Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health concede AI62983 (ayk), AI22535 (GPB).

1. Modello murino di P. aeruginosa GI colonizzazione e diffusione <ol><li> Topi C3H/HeN (6-8 settimane vecchio, femmina, Harlan) sono trattati con antibiotici per via orale ad esaurire flora commensale e poi mono-colonizzati da PA come descritto in precedenza 4. </li></ol> 2. La raccolta murini contenuto del cieco Luminal <ol><li> Immergere un mortaio pulito in acciaio inox in una vasca di azoto liquido. </li><li> Euthanize topi per asfissia di anidride carbonica. </li><li> Topo carcassa sicuro su una tavola di polistirolo e doccia con etanolo al 95%. Fai una incisione mediana longitudinale attraverso la pelle dallo sterno al perineo. Riflettono la pelle e peritoneo per esporre la cavità addominale. </li><li> Resecare il cieco intero. Tenere il cieco con una pinza sopra la malta in acciaio inox. Snip entrambe le estremità del cieco con le forbici dissezione. </li><li> Inserire una punta P1000 pipetta riempita con 1 ml di tampone flushate del cieco (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, 200 mM NaCl) 5 nelle estremità prossimale del cieco. Svuotare il buffer del cieco flushate e del cieco contenuto luminale nel mortaio in acciaio inox. 1 ml di tampone flushate del cieco sarà sufficiente per il lavaggio di tutto il contenuto del cieco. Cecale contenuti flushate si blocca subito dopo entrare in contatto con la malta. </li><li> Macinare il contenuto flushate del cieco con un pestello sterile. </li><li> Terreno posto ghiacciato del cieco contenuto luminale in una provetta 50 ml conica in polipropilene immerso in un ghiaccio secco / etanolo bagno. </li><li> Ripetere i punti 2,2 per 2,7 per ogni mouse aggiuntivo. </li><li> Conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. Batteriche RNA Isolation <ol><li> Caldo 1 volume (in base al volume finale di due contenuti del cieco del lume, circa 3 ml) di acido fenolo / cloroformio (5:1, v / v) contenuta in un tubo 50 ml per centrifuga Oak Ridge con il tappo fissato in parafilm in 65 ° C acqua sporca. </li><li> Fate bollire 0,5 volume di tampone di lisi (2% SDS, 16 mM EDTA, 200 mM NaCl) 6 contenuta in un tubo in polipropilene da 50 ml conica per 5 minuti. </li><li> Aggiungi tampone bollente lisi del cieco a contenuto luminale. Omogeneizzare. Fate bollire per 5 minuti con vortex periodica. </li><li> Aggiungere i 100 ° C il contenuto del cieco / campione lisi ai 65 ° C acido fenolo / cloroformio nella provetta da centrifuga Oak Ridge. Con tappo a tenuta con parafilm. </li><li> Incubare a 65 ° C per 10 minuti con vortex periodico (ogni 2 minuti). </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. </li><li> Con attenzione trasferimento fase acquosa (evitando qualsiasi dell&#39;interfaccia bianco) per un nuovo 50 ml centrifuga Oak Ridge. Il volume della fase acquosa sarà circa il 50% del volume totale dei contenuti del cieco, tampone di lisi, e acido fenolo / cloroformio. Aggiungere un volume equivalente di acido fenolo / cloroformio. </li><li> Con tappo a tenuta con parafilm e mescolare bene nel vortex ad alta velocità. </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,9 finché non ci sarà alcuna interfaccia visibile bianco tra le fasi acquosa e organica. </li><li> Con attenzione trasferimento fase acquosa in una nuova centrifuga 50 ml Oak Ridge. Aggiungere un uguale volume di cloroformio / alcool isoamilico (24:1, v / v). </li><li> Guarnizione tappo e mescolare bene nel vortex. </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 15 minuti. Rimuovere fase acquosa (volume sarà circa il 50% del volume totale di reazione) a 15 tubo di polipropilene ml e aggiungere un uguale volume di isopropanolo. </li><li> Incubare a -20 ° per almeno 2 ore o durante la notte. </li><li> Centrifugare campione a 2.500 g a 4 ° per 45 minuti. Un gel-like pellet si forma sul fondo della provetta. Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70%. Vortex. Centrifugare a campione a 10.000 g a 4 ° per 5 minuti. </li><li> Rimuovere il supernatante e invertire il tubo per far asciugare il pellet a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Risospendere il pellet di RNA in 200 ml di acqua RNase-free. </li></ol> 4. DNasi Trattamento (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems) <ol><li> Aggiungere 20 ml di tampone 10X Turbo DNasi e 2 microlitri Turbo DNasi e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare a 37 ° per 20 minuti. </li><li> Aggiungere 20 ml di reagente risospeso inattivazione DNasi e mescolare bene. </li><li> Incubare 5 minuti a temperatura ambiente, mescolando di tanto in tanto. </li><li> Centrifugare a 10.000 g a temperatura ambiente per 1,5 minuti e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga nuovo. </li><li> Aggiungere un volume di freddo (4 °) L&#39;acido fenolo / cloroformio e mescolare accuratamente vortexando per 1 minuto. </li><li> Centrifugare a 12.500 g a temperatura ambiente per 2 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta e aggiungere 1 volume di cloroformio / alcool isoamilico (49:1 v / v), vortice. </li><li> Centrifugare a 12.500 g a temperatura ambiente per 2 minuti. </li><li> Trasferire la fase acquosa (circa il 50% del volume totale di reazione) in una nuova provetta. </li><li> Aggiungere 0,1 volumi di acetato di sodio 3M pH 5.5 e2,5 volumi di ghiaccio freddo etanolo al 100%. Vortex. </li><li> Incubare a -20 ° per almeno 2 ore oa -80 ° per 30 minuti. </li><li> Centrifugare a 12.000 g per 30 minuti a 4 ° </li><li> Rimuovere il surnatante. </li><li> Lavare il pellet con 1 ml di ghiacciata etanolo al 70% per centrifugazione per 5 minuti a 10.000 g a 4 °. </li><li> Rimuovere il surnatante e l&#39;aria secca per 10 minuti. </li><li> Risospendere il pellet in 100 ml di acqua RNase-free. Potrebbe essere necessario posto nel 65 ° di durezza bagno per risospendere e sciogliere il precipitato. </li><li> Per testare l&#39;efficacia del trattamento DNasi, una RT-PCR, reazione standard per l&#39;amplificazione di una proteina ribosomiale (o gene altro riferimento) potrebbe essere eseguito per campioni trattati e non trattati, con nessun controllo RT. </li></ol> 5. RNA sottofase di cancellazione (Qiagen, RNeasy Kit) <ol><li> Fare riferimento alle pagine 56-57 della Qiagen RNeasy Mini Handbook (4 ª edizione, aprile 2006). Seguite le indicazioni fornite. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati La quantità di RNA batterico totale recuperati utilizzando questo protocollo è di circa 2-3 mg da due cecums. L&#39;RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l&#39;RNA esperimenti Seq. Purezza RNA è normalmente valutata misurando il rapporto 260nm/280nm 7 del campione, ma questo metodo non fornisce alcuna informazione circa l&#39;integrità di RNA. Il Bioanalyzer Agilent è una piattaforma basata su microfluidica per il dimensionamento, la quantificazione e il controllo della qualità del DNA, RNA, proteine ​​e cellule, e utilizza una metrica integrità RNA conosciuta come numero di integrità dell&#39;RNA (RIN) 8. RNA estratto con questo protocollo produce 260/280 rapporti che vanno dal 1,7-2,0 e valori RIN ≥ 7.0. Un esempio di analisi Agilent Bioanalyzer dell&#39;RNA batterico recuperato da questo protocollo è illustrato nella figura 1. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Agilent Bioanalyzer elettroferogramma e gel-come immagine di Pseudomonas aeruginosa totale del campione di RNA isolati e recuperati da topo contenuti del cieco. RIN 8.0.

<ol>
	<li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li><li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endemicity,+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units.">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li><li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia.">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li><li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples.">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li><li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR.">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li><li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations.">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li><li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li><li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins.">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo di estrazione di RNA qui descritto consente il recupero di una quantità sufficiente di alta qualità RNA totale Pseudomonas aeruginosa raccolte dal tratto GI murino. Questo metodo non si limita a P. aeruginosa e possono potenzialmente essere applicato ad altri batteri. Il recupero di organismi microbici sufficiente da parte dell&#39;intestino varia significativamente da un organismo all&#39;altro. Nel nostro modello murino, P. aeruginosa tipicamente colonizza il tratto gastrointestinale murino a livelli tra 5 x 10 7 a 5 x 10 8 CFU / g feci 4. Dal momento che il contenuto recuperato del cieco sono circa 0,5 grammi, il numero stimato di P. aeruginosa recuperato da due cecums è compresa tra 5 x 10 7 a 5 x 10 8 cfu. Se altri microrganismi vengono utilizzati, sarebbe prudente per verificare i livelli di colonizzazione GI e quindi calcolare il numero di cecums necessari per recuperare il numero mirato di cfu. E &#39;anche importante notare che quando si utilizza questo particolare modello murino, topi trattati con antibiotico non infettati con PA non quantificabile quantità di RNA isolati dal loro contenuto cecale. Il nostro modello murino di colonizzazione Pseudomonas aeruginosa gastrointestinale e tentativi di diffusione di emulare la patogenesi di P. aeruginosa batteriemia nel cancro e pazienti sottoposti a trapianto di cellule staminali. In questa popolazione di pazienti, la flora commensale è spesso impoverito secondaria al trattamento con antibiotici o chemioterapici (ad esempio l&#39;esaurimento antibiotico di GI flora commensale) con conseguente proliferazione di microbi patogeni (ad esempio mono-associazione con P. aeruginosa) e successiva diffusione, dopo la soppressione immunitaria. I vantaggi ei limiti di questo modello murino sono già stati affrontati in precedenza 4. Lo scopo di questo studio è di fornire una metodologia per isolare microbica RNA totale dal tratto GI. Questo protocollo può essere facilmente adattato ad altri modelli murini che lo studio di altri aspetti della patogenesi microbica nel tratto gastrointestinale (per esempio la flora commensale interazioni, effetti batterica sulle malattie infiammatorie intestinali, ecc.) Un vantaggio di questo metodo è l&#39;incorporazione di passi lisi multiple compreso gelo / disgelo, distruzione meccanica (polverizzando con malta / pestello, omogeneizzazione), bollitura, e lisi chimica (per esempio, SDS). Nonostante la moltitudine di passi lisi, alcuni microrganismi (in particolare batteri Gram-positivi e funghi / lievito) possono richiedere ulteriori rottura meccanica. Dopo il caldo lisi / acido fenolo-cloroformio incubazione (Step 3.5), l&#39;aggiunta di perline (0,1 mm per i batteri e / o di 0,5-0,7 mm per lievito) e una successiva perline battendo passo dovrebbe essere sufficiente per lisare questi organismi 9, 10. Data la natura complessa del materiale recuperato dal topo cieco, le ripetute freddo estrazioni acid-phenol/chloroform (Passo 3,7-3,9) sono assolutamente necessari per ottenere qualità accettabile RNA e l&#39;integrità per ulteriori reazioni a valle. Tra i 3-5 freddo estrazioni acid-phenol/chloroform può essere richiesto prima che l&#39;interfaccia bianca tra le fasi acquosa e organica è eliminata. Infine, la combinazione di entrambi i trattamenti DNasi (punto 4) e il protocollo di pulizia RNeasy (Fase 5) sono essenziali per la rimozione del DNA contaminante e piccoli non-mRNA (5s e tRNA). Come affermato in precedenza, l&#39;RNA recuperato utilizzando questo protocollo è di quantità e qualità sufficienti per il profiling di trascrizione successivi 3, qPCR (inedito), e RNA Seq (inedito) esperimenti.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Mortaio e pestello </td><td> Pescatore </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Omogeneizzatore </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge provette (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Acido fenolo / cloroformio </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> L&#39;alcol isoamilico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Dietil pirocarbonato (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNasi </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M sodio acetato </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% di etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna isolation of pseudomonas aeruginosa colonizing the murine gastrointestinal tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) causa infezioni in significativa morbidità e mortalità in host con sistema immunitario compromesso, come i pazienti affetti da leucemia, gravi ustioni, o trapianti di organi 1. Nei pazienti ad alto rischio di sviluppare infezioni del sangue PA, il tratto gastrointestinale (GI) è il principale serbatoio per la colonizzazione 2, ma i meccanismi con cui transizioni PA da un microbo ad una colonizzazione asintomatica invasiva, e spesso mortale, patogeno non sono chiare. In precedenza, abbiamo effettuato esperimenti in vivo profilazione trascrizione mRNA PA attraverso il recupero di cellule batteriche residenti nel cecums di topi colonizzati 3, per identificare i cambiamenti nell&#39;espressione genica batterica durante alterazioni dello stato immunitario dell&#39;ospite. Come con qualsiasi esperimento profilazione trascrizione, il fattore limitante è l&#39;isolamento di una sufficiente quantità di mRNA di alta qualità. Data l&#39;abbondanza di enzimi, detriti, residui di cibo, e particolato nel tratto gastrointestinale, la sfida di isolamento dell&#39;RNA è scoraggiante. Qui, vi presentiamo un metodo per l&#39;isolamento affidabile e riproducibile di RNA batterico recuperato dal tratto GI murino. Questo metodo utilizza un consolidato modello murino di colonizzazione PA GI e neutropenia indotta dalla diffusione 4. Colonizzazione volta GI con PA è confermata, i topi sono contenuti eutanasia e del cieco vengono recuperati e flash congelati. L&#39;RNA viene poi estratta usando una combinazione di distruzione meccanica, bollitura, fenolo / cloroformio estrazioni, trattamento DNase, e cromatografia di affinità. Quantità e la purezza sono confermati da spettrofotometria (Tecnologie NanoDrop) e Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Questo metodo di isolamento microbico GI RNA può essere facilmente adattato ad altri batteri e funghi, come pure.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Un metodo affidabile per l&#39;isolamento di RNA<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Recuperato da cecums murino è descritto. L&#39;RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l&#39;RNA esperimenti Seq. Questa tecnica può essere adattata per l&#39;isolamento di RNA di altri microbi intestinali.

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

rna-isolation-pseudomonas-aeruginosa-colonizing-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

19.1K Views.  University of Texas Southwestern Medical Center. Un metodo affidabile per l'isolamento di RNA Pseudomonas aeruginosa Recuperato da cecums murino è descritto. L'RNA recuperato è di quantità e qualità sufficienti per qPCR successivi, profili di trascrizione, e l'RNA esperimenti Seq. Questa tecnica può essere adattata per l'isolamento di RNA di altri microbi intestinali.

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Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing the mucosal surface of the nasopharynx, where it can reside, multiply and eventually overcome host defences to invade to other tissues of the host. Establishment of an infection in the normally lower respiratory tract results in pneumonia. Alternatively, the bacteria can disseminate into the bloodstream causing bacteraemia, which is associated with high mortality rates2, or else lead directly to the development of pneumococcal meningitis. Understanding the kinetics of, and immune responses to, nasopharyngeal colonization is an important aspect of S. pneumoniae infection models.
Our mouse model of intranasal colonization is adapted from human models3 and has been used by multiple research groups in the study of host-pathogen responses in the nasopharynx4-7. In the first part of the model, we use a clinical isolate of S. pneumoniae to establish a self-limiting bacterial colonization that is similar to carriage events in human adults. The procedure detailed herein involves preparation of a bacterial inoculum, followed by the establishment of a colonization event through delivery of the inoculum via an intranasal route of administration. Resident macrophages are the predominant cell type in the nasopharynx during the steady state. Typically, there are few lymphocytes present in uninfected mice8, however mucosal colonization will lead to low- to high-grade inflammation (depending on the virulence of the bacterial species and strain) that will result in an immune response and the subsequent recruitment of host immune cells. These cells can be isolated by a lavage of the tracheal contents through the nares, and correlated to the density of colonization bacteria to better understand the kinetics of the infection.

Characterization of Inflammatory Responses During Intranasal Colonization with Streptococcus pneumoniae

Colonization of the murine nasopharynx with Streptococcus pneumoniae and the subsequent extraction of adherent or recruited cells is described. This technique involves flushing the nasopharynx and collection of the fluid through the nares and is adaptable for various readouts, including differential cell quantification and analysis of mRNA expression in situ.

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Nasopharyngeal colonization by Streptococcus pneumoniae is a prerequisite to invasion to the lungs or bloodstream1. This organism is capable of colonizing ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Long Term cronica<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Infezione delle vie aeree nei topi

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression of a fluorescent reporter. Here, we highlight an alternative usage of this instrument, for sorting worms according to their degree of colonization by a GFP-expressing pathogen. This new usage allowed us to address the relationship between colonization of the worm intestine and induction of immune responses. While C. elegans immune responses to different pathogens have been documented, it is still unknown what initiates them. The two main possibilities (which are not mutually exclusive) are recognition of pathogen-associated molecular patterns, and detection of damage caused by infection. To differentiate between the two possibilities, exposure to the pathogen must be dissociated from the damage it causes. The wormsorter enabled separation of worms that were extensively-colonized by the Gram-negative pathogen Pseudomonas aeruginosa, with the damage likely caused by pathogen load, from worms that were similarly exposed, but not, or marginally, colonized. These distinct populations were used to assess the relationship between pathogen load and the induction of transcriptional immune responses. The results suggest that the two are dissociated, supporting the possibility of pathogen recognition.

Automated Separation of C. elegans Variably Colonized by a Bacterial Pathogen

The wormsorter facilitates genetic screens in Caenorhabditis elegans by sorting worms according to expression of fluorescent reporters. Here, we describe a new usage:&#160;sorting according to colonization by a GFP-expressing pathogen, and we employ it to examine the poorly understood role of pathogen recognition in initiating immune responses.

Separazione automatica di<em&gt; C. elegans</em&gt; Variabilmente Colonizzato da un batterio patogeno

The wormsorter is an instrument analogous to a FACS machine that is used in studies of Caenorhabditis elegans, typically to sort worms based on expression ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Utilizzo Mini-<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesi Mariner Transposon-mediata

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studiare comunità microbiche<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modello di interazione ospite-mediata tra<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nei Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

Un modello murino di Gruppo B<em&gt; Streptococcus</em&gt; Colonizzazione vaginale

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolamento di singole comunità batteriche intracellulari generati da un modello murino di infezione delle vie urinarie per analisi unicellulare a valle

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is known for its ability to form biofilms that are protected by a matrix of exopolysaccharides. This matrix allows the microorganisms to be more resilient to external factors, including antibiotic treatment. One of the most common methods of biofilm growth for research is in microtiter plates or chambered slides. The advantage of these systems is that they allow for the testing of multiple growth conditions, but their disadvantage is that they produce limited amounts of biofilm for RNA extraction. The purpose of this article is to provide a detailed, step by step protocol on how to extract total RNA from small amounts of biofilm of sufficient quality and quantity for high throughput sequencing. This protocol allows for the study of gene expression within these biofilm systems.

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

This protocol presents a method to isolate RNA from Pseudomonas aeruginosa biofilms grown in chamber slides for high throughput sequencing.

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen that causes infections in the airways of cystic fibrosis (CF) patients. P. aeruginosa is ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

Modelli di colonizzazione vaginale murina da parte di batteri cresciuti anaerobicamente

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Isolamento del RNA Pseudomonas aeruginosa Colonizzare la Murine tratto gastrointestinale

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Caratterizzazione delle risposte infiammatorie durante la colonizzazione intranasale con streptococco pneumoniae

Long Term cronica

Separazione automatica di

Identificazione di geni novelli associati con alginato di produzione in

Studiare comunità microbiche

Un modello murino di Gruppo B

Isolamento di singole comunità batteriche intracellulari generati da un modello murino di infezione delle vie urinarie per analisi unicellulare a valle

Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse

Isolation of Total RNA from Pseudomonas aeruginosa within Biofilms for Measuring Gene Expression

Modelli di colonizzazione vaginale murina da parte di batteri cresciuti anaerobicamente