Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health gewährt AI62983 (AYK), AI22535 (GPB) finanziert.

1. Mausmodell der P. aeruginosa GI Colonization und Verbreitung <ol><li> C3H/HeN-Mäusen (6-8 Wochen alt, weiblich, Harlan) mit oralen Antibiotika behandelt werden, um Kommensalflora führen und dann mono-kolonisierten mit PA wie zuvor 4 beschrieben. </li></ol> 2. Harvesting Murine Blinddarm Luminal Inhalt <ol><li> Tauchen Sie ein gereinigtes Edelstahl Mörtel in ein Bad aus flüssigem Stickstoff. </li><li> Euthanize Mäusen durch Kohlendioxid Ersticken. </li><li> Sichere Maus Karkasse auf einer Styropor-Platte und eine Dusche mit 95% Ethanol. Machen Sie eine Mittellinie Längsschnitt durch die Haut vom Brustbein zu den Damm. Zurückhalten der Haut und des Bauchfells in die Bauchhöhle aussetzen. </li><li> Resektion des gesamten Blinddarm. Halten Sie den Blinddarm mit einer Pinzette auf dem Edelstahl-Mörtel. Snip beiden Enden des Blinddarms mit Dissektion Schere. </li><li> Legen Sie eine P1000 Pipettenspitze mit 1 ml cecal flushate Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 200 mM NaCl) 5 in das proximale Ende des Blinddarms gefüllt. Spülen Sie den Blinddarm flushate Puffer und cecal luminalen Inhalte in die Edelstahl-Mörtel. 1 ml der Blinddarm flushate Puffer ausreichen wird für die Spülung alle cecal Inhalte. Blinddarm flushate Inhalte umgehend einfrieren bei Kontakt mit dem Mörtel. </li><li> Grind der Blinddarm flushate Inhalt mit einem sterilen Pistill. </li><li> Legen Boden gefroren cecal luminalen Inhalt in ein 50 ml Polypropylen-konischen Rohr in einem Trockeneis / Ethanol getaucht. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.2 bis 2.7 für jede weitere Maus. </li><li> Lagerung bei -80 ° C. </li></ol> 3. Bakterielle RNA Isolation <ol><li> Warm 1 Volumen (auf Grundlage Endvolumen von zwei cecal luminalen Inhalte, etwa 3 ml) von saurem Phenol / Chloroform (5:1, v / v) in einer 50 ml Oak Ridge Zentrifugenröhrchen mit der Mütze in Parafilm in einer 65 gesichert enthaltenen ° C Wasserbad. </li><li> Boil 0,5 Volumen Lysepuffer (2% SDS, 16 mM EDTA und 200 mM NaCl) 6 in 50 ml Polypropylen-konischen Rohr für 5 Minuten enthalten. </li><li> Kochendem Lysepuffer cecal luminalen Inhalte. Homogenisieren. 5 Minuten lang kochen mit periodischen Vortexen. </li><li> Fügen Sie die 100 ° C cecal Inhalte / Lyse Probe auf die 65 ° C Säure Phenol / Chloroform in den Oak Ridge Zentrifugenröhrchen. Seal cap mit Parafilm. </li><li> Inkubation bei 65 ° C für 10 Minuten mit periodischen Vortexen (alle 2 Minuten). </li><li> Centrifuge Probe bei 2.500 g bei 4 ° für 15 Minuten. </li><li> Sorgfältig Transfer wässrigen Phase (Vermeidung eines der weißen Schnittstelle) in ein frisches 50 ml Oak Ridge Zentrifuge. Das Volumen der wässrigen Phase wird ca. 50% des Gesamtvolumens der Blinddarm Inhalte, Lysepuffer und saure Phenol / Chloroform werden. Fügen Sie dem gleichen Volumen an Säure Phenol / Chloroform. </li><li> Seal cap mit Parafilm und mischen Sie gut durch Vortexen mit hoher Geschwindigkeit. </li><li> Centrifuge Probe bei 2.500 g bei 4 ° für 15 Minuten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3,7 bis 3,9, bis keine sichtbaren weißen Schnittstelle zwischen der wässrigen und der organischen Phase. </li><li> Sorgfältig Transfer wässrige Phase in ein frisches 50 ml Oak Ridge Zentrifuge. Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24:1, v / v). </li><li> Seal cap und gut mischen durch Vortexen. </li><li> Centrifuge Probe bei 2.500 g bei 4 ° für 15 Minuten. Entfernen wässrigen Phase (Volumen ca. 50% der gesamten Reaktionsvolumen werden) auf 15 ml Polypropylen-konischen Rohr und ein gleiches Volumen an Isopropanol. </li><li> Inkubation bei -20 ° für mindestens 2 Stunden oder über Nacht. </li><li> Centrifuge Probe bei 2.500 g bei 4 ° für 45 Minuten. Eine gelartige Pellet wird an der Unterseite des Rohres bilden. Überstand entfernen. </li><li> Waschen des Pellets mit 1 ml eiskaltem 70% Ethanol. Vortex. Centrifuge Probe bei 10.000 g bei 4 ° C für 5 Minuten. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und das Röhrchen, das Pellet bei Raumtemperatur trocknen lassen für 10 Minuten. </li><li> Die RNA Pellet in 200 ul RNase-freiem Wasser. </li></ol> 4. DNase-Behandlung (Turbo DNA-Free, Applied Biosystems) <ol><li> Add 20 ul 10x Turbo DNase-Puffer und 2 ul Turbo DNase und vorsichtig mischen. </li><li> Bei 37 ° für 20 Minuten. </li><li> Add 20 ul resuspendiert DNase Inaktivierung Reagenz und gut mischen. </li><li> Inkubieren 5 Minuten bei Raumtemperatur, Mischen gelegentlich. </li><li> Zentrifuge bei 10.000 g bei Raumtemperatur für 1,5 Minuten und den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie ein Volumen von kaltem (4 °) Säure Phenol / Chloroform und gründlich durch Vortexen für 1 Minute. </li><li> Zentrifuge bei 12.500 g bei Raumtemperatur für 2 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase in ein neues Röhrchen geben und 1 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (49:1 v / v), Vortex. </li><li> Zentrifuge bei 12.500 g bei Raumtemperatur für 2 Minuten. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Phase (ca. 50% der gesamten Reaktionsvolumen) in ein neues Röhrchen. </li><li> Add 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat, pH 5,5 und2,5 Volumina eiskaltem 100% Ethanol. Vortex. </li><li> Inkubation bei -20 ° für mindestens 2 Stunden oder bei -80 ° für 30 Minuten. </li><li> Zentrifuge bei 12.000 g für 30 Minuten bei 4 ° </li><li> Überstand entfernen. </li><li> Waschen des Pellets mit 1 ml eiskaltem 70% igem Ethanol durch Zentrifugation für 5 Minuten bei 10.000 g bei 4 °. </li><li> Entfernen Sie den Überstand und an der Luft trocknen für 10 Minuten. </li><li> Das Pellet in 100 ul RNase-freiem Wasser. Möglicherweise müssen Sie in 65 ° Wasserbad Ort zu resuspendieren und lösen das Pellet. </li><li> Zur Überprüfung der Wirksamkeit der DNase Behandlung könnte eine Standard-RT-PCR-Reaktion zur Amplifikation eines ribosomalen Proteins (oder einer anderen Referenz-Gen) für behandelten und nicht behandelten Proben durchgeführt werden, wobei keine RT steuert. </li></ol> 5. RNA Cleanup Step (Qiagen, RNeasy Kit) <ol><li> Siehe Seiten 56-57 des Qiagen RNeasy Mini Handbook (4. Auflage, April 2006). Folgen Sie wie angegeben. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Die Menge der bakteriellen Gesamt-RNA mit Hilfe dieses Protokolls gewonnen wird etwa 2-3 pg von zwei cecums. Die RNA zurückgewonnen wird in ausreichender Menge und Qualität für die anschließende qPCR, Transkription Profiling und RNA Seq Experimente. RNA Reinheit wird routinemäßig durch die Messung der 260nm/280nm Verhältnis 7 der Probe untersucht, doch ist diese Methode liefert keine Informationen über RNA-Integrität. Die Agilent Bioanalyzer ist ein Mikrofluidik-basierte Plattform für die Dimensionierung, Quantifizierung und Qualitätskontrolle von DNA, RNA, Proteine ​​und Zellen, und nutzt eine RNA Integrität metrischen als RNA Integrity Number (RIN) 8 bekannt. RNA extrahiert mit diesem Protokoll produziert 260/280 Verhältnissen zwischen 1,7 bis 2,0 und RIN-Werte ≥ 7,0. Ein Beispiel für eine Agilent Bioanalyzer Analyse der bakteriellen RNA durch dieses Protokoll zurückgewonnen wird in Abbildung 1 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/3293/3293fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Agilent Bioanalyzer Elektropherogramm und gelartige Bild von Pseudomonas aeruginosa RNA-Probe isoliert und erholte sich von murinen cecal Inhalte. RIN 8,0.

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	<li>Bodey, G. P., Bolivar, R., Fainstein, V., Jadeja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infections+caused+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Infections caused by Pseudomonas aeruginosa.</a> Rev Infect Dis. 5, 279-279 (1983).</li><li>Bertrand, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endemicity,+molecular+diversity+and+colonisation+routes+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+intensive+care+units.">Endemicity, molecular diversity and colonisation routes of Pseudomonas aeruginosa in intensive care units.</a> Intensive Care Med. 27, 1263-1268 (2001).</li><li>Koh, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+in+vivo+transcription+profiling+for+identifying+Pseudomonas+aeruginosa+genes+needed+for+gastrointestinal+colonization+and+dissemination.">Utility of in vivo transcription profiling for identifying Pseudomonas aeruginosa genes needed for gastrointestinal colonization and dissemination.</a> PLoS One. 5, e15131-e15131 (2010).</li><li>Koh, A. Y., Priebe, G. P., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+gastrointestinal+colonization+and+dissemination+in+neutropenia.">Virulence of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of gastrointestinal colonization and dissemination in neutropenia.</a> Infect Immun. 73, 2262-2272 (2005).</li><li>Alexander, R. J., Raicht, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+total+RNA+from+human+stool+samples.">Purification of total RNA from human stool samples.</a> Dig Dis Sci. 43, 2652-2658 (1998).</li><li>Fitzsimons, N. A., Akkermans, A. D., de Vos, W. M., Vaughan, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+gene+expression+detected+in+human+faeces+by+reverse+transcription-PCR.">Bacterial gene expression detected in human faeces by reverse transcription-PCR.</a> J Microbiol Methods. 55, 133-140 (2003).</li><li>Manchester, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+UV+methods+for+measurement+of+protein+and+nucleic+acid+concentrations.">Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations.</a> Biotechniques. 20, 968-970 (1996).</li><li>Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RIN:+an+RNA+integrity+number+for+assigning+integrity+values+to+RNA+measurements.">The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements.</a> BMC Mol Biol. 7, 3-3 (2006).</li><li>Turnbaugh, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+gut+microbiome+in+obese+and+lean+twins.">A core gut microbiome in obese and lean twins.</a> Nature. 457, 480-484 (2009).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die RNA-Extraktion hier beschriebene Methode ermöglicht die Wiederherstellung von ausreichenden Mengen an hochwertigen Pseudomonas aeruginosa Gesamt-RNA aus den murinen GI-Trakt geerntet. Diese Methode ist nicht auf P. eingeschränkt aeruginosa und kann potenziell auf andere Bakterien eingesetzt werden. Die Erholung der ausreichend Mikroorganismen aus dem Darm wird erheblich variieren von Organismus zu Organismus. In unserem Mausmodell, P. aeruginosa in der Regel besiedelt das murine GI-Trakt auf einem Niveau zwischen 5 x 07 bis 5 Oktober x 10 8 KBE / g Kot 4. Da das gewonnene cecal Inhalte sind etwa 0,5 Gramm, die geschätzte Zahl der P. aeruginosa aus zwei cecums zurückgewonnen wird zwischen 5 x 07 bis 5 Oktober x 10 8 KBE. Wenn andere Mikroorganismen eingesetzt werden, wäre es klug, um GI Kolonisierung Ebenen zu überprüfen und dann die Berechnung der Anzahl der cecums benötigt, um die angestrebte Zahl von cfu erholen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass bei der Verwendung dieser speziellen Maus-Modell, Antibiotika-behandelten Mäusen nicht mit PA infizierten keine quantifizierbare Mengen an RNA aus ihren Blinddarm Inhalte isoliert zu haben. Unsere Mausmodell der Pseudomonas aeruginosa Magen-Darm-Kolonisation und Verbreitung versucht, die Pathogenese von P. emulieren aeruginosa Bakteriämie bei Krebs und Stammzellentransplantation Patienten. In dieser Patientengruppe ist Kommensalflora oft erschöpft sekundär zu Antibiotikum oder chemotherapeutischen Behandlung (zB das Antibiotikum Erschöpfung der GI Kommensalflora), was zu einem überschießenden Wachstum pathogener Keime (zB Mono-Verbindung mit P. aeruginosa) und dann anschließenden Verbreitung nach Immunsuppression. Die Vorteile und Grenzen dieses Mausmodell wurden bereits zuvor 4 behandelt. Der Zweck dieser Studie besteht darin, eine Methode zur Isolierung von mikrobiellen Gesamt-RNA aus dem Gastrointestinaltrakt stellen. Dieses Protokoll kann leicht auf andere Mausmodellen, dass andere Aspekte der mikrobiellen Pathogenese im GI-Trakt (zB Kommensalflora Interaktionen, bakterielle Wirkung auf entzündliche Darmerkrankungen, etc.) Studie angepasst werden. Ein Vorteil dieser Methode ist der Einbau von mehreren Lyse Schritte einschließlich Frost / Tau, mechanische Störungen (Pulverisieren mit Mörtel / Stößel, Homogenisierung), Kochen und chemische Lyse (z. B. SDS). Trotz der Vielzahl der Lyse Schritte können einige Mikroorganismen (insbesondere Gram-positive Bakterien und Pilze / Hefen) erfordern zusätzliche mechanische Störungen. Nach dem heißen Lyse / Säure-Phenol-Chloroform-Inkubation (Schritt 3,5), die Zugabe von Glasperlen (0,1 mm für Bakterien und / oder 0,5-0,7 mm für Hefe) und einer anschließenden bead-schlagen Schritt sollte ausreichen, um diese Organismen 9 lysieren, 10. Angesichts der komplexen Natur der Materialien aus der murinen Blinddarm, den wiederholten kalten acid-phenol/chloroform Extraktionen (Schritt 3,7 bis 3,9) gewonnen werden, unbedingt erforderlich, um akzeptable RNA Qualität und Integrität für nachgelagerte Reaktionen zu erzielen. Zwischen 3-5 kalten acid-phenol/chloroform Extraktionen können, bevor die weißen Schnittstelle zwischen der wässrigen und der organischen Phase erforderlich ist eliminiert. Schließlich sind die Kombination der beiden DNase-Behandlung (Schritt 4) und RNeasy Cleanup-Protokoll (Schritt 5) Voraussetzung für das Entfernen kontaminierenden DNA und kleinen Nicht-mRNA (5s und tRNA). Wie bereits erwähnt, ist die RNA durch die Nutzung dieses Protokoll wieder in ausreichender Menge und Qualität für die spätere Transkription Profilierung 3, qPCR (unveröffentlicht), und RNA Seq (unveröffentlicht) Experimente.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th></tr><tr><td> Mörser und Stößel </td><td> Fischer </td><td> 12-947-1 </td></tr><tr><td> Homogenisator </td><td> Omni </td><td> TM-125 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Zentrifugenröhrchen (50 ml) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td></tr><tr><td> Saure Phenol / Chloroform </td><td> Ambion </td><td> AM9720 </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td></tr><tr><td> Isoamylalkohol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> W205702 </td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 190764 </td></tr><tr><td> Diethyl (DEPC) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 40718 </td></tr><tr><td> DNase </td><td> Ambion </td><td> AM2238 </td></tr><tr><td> RNeasy Kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> 3M Natriumacetat </td><td> Ambion </td><td> AM9740 </td></tr><tr><td> 100% Ethanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7023 </td></tr></tbody></table>

rna isolation of pseudomonas aeruginosa colonizing the murine gastrointestinal tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) Infektionen führen zu einer signifikanten Morbidität und Mortalität in der Hosts mit geschwächtem Immunsystem, wie Patienten mit Leukämie, schwere Brandwunden oder Organtransplantationen 1. Bei Patienten mit hohem Risiko für die Entwicklung von PA Infektionen der Blutbahn, ist die gastrointestinale (GI-Trakt) der Haupt-Reservoir für die Besiedlung 2, aber die Mechanismen, durch die PA Übergänge von einer asymptomatischen Besiedlung Mikrobe zu einem invasiven und oft tödlich, sind Erreger unklar. Zuvor führten wir in vivo Transkription Profiling Experimenten durch die Rückgewinnung von PA mRNA aus Bakterienzellen mit Wohnsitz in den cecums der kolonisierten Mäusen 3 im Hinblick auf Veränderungen in der bakteriellen Genexpression während Änderungen an der Host-Immunstatus zu identifizieren. Wie bei jedem Transkriptionsprofilierung Experiment wird der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Isolierung von ausreichenden Mengen an hochwertigen mRNA. Angesichts der Fülle von Enzymen, Schutt, Speisereste und Feinstaub in der GI-Trakt, ist die Herausforderung der RNA-Isolierung entmutigend. Hier präsentieren wir eine Methode für die zuverlässige und reproduzierbare Isolierung von bakteriellen RNA aus den murinen GI-Trakt erholt. Diese Methode nutzt ein gut etabliertes Mausmodell der PA GI Kolonisierung und Neutropenie-induzierte Verbreitung 4. Sobald GI Besiedlung mit PA bestätigt wird, werden die Mäuse getötet und cecal Inhalt zurückgewonnen werden und schockgefroren. RNA wird dann extrahiert mit einer Kombination von mechanischen Störungen, Kochen, Phenol / Chloroform Extraktionen, DNase Behandlung, und Affinitätschromatographie. Menge und Reinheit durch Spektrophotometrie (Nanodrop Technologies) und Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Abb. 1) bestätigt. Diese Methode der GI mikrobielle RNA-Isolierung kann leicht auf andere Bakterien und Pilze sowie angepasst werden.

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RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Eine zuverlässige Methode für die RNA-Isolierung<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Erholte sich von murinen cecums beschrieben. Die RNA zurückgewonnen wird in ausreichender Menge und Qualität für die anschließende qPCR, Transkription Profiling und RNA Seq Experimente. Diese Technik kann für die RNA-Isolierung von anderen Darmbakterien angepasst werden.

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

19.1K Aufrufe.  University of Texas Southwestern Medical Center. Eine zuverlässige Methode für die RNA-Isolierung Pseudomonas aeruginosa Erholte sich von murinen cecums beschrieben. Die RNA zurückgewonnen wird in ausreichender Menge und Qualität für die anschließende qPCR, Transkription Profiling und RNA Seq Experimente. Diese Technik kann für die RNA-Isolierung von anderen Darmbakterien angepasst werden.

Serie: RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa und Saccharomyces cerevisiae Biofilm im Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and bacteria 1. Mucosae are also inductive sites in the host to generate immunity against pathogens, such as the Peyers patches in the intestinal tract and the nasal-associated lymphoreticular tissue in the respiratory tract. This unique feature brings mucosal immunity as a crucial player of the host defense system. Many studies have been focused on gastrointestinal and respiratory mucosal sites. However, there has been little investigation of reproductive mucosal sites. The genital tract mucosa is the primary infection site for sexually transmitted diseases (STD), including bacterial and viral infections. STDs are one of the most critical health challenges facing the world today. Centers for Disease Control and Prevention estimates that there are 19 million new infectious every year in the United States. STDs cost the U.S. health care system $17 billion every year 2, and cost individuals even more in immediate and life-long health consequences. In order to confront this challenge, a greater understanding of reproductive mucosal immunity is needed and isolating lymphocytes is an essential component of these studies. Here, we present a method to reproducibly isolate lymphocytes from murine female genital tracts for immunological studies that can be modified for adaption to other species. The method described below is based on one mouse.&#x2003;

An efficient way to isolate lymphocytes from mouse genital tract is described. This method takes advantage of enzyme digestion and Percoll gradient separation to allow efficient isolation. This technique is also adaptable to for use in other species

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

Langzeitchronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airway-Infektion bei Mäusen

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

Replikation von bestellt, Nonredundant Bibliothek von Pseudomonas Aeruginosa Stamm PA14 Transposon Insertion Mutanten

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype called mucoidy. Alginate is linked to chronic lung infections resulting in poor prognosis in patients with cystic fibrosis (CF). Understanding the pathways that regulate the production of alginate can aid in the development of novel therapeutic strategies targeting the alginate formation. Another disease-related phenotype is the small colony variant (SCV). SCV is due to the slow growth of bacteria and often associated with increased resistance to antimicrobials. In this paper, we first show a method of culturing a genetically defined form of P. aeruginosa SCV due to pyrimidine biosynthesis mutations. Supplementation of nitrogenous bases, uracil or cytosine, returns the normal growth to these mutants, demonstrating the presence of a salvage pathway that scavenges free bases from the environment. Next, we discuss two methods for the measurement of bacterial alginate. The first method relies on the hydrolysis of the polysaccharide to its uronic acid monomer followed by derivatization with a chromogenic reagent, carbazole, while the second method uses an ELISA based on a commercially available, alginate-specific mAb. Both methods require a standard curve for quantitation. We also show that the immunological method is specific for alginate quantification and may be used for the measurement of alginate in the clinical specimens.

Culture of Small Colony Variant of Pseudomonas aeruginosa and Quantitation of its Alginate

Here, we describe a growth condition to culture the small colony variant of Pseudomonas aeruginosa. We also describe two separate methods for the detection and quantitation of the exopolysaccharide alginate produced by P. aeruginosa using a traditional uronic acid carbazole assay and an alginate-specific monoclonal antibody (mAb) based ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic Gram-negative bacterial pathogen, can overproduce an exopolysaccharide alginate resulting in a unique phenotype ...