מיד לבוא במגע עם מרגמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוחנים את תוכן flushate cecal עם העלי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרקע מקום קפוא תוכן luminal cecal לתוך צינור פוליפרופילן 50 מ&quot;ל חרוטי שקוע באמבט קרח / אתנול יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2 עד 2.7 עבור כל עכבר נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות ב -80 ° C. </li></ol> 3. בידוד חיידקי RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח חם 1 (בהתבסס על נפח סופי של שני תוכן luminal cecal, כ 3 מ&quot;ל) של חומצת פנול / כלורופורם (05:01, v / v) הנכלל שפופרת 50 מ&quot;ל Oak Ridge צנטריפוגה עם כובע מאובטחת parafilm ב 65 ° C אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרתיחים 0.5 נפח המאגר תמוגה (2% SDS, 16 mM EDTA ו - 200 mM NaCl) 6 הכלולים צינור פוליפרופילן 50 מ&quot;ל חרוטי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ תמוגה רותחים לתכנים luminal cecal. Homogenize. מרתיחים במשך 5 דקות עם vortexing תקופתיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את 100 ° C תוכן cecal / מדגם תמוגה על חומצה 65 מעלות צלזיוס פנול / כלורופורם את הצינור צנטריפוגות רידג&#39;. חותם כובע עם parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות עם vortexing תקופתיים (כל 2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות העברת השלב מימית (הימנעות מכל של הממשק לבן) כדי צנטריפוגה רידג&#39; Oak טרי 50 מ&quot;ל. היקף השלב מימית תהיה כ -50% מהנפח הכולל של תוכן cecal, חיץ תמוגה, וחומצה פנול / כלורופורם. הוסף נפח שווה של חומצת פנול / כלורופורם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כובע עם parafilm ומערבבים היטב על ידי vortexing במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.7-3.9 עד אין ממשק לבן גלוי בין שלבי מימית ואורגנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות כדי להעביר את השלב מימית צנטריפוגה רידג&#39; Oak טרי 50 מ&quot;ל. הוסף נפח שווה של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (24:1, v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כובע ומערבבים היטב על ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 ב · 4 במשך 15 דקות. הסר השלב מימית (נפח יעמוד על כ 50% מנפח את התגובה בסה&quot;כ) כדי שפופרת 15 מ&quot;ל פוליפרופילן חרוטי ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב g 2500 · 4 ב 45 דקות. ג&#39;ל כמו גלולה יהוו בחלק התחתון של הצינור. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול קר כקרח 70%. וורטקס. צנטריפוגה מדגם ב ב ז ב 10,000 · 4 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו להפוך את הצינור כדי לאפשר יבש גלולה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה רנ&quot;א 200 μl מים RNase חינם. </li></ol> 4. DNase טיפול (Turbo-DNA חינם, Applied Biosystems) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של חיץ 10X DNase טורבו 2 μl טורבו DNase ומערבבים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על ° 37 במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מגיב DNase resuspended איון ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר, ערבוב מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 10,000 בטמפרטורת החדר למשך 1.5 דקות ולהעביר את supernatant לצינור microfuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף כרך אחד של חומצה (4 מעלות) קר פנול / כלורופורם ומערבבים היטב על ידי vortexing דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית לצינור חדשה ולהוסיף 1 נפח של כלורופורם / isoamyl אלכוהול (49:1 v / v), מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,500 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית (כ 50% מנפח את התגובה סה&quot;כ) לצינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח של 0.1 נתרן אצטט 3M, ו-pH 5.52.5 כרכים של אתנול קר כקרח 100%. וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ב -20 ° לפחות 2 שעות או ב -80 ° במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 12,000 במשך 30 דקות ב 4 מעלות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור עם 1 מ&quot;ל של אתנול קר כקרח 70% על ידי centrifuging במשך 5 דקות ב g 10,000 ב · 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant יבשה ואוויר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 100 μl מים RNase חינם. במאי צריך לשים באמבט מים 65 ° עד resuspend ו לפזר את גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לבדוק את היעילות של הטיפול DNase, בתגובה RT-PCR תקן הגברה של חלבון ריבוזומלי (או גן התייחסות אחרת) יכול להתבצע עבור דגימות מטופלים ולא מטופלים, תוך שימוש לא שולטת RT. </li></ol> 5. RNA שלב ניקוי (Qiagen, RNeasy Kit) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיינו בדפי 56-57 של Qiagen RNeasy מיני מדריך (4 th Edition, אפריל 2006). פעל כפי שצוין. </li></ol> 6. נציג תוצאות הסכום הכולל של RNA חיידקי התאושש באמצעות פרוטוקול זה הוא כ 2-3 מיקרוגרם משני cecums. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טוהר RNA נבחנת באופן שוטף על ידי מדידת יחס 260nm/280nm 7 המדגם, אך שיטה זו אינה מספקת מידע על תקינות RNA. Bioanalyzer Agilent היא פלטפורמה מיקרופלואידיקה מבוסס על כימות, אומדת ובקרת איכות של DNA, RNA, חלבונים בתאים וכן מנצל מטרי שלמות המכונה RNA מספר Integrity RNA (רין) 8. RNA חילוץ עם פרוטוקול זה מייצר 260/280 יחסי החל 1.7-2.0 וערכים רין ≥ 7.0. דוגמה לניתוח Agilent Bioanalyzer של RNA חיידקי התאושש על ידי פרוטוקול זה מוצג באיור 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. Agilent Bioanalyzer electropherogram וג&#39;ל כמו התמונה של מסך מדגם Pseudomonas aeruginosa RNA בודד התאושש תוכן cecal Murine. רין 8.0.

<ol>
	<li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li><li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endemicity,+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units.">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li><li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia.">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li><li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples.">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li><li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR.">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li><li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations.">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li><li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li><li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins.">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

שיטת מיצוי RNA המתואר כאן מאפשר התאוששות של כמויות מספיקות של באיכות גבוהה הכולל Pseudomonas aeruginosa RNA שנקטפו מן העיכול Murine. שיטה זו אינה מוגבלת פ aeruginosa ועלול להיות מיושם על חיידקים אחרים. ההתאוששות של אורגניזמים מספיק חיידקים מהמעי ישתנו באופן משמעותי מן אורגניזם לאורגניזם. במודל Murine שלנו, פ aeruginosa בדרך כלל colonizes מערכת העיכול Murine ברמות בין 5 x אוקטובר 07-05 x 10 8 CFU / g צואה 4. מאז התאושש תוכן cecal הם בערך 0.5 גרם, מספר משוער של פ aeruginosa התאושש משני cecums הוא בין 5 x 07-05 אוקטובר CFU x 8 10. אם מיקרואורגניזמים אחרים נמצאים בשימוש, יהיה זה נבון כדי לוודא רמות קולוניזציה GI ואז לחשב את מספר cecums צריך לשחזר את מספר ממוקד של CFU. חשוב גם לציין כי בעת שימוש במודל זה Murine בפרט, עכברים שטופלו באנטיביוטיקה לא נגוע הרשות אין כמויות מדידים של RNA שבודד תוכן cecal שלהם. מודל Murine שלנו הקולוניזציה Pseudomonas aeruginosa העיכול ומנסה לחקות את הפצת בפתוגנזה של פ בקטרמיה ב סרטן בתאי גזע להשתלה בחולים aeruginosa. באוכלוסיית חולים זו, commensal צומח תיגמר לעתים קרובות משני לטיפול אנטיביוטי או כימותרפיות (למשל דלדול אנטיביוטי של GI commensal הצומח) וכתוצאה מכך צמיחת יתר של חיידקים פתוגניים (למשל מונו בשיתוף עם aeruginosa פ &#39;) ולאחר מכן הפצתו הבאים לאחר דיכוי המערכת החיסונית. היתרונות והמגבלות של מודל זה Murine כבר התייחס בעבר 4. מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מתודולוגיה לבידוד מוחלט RNA של חיידקים מן במערכת העיכול. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם Murine מודלים אחרים ללמוד היבטים אחרים של חיידקים בפתוגנזה של מערכת העיכול (כלומר commensal אינטראקציות הצומח, אפקטים על חיידקי מחלת מעי דלקתית, וכו &#39;). אחד היתרונות של שיטה זו היא שילוב של צעדים תמוגה מרובים כולל הקפאה / הפשרה, שיבוש מכני (כתישה עם homogenization, מרגמה / העלי), רותחים, תמוגה כימיים (למשל SDS). למרות ריבוי הצעדים תמוגה, כמה מיקרואורגניזמים (בעיקר חיידקים גראם חיוביים ופטריות / שמרים) עשויים לדרוש הפרעה מכנית נוספים. לאחר חם תמוגה / חומצת פנול, כלורופורם הדגירה (שלב 3.5), תוספת של חרוזים (0.1 מ&quot;מ עבור חיידקים ו / או 0.5-0.7 מ&quot;מ עבור שמרים), צעד הבאים חרוז פועם צריך להספיק כדי lyse האורגניזמים 9, 10. בהתחשב באופי המורכב של חומרים התאושש מן cecum Murine, חזר קר acid-phenol/chloroform עקירות (שלב 3.7-3.9) נדרשים לחלוטין על מנת להשיג איכות RNA מקובל והיושרה לתגובות במורד נוספת. בין 3-5 קר acid-phenol/chloroform עקירות ייתכן שתידרש לפני הלבן ממשק בין שלבי מימית ואורגנית מסולק. לבסוף, שילוב של הטיפול הן DNase (שלב 4) ו פרוטוקול ניקוי RNeasy (שלב 5) חיוניים הסרת DNA זיהום קטנים שאינם mRNA (5s וגם tRNA). כאמור, ה-RNA התאושש על ידי שימוש בפרוטוקול זה היא בכמות ובאיכות מספקת עבור פרופיל שעתוק הבאים 3, qPCR (לא פורסם), ו-RNA Seq (לא פורסם) ניסויים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> מכתש ועלי </td><td> דיג </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogenizer </td><td> אומני </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge צינורות צנטריפוגה (50 מ&quot;ל) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> חומצה פנול / כלורופורם </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> כלורופורם </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Isoamyl אלכוהול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Diethyl pyrocarbonate (DEPC) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M נתרן אצטט </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% אתנול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna isolation of pseudomonas aeruginosa colonizing the murine gastrointestinal tract

Pseudomonas (רש&quot;פ) aeruginosa זיהומים לגרום תחלואה ותמותה משמעותי ב מארחים בעלי מערכת חיסונית חלשה, כגון חולים עם לוקמיה, פצעים חמורים לשרוף, או השתלות איברים 1. אצל חולים בעלי סיכון גבוה ב לפיתוח זיהומים הרשות הדם, מערכת העיכול (GI) הינו המאגר העיקרי של קולוניזציה 2, אבל המנגנונים שבאמצעותם מעברים הרשות מן חיידק colonizing אסימפטומטיים עד פולשנית, וקטלני לעיתים קרובות, הפתוגן אינם ברורים. בעבר, ביצענו ניסויים פרופיל vivo שעתוק על ידי הרשות מחלים mRNA מתאי חיידקים המתגוררים cecums של קולוניזציה עכברים 3 על מנת לזהות שינויים בביטוי גנים חיידקיים במהלך שינויים מצב החיסון של המארח. בדומה לכל ניסוי פרופיל שעתוק, הצעד שער הגבלת היא בבידוד של כמויות מספיקות של mRNA באיכות גבוהה. לאור שפע של אנזימים, פסולת, שאריות מזון, חומר חלקיקי במערכת העיכול, האתגר של בידוד RNA הוא מרתיע. כאן, אנו מציגים שיטה בידוד אמין לשחזור של RNA חיידקי התאושש העיכול Murine. שיטה זו מנצלת מודל ומבוססת Murine של קולוניזציה GI הרשות נויטרופניה-Induced הפצת 4. קולוניזציה GI פעם עם הרשות הפלסטינית הוא אישר, עכברים הם מורדמים תוכן ו cecal הם התאושש פלאש קפוא. RNA מופק אז באמצעות שילוב של הפרעה מכנית, רותחים, פנול / כלורופורם עקירות, טיפול DNase ו כרומטוגרפיה זיקה. כמות וטוהר יאושרו על ידי לספקטרופוטומטריה (טכנולוגיות Nanodrop) ו bioanalyzer (Agilent Technologies) (איור 1). שיטה זו של בידוד חיידקים במערכת העיכול RNA יכול בקלות להיות מותאם חיידקים ופטריות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract at JoVE.com

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

שיטה אמינה הבידוד של RNA<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; התאושש cecums Murine מתואר. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טכניקה זו ניתן להתאים עבור בידוד RNA של חיידקים במעיים אחרים.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

19.1K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. שיטה אמינה הבידוד של RNA Pseudomonas aeruginosa התאושש cecums Murine מתואר. RNA התאושש היא בכמות ובאיכות מספקת עבור qPCR הבאים, פרופיל שעתוק, ו-RNA ניסויים Seq. טכניקה זו ניתן להתאים עבור בידוד RNA של חיידקים במעיים אחרים.

Video: RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

ויזואליזציה של קנדידה אלביקנס במערכת העיכול מוריין באמצעות פלורסנט היברידיזציה באתרו

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

תרבות של וריאציה של המושבה הקטנה של הפסאודומונס וככמת של האלגיאט

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...