실명을 방지하기 위해 연구에서 경력 개발 상을 지원, NIH 보조금 EY19312 및 EY19543 (VJK)뿐만 아니라 실명과 EY02687을 (워싱턴 대학에서 안과 및 Visual 과학 계열) 방지하기위한 연구에서 제한없이 부여함으로써.

1. 전극을 만들기 <ol><li> 유리 전극을 준비합니다. 120 MG 한천 배지의 무게를 10 ML 증류수 (최종 한천 농도 1.2 %)에 섞는다. 온수 욕조에서 한천 솔루션을 용융. 플라스틱 주사기를 사용하여 한천 솔루션 : 유리 모세관 (길이 = 100mm, OD / ID = 1/0.75 mm, 내부 부피 = 44 μL 우리는 다음과 같은 차원으로 TW100-4 모세관 워드 Presision 악기 사용) 입력합니다. 10 분 상온에서 한천을 고체화. 따라서, 최대 ~ 200 모세 혈관이 (한천 혼합물의 나머지가 -4 ° C와 재 사용 여러 차례에 저장할 수) 충만 수 있습니다. </li><li> 다이아몬드 나이프를 사용하여 반쪽으로 모세 혈관을 잘라요. </li><li> 4 ° C.에 최소 24 시간 동안 마우스 전극 용액의 결과로 유리 전극을 적시게 4 ° C에서 전극을 저장하고 3~4개월의 기간 동안 그들을 사용합니다. </li></ol> 2. 실험 설정하기 <ol><li> 하룻밤 사이에 마우스를 어두운 적응. (예를 들어, C, 야생 유형을 사용막대 중심 transretinal 녹음과 T α에 대한 57Bl / 6) 마우스 - / - 생쥐 부족한 봉은 원추 transretinal 녹음을 위해 8 신호. </li><li> 1 패 재관류 솔루션, 100 ML 전극 용액, 20 ML 보육 솔루션 (아래 참조) 준비 및 재관류 솔루션 여물에게 Millipore 0.45 μm의 또는 필터 0.22 μm의 (선택 사항) 필터링합니다. </li><li> 망막의 비행기에 배치 광도계를 사용하여 광원 (505-nm의 LED 또는 할로겐 전구 광 자극기)를 보정. LED 광원의 경우 빛의 균일를 달성하기 위해 광학 디퓨저를 사용합니다. </li><li> 실험 (챔버 건축이 다를 수 있습니다)에 대한 재관류 챔버를 준비합니다. 우리 회의소는 작은 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑으로 만든 바닥으로, 3 밀리미터 플렉시 글라스로 만들어진, 그리고 ~의 적극적인 재관류 볼륨 400 μL를 (L = 25mm, W = 8mm, H ≈ 2mm) 가지고있다. BaCl 2 MM L-글루 탐 산염 및 10 밀리미터를 포함하는 전극 솔루션 챔버 하부 전극 공간을 채우기. 플라스틱 튜브와 유리 모세관 사용하여 낮은 전극 공간 (챔버 하단에 부착된 플라스틱 튜브 커넥터로 만들어진) 및 전극 홀더의 솔루션 사이의 연결을 확인하십시오. 전극에는 거품, 연결 튜빙, 또는 전극 소유자 (필요한 경우 플라스틱 주사기를 사용하여 솔루션을 정화) 없습니다 있는지 확인합니다. </li><li> 현미경의 스테이지 (현미경은 방진 테이블에 장착, 기계적 및 전자 기적 노이즈를 최소화하기 위해 패러데이 케이지 내에서 차폐 수있는 선택 사항)에 녹음 챔버를 탑재합니다. 차동 증폭기 (예 : 워너 인스 트루먼 트의 DP-311 증폭기)의 긍정적인 headstage의 기둥으로 낮은 전극 홀더를 연결합니다. 센터와 자극 빛의 명소로 개방 챔버 하부 전극에 맞춥니다. 녹음 챔버로 관류 선을 연결하고 재관류를 켜십시오. </li><li> 95% O 5분의 2 %의 CO 2와 버블 관류 용액 40에 잠복기 동안 ° C 와트응급실 목욕. CO 2는 7.2 솔루션의 산도를 조절합니다. 해결책은 36-37로 재열 세라믹 저항을 통과 중력 ° C.에 의해 병에서 녹화 실로 플로우 열 손실을 줄이기 위해 히터가 이상적으로 현미경의 무대에, 가능한 한 기록 챔버 가까이 위치해야합니다. </li><li> 유량 조절기를 통해 약 1 ML / 분으로 유량을 조정합니다. </li><li> 두 번째 전극 홀더를 사용 headstage의 두 번째 (부정적인) 극에 상부 전극을 연결합니다. O-링을 사용하여 상부 전극에 열전쌍 프로브를 바인딩합니다. 전극과 열전대 도움말 가까운 곳에 온도 읽기가 가능한 망막의 중심 가까이로 가져옵니다 있도록 있는지 확인합니다. 관류 용액의 상부 전극의 끝부분을 담가와 챔버의 중앙에 배치. 베이스 라인 안정화를위한 10-15 분 소요됩니다. </li><li> 용액의 온도가 36되도록 히터의 직류 전압을 조정하십시오 -37 ° C. </li></ol> 3. 마우스 망막 분리 <ol><li> 희미한 붉은 불빛 아래에서 CO 2와 경추 전위와 어두운 맞게 마우스를 안락사. 옵션 : 소작 펜 또는 온수 해부 핀과 공막엔 가장 지느러미 포인트를 cauterizing하여 각 마우스 안구에 참조 표시를합니다. 이후의 모든 절차는 해부 현미경에 적합한 적외선 이미지 변환기를 사용하여 적외선 하에서 수행됩니다. </li><li> 부드럽게 압력을 적용하고 각 안구의 측면에서 피부를 스트레칭으로 굽은 가위로 눈을 해부. microscissors 또는 면도날을 사용하여 적외선 조명 아래 두 눈알을 Hemisect. </li><li> 각막과 렌즈를 제거합니다. 가능한 한 유리의만큼을 제거합니다. </li><li> 안료 상피 층에서 처음으로 망막 벗겨하고, 필요한 경우, 안료 상피의 남아있는 과립을 제거 포셉 그것을 철저하게 닦아주십시오. 우리는 일반적으로 막대와 원뿔 transret 모두에 대한 전체 망막을 사용하는inal 녹음. 그러나 구체적으로 망막이 참조로 소작 마크를 사용하는 면도날이나 microscissors로 세안 컵의 복부 부분을 제거하는 필링 전에, 더 많은 M / L-콘 9를 가지고 마우스 망막의 지느러미 부분에서 녹음하고자하는 경우. </li><li> 인큐베이션 솔루션 작은 배양 접시에있는 두 번째 hemisected 안구를 삽입하고 사용까지 순수 산소로 포화 빛을 꽉 상자의 준비를 품어. 일반적으로 이러한 조건에서 두 번째 마우스 세안 컵은 상온에서 몇 시간 동안 저장할 수 있으며, 녹음에 사용. </li><li> 유리 또는 플라스틱 피펫을 사용하여 페트리 접시의 뚜껑에 재관류 솔루션의 한 방울 (ca. 300 μl)로 분리된 망막을 전송. BaCl 2 미리 품어 망막에 BaCl 2를 포함하는 전극 솔루션의 5-6 작은 방울을 추가합니다. 뒷면의 사각형 조각 (ca. 5x5 ㎜) 모퉁이의 기름칠 (우리는 다우 코닝 111 밸브 윤활제 및 밀봉 재를 사용)를 놓고 Millipore 필터 용지 (0.45 μm의 같은 솔루션 드롭으로 중심에서 미리 만든 구멍 (직경 2-2.5 ㎜)과 함께) 유형을 HARG. 필터 종이 (최대 photoreceptor 사이드)의 상단에 포셉 위치에게 망막을 사용하고 평면 마운트 거기에 주변에 그것의 가장자리를 누르십시오. 망막은 여과지의 개통을 통해 중앙에 있어야합니다. </li><li> 집게를 사용하면 재관류 챔버로 망막과 여과지를 전송하고 자극 스파트 정렬 낮은 전극 공간을 위에 가져 오십시오. 약간 챔버와 결합 그것에 필터 용지의 가장자리에 기름칠을 누르십시오. </li><li> 망막 센터 (약간 photoreceptor 레이어를 만지지) 위에 상부 전극을 배치합니다. 망막에 상부 전극을 중심으로하는 신호 진폭을 (망막의 가장자리가 가까이 배치에 비해 최대 ~ 20-40%) 증가한다. 이러한 전극의 위치가 약간 망막 (는 전체 면적의 ~ 12-15%)의 작은 섹터에 도달 효과적인 조명 자극 강도를 왜곡했지만, 여전히 elec을 배치의 최적의 방법입니다trode. 준비는 이제 transretinal 레코딩을 준비합니다. </li></ol> 4. Transretinal 레코딩 <ol><li> 마우스 라인, LED 광원이나 광​​ 자극기에서 제공하는 보정 505 나노미터의 빛을 밝게 강도로 희미한에서 레코드로드 또는 M / L-콘 기반의 테스트 플래시 반응에 따라. 우리 LED 광원의 경우, 플래시 강도는 LED 입력 전압, 전환 가능한 저항 및 중성 밀도 필터 세트 (우리는 전자 컬러 노랑 라스코 연구소에서 # 211 0.9 ND 필름 필터를 사용 중 컴퓨터 제어의 조합에 의해 제어됩니다 ) LED와 망막 사이에 위치. LED 테스트 플래시 (20 MS)의 기간은 컴퓨터에 의해 제어됩니다. 할로겐 전구 광 자극기를 사용하는 경우 테스트 플래시 강도와 파장은 각각 중성 밀도 필터와 좁은 밴드 간섭 필터의 집합에 의해 제어 할 수 있습니다. 테스트 플래시 지속 시간은 컴퓨터 기반의 셔터에 의해 제어할 수 있습니다. </li><li> 옵션 : 효율적인 유지 관리를위한하루 종일 BaCl 2 photoresponse의 glial 컴포넌트의 억제는 신선한 솔루션으로 채워진 플라스틱 주사기를 사용하여 그것을 정화하여 (각 망막을 테스트하기 전에 예) 가끔 낮은 전극 솔루션을 변경합니다. </li></ol> 5. 대표 결과 솔루션 <ol><li> 마우스 망막 재관류 솔루션 : 112.5 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 밀리미터 MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 10 MM HEPES (산도 7.2), 20 MM NaHCO 3, MM 호박산 NA, 0.5 MM 나 글루 탐 산염, 0.02 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 10 MM 포도당합니다. 또한,이 솔루션은 2 밀리미터 L-글루 탐 산염 및 photoresponse 10,11 높은 순서 구성 요소를 차단하는 10 μm의 DL-AP-4와 보충하고, 0.1 % MEM 비타민과 MEM 아미노산 솔루션 (시그마)와 망막을 향상시키기 위해 생존. </li><li> 마우스 전극 용액 : 140 MM NaCl, 3.6 MM KCl, 2.4 밀리미터 MgCl 2, 1.2 MM CaCl 2, 3 MM HEPES (산도 7.4, NaOH). 낮은 ele의 솔루션ctrode 공간도 추가로 시냅스 전달 10을 차단하는 두 MM L-글루 탐 산염을 포함, 10 MM BaCl 2 photoresponse 3,12의 glial 구성 요소를 억제합니다. </li><li> 망막 보육 솔루션 : 272 MG L-15 배지 (시그마) 20 ML 탈이온수 20 밀리그램 BSA를 해산. 결승전 L-15와 BSA의 농도는 각각 13.6 밀리그램 / ML 및 1 밀리그램 / ML입니다. 1 M HCL과 7.4로 산도를 조정합니다. </li></ol><img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> 그림 1. transretinal 에르그 녹음을위한 마우스 망막의 절연을 보여주는 도식 다이어그램. <img alt="그림 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> 그림 2. 재관류 챔버와 그 소유자와 기록 전극의 사진. 빨간 화살표 관류 흐름의 방향을 나타냅니다. <img alt="그림 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; 그림 3. transretinal 에르그 녹음을위한 실험 설정의 개략도. 빨간 화살표 관류 흐름의 방향을 나타냅니다. <img alt="4 그림." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> . 그림 4 대표자 결과 : 마우스 막대 중심 transretinal 응답 가족을 기록했다. Photoresponses는 로우 패스는 1 kHz에서에서 디지털, 30 Hz에서 (8 극 베셀)에서 필터링 및 추가 분석을 위해 컴퓨터에 저장되어 있었다. 표시된 트레이스는 포화 광 농도에서 희미한 조명 농도 후 2-3 반응에서 5-6 반응의 평균을 나타냅니다. <img alt="그림 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> 그림 5 대표자 결과 :. 마우스 콘 중심 transretinal 응답 기록된 가족. Photoresponses는 로우 패스는 1 kHz에서에서 디지털, 30 Hz에서 (8 극 베셀)에서 필터링 및 추가 분석을 위해 컴퓨터에 저장되어 있었다. 표시된 흔적 averag있다포화 광 농도에서의 희미한 조명 농도와 3-5 반응의 5-10 응답 네;.

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	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. 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막대와 원뿔 중심 transretinal 에르그 녹음의 방법은 야생 유형 및 유전자 변형 동물 모두에서 마우스 photoreceptors의 기능을 조사하는 강력한 도구되고 위에서 설명한. 기본 photoresponse 속성의 쉬운 특성뿐만 아니라,이 간단한 기술은 가까운 - 투 - 그대로 망막의 준비에서 수행 오랫동안 실험을하는 동안 좋은 반응 안정성을 제공합니다. 야생 형 마우스의 어두운 적응로드 최대한의 응답 진폭과 photosen...

<table border="1"><tbody><tr><td> 자재 명칭 </td><td> 유형 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 논평 </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> bioscience TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> 기타 모든 시약 </td><td></td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 유리 모세관 </td><td></td><td> 세계 정밀 계측기 </td><td> TW100-4 </td><td> 전극을 만들기위한 </td></tr><tr><td> 필터 종이 </td><td> HARG </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> 광도계 </td><td></td><td> UDT 인 스트 루먼트 </td><td> S350 </td><td> 가벼운 교정을 위해 </td></tr><tr><td> Radiometric 실리콘 센서 </td><td></td&gt; <td> UDT 인 스트 루먼트 </td><td> 221 </td><td> 가벼운 교정을 위해 </td></tr><tr><td> 방진 테이블 </td><td></td><td> 기술 제조 주식 회사 </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> 기계적 소음을 최소화하려면 </td></tr><tr><td> 공기 압축기 팬더 P 15TC </td><td></td><td> Werther 국제 </td><td> P 15TC </td><td> 방진 테이블에 연결 </td></tr><tr><td> Stereomicroscope </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> 마우스 눈 절개에 대한 </td></tr><tr><td> 적외선 이미지 컨버터 </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> stereomicroscope에 바인딩 </td></tr><tr><td> 차동 증폭기 DP-311 </td><td></td><td> 워너 인 스트 루먼트 </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> 축삭 Digidata 1440A 디지타이저 </td><td>; </td><td> 분자 장치 </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> 듀얼 채널 8 극 필터 </td><td></td><td> KROHN-HITE 주식 회사 </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> 세라믹 저항 </td><td></td><td> TE 연결 </td><td> CGS SBCHE618RJ </td><td> 재관류 솔루션을 재가열에 대한 </td></tr><tr><td> 열전대 </td><td> 티 </td><td> Physitemp 인 스트 루먼트 </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> 온도 모니터 </td><td></td><td> 오메가 </td><td> DPi32 </td><td> 열전대에 연결됨 </td></tr><tr><td> LED가 505 nm의 </td><td></td><td> TT 전자 / Optek 기술 </td><td> Digi-키 P / N 365-1185-ND </td><td> 테스트 섬광 / 표백 라이트를 적용하려면 </td></tr><tr><td> 소작 펜 </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> 지느러미 부분을 마킹에 대한마우스 안구의 </td></tr><tr><td> 10 전기 생리학 데이터 수집 및 분석 소프트웨어를 pCLAMP </td><td></td><td> 분자 장치 </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

막대와 원뿔 : 척추 망막에있는 이미지 성형 photoreceptors의 두 개의 클래스가 있습니다. 콘 빠르게 밝은 빛 조건을 변경 하에서 지속적으로 작동 반면 막대는 빛의 단일 광자를 감지할 수 있습니다. photoreceptors의 외부 세그먼트의 막대 및 원뿔 특정 시각 색소에 의한 빛의 흡수는 결국 플라즈마 막과 세포 hyperpolarization에 주기적 염기 - 게이트 채널의 폐쇄에 이르게 phototransduction 층계를 트리거합니다. 현재 및 잠재적인 멤브레인이 빛을 유도된 변화는 역시 클래식 흡입 전극 녹음 기술의 1,2이나 pharmacologically 차단 postsynaptic 응답 구성 요소 3-5과 격리된 망막에서 transretinal electroretinogram 레코딩 (에르그)에 의해, photoresponse로 등록하실 수 있습니다. 후자의 방법은 마우스 photoreceptors에서 약물 액세스할 지속적인 녹음이 가능하고 안정적​​인 photoresponses에게 금을 얻기 위해 특히 유용톰 부족하고 연약한 마우스 콘. 원뿔의 경우, 그러한 실험은 어두운 적응 6,7 동안 원뿔 photosensitivity 복구 과정을 모니터링하는 모두 본질적으로 모든 시각 색소 표백제로 닦았을 어두운 적응 조건과 다음과 같은 강렬한 조명으로 수행할 수 있습니다. 이 동영상에서 우리는 어두운 적응 마우스 망막에서 막대와 M / L, 원추 중심 transretinal 녹음을 수행하는 방법을 보여줍니다. 로드 녹음은 야생 유형 (C57Bl / 6) 생쥐의 망막을 사용하여 수행됩니다. 8 신호 막대 부족 생쥐. 단순 들어, 원뿔 음반은 유전자 변형로드 transducin에서 α-subunit 녹아웃 (- - / Tα) 얻을 것이다

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Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.6K 조회수.  Washington University School of Medicine. 우리는 그대로 마우스 망막에서 막대와 원뿔 photoresponses를위한 transretinal electroretinogram (에르그) 레코딩 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 가벼운 반응을 분리하고 분리된 평면 마운트 망막에 걸쳐 배치 필드 전극을 사용하여 그들을 기록하는 photoreceptors에서 시냅스 전송 블록의 활용합니다.

비디오: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

어두운 적응 슬라이스 준비에 마우스 망막 뉴런에서 패치 클램프 레코딩

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

마우스 망막을 사용하여 중추 신경계의 혈관 재생의 평가

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

에 vibratome 단면 마우스 망막 광 수용체의 문화를 준비하는 방법

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

자유롭게 이동 Piglets에서 비 침 투 적인 뇌 파 기록

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

닭 배아망막에서 콘 세포 상호 작용에 로드를 연구하는 원뿔 농축 배양

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

생체 내 재현성 촉진을 위한 마우스 망막의 혈관 손상 판독

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Studying Bipolar and Horizontal Neuronal cells in the murine split retina(쥐 분할 망막의 양극성 및 수평 신경 세포 연구)

Split Retina as an Improved Flatmount Preparation for Studying Inner Nuclear Layer Neurons in Vertebrate Retina

Bipolar cells and horizontal cells of the vertebrate retina are the first neurons to process visual information after photons are detected by photoreceptors. They perform fundamental operations such as light adaptation, contrast sensitivity, and spatial and color opponency. A complete understanding of the precise circuitry and biochemical mechanisms that govern their behavior will advance visual neuroscience research and ophthalmological medicine. However, current preparations for examining bipolar and horizontal cells (retinal whole mounts and vertical slices) are limited in their capacity to capture the anatomy and physiology of these cells. In this work, we present a method for removing photoreceptor cell bodies from live, flatmount mouse retinas, providing enhanced access to bipolar and horizontal cells for efficient patch clamping and rapid immunolabeling. Split retinas are prepared by sandwiching an isolated mouse retina between two pieces of nitrocellulose, then gently peeling them apart. The separation splits the retina just above the outer plexiform layer to yield two pieces of nitrocellulose, one containing the photoreceptor cell bodies and another containing the remaining inner retina. Unlike vertical retina slices, the split retina preparation does not sever the dendritic processes of inner retinal neurons, allowing for recordings from bipolar and horizontal cells that integrate the contributions of gap junction-coupled networks and wide-field amacrine cells. This work demonstrates the versatility of this preparation for the study of horizontal and bipolar cells in electrophysiology, immunohistochemistry, and in situ hybridization experiments.

저자 스포트라이트: 접근성 향상 및 실험 가속화를 위한 Split Retina 기법 사용 

This work presents an alternative flatmount retina preparation in which the removal of photoreceptor cell bodies enables faster antibody diffusion and improved patch pipette access to inner retinal neurons for immunohistochemistry, in situ hybridization, and electrophysiology experiments.

Methods Article

마우스 망막에서 Transretinal 에르그 레코딩 :로드 및 원뿔 Photoresponses