Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.

ملاحظة: تمت الموافقة على الإجراء من قبل لجنة الأخلاق داروين من جامعة بيير وماري كوري (CE5 / 2009/048) 1. إعداد الجيلاتين الحل، الآلات، Vibratome والثقافة وسائل الإعلام والثقافة لوحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الجيلاتين 20٪ قبل يوم واحد على الأقل التجربة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 500 ميكرولتر من الجنتاميسين [10 ملغ / مل] إلى زجاجة 500 مل تحتوي على CO 2 متوسطة المستقلة (CO 2 -i). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كوب منفصل، إضافة 20 مل من CO2-I (من الخطوة 1.1.1) والحرارة على 95 درجة مئوية على كتلة التدفئة مع التحريك المستمر لمدة 15 دقيقة. ملاحظة تغيير اللون إلى الأصفر، مشيرا إلى أن الحل هو على استعداد لاستخدامها مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 4 غرام من الجيلاتين والفقراء تدريجيا إلى حل أعدت فوق (الخطوة 1.1.2) مع زيادة التحريك والتدفئة على 95 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة، للحصول على حل اللون الأصفر. السماح للحل الجيلاتين لتبريد تحتغطاء محرك السيارة لحوالي 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 4 مل من محلول الجيلاتين إلى 35 ملم الأطباق ثقافة قطر دون إدخال فقاعات الهواء. الحفاظ على طبق على 21 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تغطية الأطباق مع فيلم من البلاستيك، وتحويل أطباق رأسا على عقب. اختياريا، تخزين الأطباق في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر قبل الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الجيلاتين 4٪. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت غطاء محرك السيارة، إضافة 25 مل من CO 2 متوسطة -i في حاوية بلاستيكية معقمة، والحرارة في 42 درجة مئوية على كتلة التدفئة. إزالة المتوسطة من كتلة التدفئة وإضافة تدريجيا 1 غرام من الجيلاتين إلى متوسطة الساخن ويقلب. العودة بسرعة الحاوية على كتلة التدفئة (42 ° C) وإبقائه دافئا أثناء العملية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضبط لجهاز vibratome: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأطباق التي تحتوي على محلول الجيلاتين 20٪ تخزينها في 4 ° C. قطع الجيلاتين مع مشرط. الوجه شريحة الجيلاتين والتمسك بها على القرص دعم أسود للvibratome باستخدام قطرة من الصورةالغراء UPER. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كسر شفرة حلاقة إلى نصفين، وتضاف نصف واحد في vibratome عقد وعاء. أدخل القرص دعم السوداء على جهاز vibratome. بدوره على مقبض الباب الأسود إلى الجانب الأيمن. إصلاح الوعاء عقد على رأسه من vibratome. إضافة كمية كافية من CO 2 متوسطة -i في خزان vibratome لتغطية كتلة الجيلاتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التبديل على vibratome وقطع ثلاث 100 ميكرون شرائح من كتلة الجيلاتين. الحفاظ على كتلة الجيلاتين لاستخدامها مرة أخرى. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 40 مل من مستنبت: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ من مصل العجل الجنين (FCS) تحت غطاء محرك السيارة. إعداد 1 ملغ / مل بولي-D-ليسين باستخدام الفوسفات عازلة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في لوحة 96-جيدا، إضافة 2 ميكروغرام / سم 2 من بولي-D-ليسين لمعطف أسفل الآبار. احتضان لوحة لمدة 45 دقيقة عند 37 ° C في حدود 5٪ CO 2 الحاضنة. وبعد الحضانة، وإزالة PBS واستبدالها مع 200 ميكرولتر/ جيد DMEM والمكان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة قبل استخدام. </li></ol></li></ol> 2. تشريح الشبكية بكل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استأصل الماوس: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الماوس وفقا لتوجيه الأوروبي 2010/63: خلع عنق الرحم. قطع الرأس مع مقص منحني وضعه في 100 مم طبق بتري بعد تطهيرها العين مع مطهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة العين بعد أن فصل العصب البصري من قبل باجتزاء ذلك بعناية فائقة باستخدام قبضة منحنية. ثم ضع كلتا العينين في طبق بيتري 35 ملم تحتوي على معقم CO 2 متوسطة -i في 21 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة شبكية العين: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ثقب على مستوى العين-أطرافهم بمساعدة إبرة 18 G لتكون قادرة على تقديم مقص في العالم العين. إدخال مقص مستقيمة داخل الحفرة وقطع بعناية الصلبة تحت القزحية على كل محيط الكرة الأرضية العين لإزالة الجسم الهدبي. </li><li&gt; إزالة القرنية والعدسة والحفاظ على غرفة الخلفي من العين مع متجاورة الشبكية لالصلبة. مع اثنين من السيطرة غرامة، وإزالة الجسم الزجاجي الموجود داخل الغرفة الخلفية دون الإضرار شبكية العين. أداء أربعة تخفيضات شعاعي (الشبكية / الصلبة) للسماح تسطيح للشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحسن العالم العين وقشر بأنها &quot;البرتقالي&quot;. فصل الشبكية من الصلبة والظهارة الصباغية الشبكية (RPE). فصل شبكية العين لا تزال تعلق على مستوى العصب البصري بعناية فائقة مع غرامة مقص المنحنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الجسم الزجاجي المتبقية من المحيط باتجاه مركز شبكية العين مع اثنين من السيطرة غرامة. تأكد من أن جميع الزجاجي تتم إزالة تماما للسماح للتسطيح للشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أقصى من ماصة بلاستيكية ونقل الشبكية إلى 35 مم طبق بتري تحتوي CO 2 متوسطة -i مع ماصة بلاستيكية. </li></ol></li></ol> 3. ختم مسطح mounteد الشبكية على الجيلاتين بلوك <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 20 - 30 مل من CO 2 متوسطة -i من خزان vibratome (كتلة الجيلاتين هو حر) للسماح ختم شبكية العين مسطحة محمولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شبكية العين على شريحة زجاجية باستخدام ماصة بلاستيكية وإضافة قطرة من CO 2 متوسطة -i قبل ان ينتقل الى شريحة الجيلاتين مع مبصرة لأسفل على شريحة الجيلاتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق شبكية العين إلى كتلة الجيلاتين عن طريق حقن بلطف درجة حرارة 4٪ الجيلاتين على جانب واحد من كتلة بين شبكية العين وكتلة الجيلاتين في وقت واحد طرد الجيلاتين الحارة على الجانب الآخر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح 4٪ الجيلاتين مع ماصة باستور. الانتظار لمدة 10 دقيقة للسماح الكلي الختم. إضافة CO 2 متوسطة -i أن تزج كتلة والنصل تماما. </li></ol> 4. باجتزاء الشبكية ملاحظة: هذه الخطوة الهامة للحصول على طبقة من خلايا مستقبلة للضوء من دون خلايا الشبكية الأخرى (الشكل 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدءا من القمة على كتلة الجيلاتين، وقطع 100 ميكرون أقسام التسلسلية للوصول إلى شبكية العين. ثم قص 100-120 ميكرون أقسام الطبقة الداخلية. اعتمادا على التطبيق، هذه الطبقة قد يتم تجاهل أو تخزينها في النيتروجين السائل. ضمان سرعة vibratome بطيئة جدا (في 1 أو 2) خلال باجتزاء من طبقة أو طبقات خلايا مستقبلة للضوء الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء المتوسطة 15 ميكرون أقسام الشبكية المقابلة إلى واجهة بين الداخلية وشبكية العين الخارجي. مراقبة هذا القسم تحت المجهر. غياب الأوعية الدموية يشير إلى أن تم الوصول إلى شبكية العين الخارجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 200 ميكرون من شبكية العين الخارجية (طبقة مبصرة) مع الجيلاتين وتحويلها إلى طبق قطره 35 ملم مليئة 3 مل من CO 2 متوسطة -i. يبقيه على الجليد حتى يتم الحصول على جميع أقسام طبقة مستقبلة للضوء من شبكية العين جميع. </li></ol> 5. خلايا النأي مبصرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خذ طبق (عناوين) تحتوي على طبقة مبصرة (ق) ووضعها (منهم) في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط فصل بلطف طبقة مبصرة من الجيلاتين وتحويلها في طبق جديد مليئة 3 مل من محلول رينغر. كرر هذه الخطوة (5.2) لكل إعداد طبقة مبصرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 2 وحدة من غراء مع 25 ميكرولتر من محلول المنشط (1.1 ملي EDTA، 5.5 ملي L-سياستين، و 60 ميكرومتر β المركابتويثانول) في 5 مل البولي بروبلين أنبوب معقم واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C في حدود 5٪ CO 2 الحاضنة . ويتحقق تفعيل غراء عند 37 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة، وقطع طبقة مستقبلة للضوء في 2 مم 2 قطعة (لا صغيرة جدا) ونقل هذه القطع إلى 5 مل أنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف شبكية العين مرتين مع 1.5 مل من محلول الحل رينغر تليها خطورة الترسيب. إزالة كل ما تبقى من الحل رينغر من الأنبوب مع العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 475 ميكرولتر من حل قارع الأجراس في أنبوب يحتوي غراء المنشط والمزيج. إضافة هذا الحل إلى الأنبوب الذي يحتوي على شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنبوب مع شبكية العين لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C في حدود 5٪ CO 2 الحاضنة. وقف رد فعل عن طريق إضافة 1 مل من 10٪ FCS في DMEM. إضافة 25 U من ديوكسي ريبونيوكلياز I (الدناز I) إلى الحمض النووي يهضم من خلايا الموت. التجانس بعناية تعليق الخلية باستخدام 1 مل-ماصة. تدور في 50 x ج لمدة 6 دقائق في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف لإزالة آثار الدم وإضافة DMEM المتوسطة مع المكملات الغذائية (انظر الجدول من reagents_equipment تحديدا) إلى الخلية بيليه و resuspend بعناية تعليق الخلية مع ماصة 1 مل. تدور في 50 x ج لمدة 6 دقائق في RT. كرر هذه الخطوة (5.7) مرة أخرى. </li></ol> 6 خلايا التثقيف مبصرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة مبصرة على فأرة الحاسوب في PN8 تحتوي على حوالي 1-1500000 الخلايا باستخدام هذه التقنية. البذور خلايا مستقبلة للضوء في 15 × 10 خلية / سم 2 في لوحة الثقافة مع الثقافة المتوسطة وثقافة الخلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في حدود 5٪ CO 2 الحاضنة. في يوم 5، والمضي قدما لكيمياء المناعة ودراسة الأساليب التالية النشاف الغربية المقدمة من قبل الموردين الأجسام المضادة. ملاحظة: خطوات لوقف ثقافة ويتم وصف الاختبارات الأولية في اشارة 21. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Organization+of+the+Retina+and+Visual+System.">The Organization of the Retina and Visual System.</a> Webvision. , (2014).</li><li>Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+amacrine+cells+of+the+mouse+retina.">Displaced amacrine cells of the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).</li><li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+transplants+increase+host+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+(rd)+mouse.">Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse.</a> Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).</li><li>. RetNet, the Retinal Information Network Available from: <a target="_blank" href="https://sph.uth.edu/retnet">https://sph.uth.edu/retnet</a> (2014)</li><li>Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+transplantation+of+rods+delays+cone+loss+in+a+retinitis+pigmentosa+model.">Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model.</a> Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).</li><li>MacLaren, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+repair+by+transplantation+of+photoreceptor+precursors.">Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors.</a> Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+photoreceptor+and+total+neural+retina+preserves+cone+function+in+P23H+rhodopsin+transgenic+rat.">Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat.</a> PLoS One. 5 (10), (2010).</li><li>Mohand-Said, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+retina+releases+a+diffusible+factor+stimulating+cone+survival+in+the+retinal+degeneration+mouse.">Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).</li><li>Fintz, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+characterization+of+retina-derived+cone+neuroprotection+in+two+culture+models+of+photoreceptor+degeneration.">Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).</li><li>Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degenerations:+from+cell+signaling+to+cell+therapy;+pre-clinical+and+clinical+issues.">Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues.</a> Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).</li><li>Wright, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+searchlight+through+the+fog.">A searchlight through the fog.</a> Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).</li><li>Leveillard, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Identification and characterization of rod-derived cone viability factor.</a> Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).</li><li>Lillig, C. H., Holmgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thioredoxin+and+related+molecules--from+biology+to+health+and+disease.">Thioredoxin and related molecules--from biology to health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).</li><li>Fridlich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thioredoxin-like+protein+rod-derived+cone+viability+factor+(RdCVFL)+interacts+with+TAU+and+inhibits+its+phosphorylation+in+the+retina.">The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cone+rescue+by+RdCVF+protein+in+a+dominant+model+of+retinitis+pigmentosa.">Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa.</a> Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).</li><li>Bennett, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+delivery+of+rod-derived+cone+viability+factor.">Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor.</a> Retina. 25 (8 Suppl), S47 (2005).</li><li>Komaromy, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+photoreceptor+deconstruction+by+CNTF+enhances+rAAV-mediated+cone+functional+rescue+in+late+stage+CNGB3-achromatopsia.">Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia.</a> Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).</li><li>Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Randomized+trial+of+ciliary+neurotrophic+factor+delivered+by+encapsulated+cell+intraocular+implants+for+retinitis+pigmentosa.">Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa.</a> Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).</li><li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+disruption+of+the+rod-derived+cone+viability+gene+leads+to+photoreceptor+dysfunction+and+susceptibility+to+oxidative+stress.">The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).</li><li>Leveillard, T., Sahel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rod-derived+cone+viability+factor+for+treating+blinding+diseases:+from+clinic+to+redox+signaling.">Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling.</a> Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16 (2010).</li><li>Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+ganglioside+composition+of+photoreceptors+during+postnatal+maturation+of+the+rat+retina.">Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina.</a> Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).</li><li>Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+purified+rat+photoreceptors+in+vitro+is+stimulated+directly+by+fibroblast+growth+factor-2.">Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2.</a> J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+homeobox+gene+CHX10/VSX2+regulates+RdCVF+promoter+activity+in+the+inner+retina.">The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina.</a> Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).</li><li>Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+photoreceptor+circadian+oscillator+strongly+relies+on+lighting+conditions.">Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions.</a> Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).</li><li>Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+gene+expression+analysis+of+the+developing+postnatal+mouse+retina.">Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).</li><li>Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+facilitates+quantitative+analysis+of+wild-type+and+Nrl(-/-)+retinal+transcriptomes.">Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes.</a> Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).</li><li>Delyfer, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+of+human+retinal+surgical+specimens+using+jouRNAI.">Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li><li>Ying, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CAT+reporter+construct+containing+277bp+GNAT2+promoter+and+214bp+IRBP+enhancer+is+specifically+expressed+by+cone+photoreceptor+cells+in+transgenic+mice.">A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice.</a> Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

شبكية العين هي جهاز نموذج في علم الأحياء. دراسة الشبكية أدت إلى 6 اكتشافات كبيرة في علم الأحياء. وهو في الأصل من الورم الأول RB1 القامع الجين. ويكشف الارتباط الجزيئي بين تحركات التيروزين المستقبلة وتحركات MAP من خلال التفاعل مع ابن sevenless. وشارك في اكتشاف PAX6، أول الجين التحكم الرئيسية لالتشكل الجهاز. وهو في مركز الجمعية الوراثية للعامل تكملة H (CFH) مع الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، وأول جين قابلية المرض التي حددها الشاشة الجينوم جمعية اسعة (GWAS). وأخيرا، أدى ذلك إلى أول العلاج الجيني لمرض فقد البصر الخلقية، أول التصحيحية محاكمة العلاج الجيني في الإنسان من أي رثت المرض. والحفاظ على هيكل هذا الجهاز في معظم أنواع الفقاريات. وقد شجع إمكانية الحصول عليها للتلاعب في الجسم الحي في وقت مبكر يوم الجينوم التحقيقات وظيفية على هذا جزءا لا يتجزأ من المائةراؤول الجهاز العصبي. نعرض هنا كيفية فصل طبقة مبصرة من الطبقة الداخلية للشبكية عن طريق vibratome باجتزاء. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على الثقافات مبصرة نقية. بروتوكول تشريح لدينا يجعل التلوث من الخلايا RPE المستبعد جدا. واحدة من التحديات الكبرى هو تسطيح للشبكية ما هو ضروري لقسم صحيح الداخلي وشبكية العين الخارجي. وباجتزاء من شبكية العين هو الأفضل على شبكية العين مع القطر الصغير مثل تلك من القوارض وهذا القطر هو وجود قيود على تقنية مع المواد المتاحة حاليا. فإنه من المستحسن قبل البدء في تجربة ذات مغزى من الناحية البيولوجية، وممارسة على عينة من شبكية العين. نحن لتوضيح الطريقة التي تم الحصول عليها من نتائج ممثلة خلايا مستقبلة للضوء مثقف، وذلك باستخدام مواد لإجراء دراسة التعبير عن كلا من mRNAs والبروتينات. ويمكن أيضا أن يؤديها دراسات التعبير بدلا من ذلك على التقطيعةنانوثانية التي حصلت عليها ملقط ليزر، ولكن يتم تنفيذ الثقافات أفضل باستخدام vibratome باجتزاء. نحن يمكن أن تستخدم تقنية الليزر تسليخ مجهري مع استراتيجية كاملة مختلفة. ولكن، لجمع طبقة مستقبلة للضوء مع جهاز تسليخ مجهري للثقافة، فإنه سيكون من الضروري تجنب تثبيتي، وهذا من شأنه تعقيد المنهجية الحالية بشكل كبير. نحن نعمل على تطوير بروتوكول يهدف إلى دراسة حركية الجينات والبروتينات التعبير في vibratome أقسام أثناء انحطاط خلايا مستقبلة للضوء في نماذج من التهاب الشبكية الصباغي. ونحن نعتقد أن وصف تفصيلي للبروتوكول مفيدا الباحثين في مجال علم الأحياء في شبكية العين، وعلى الأخص للدراسات البروتين وmetabolomic.

شبكية العين هي جزء لا يتجزأ من النظام العصبي المركزي والتي لديها بنية الحفظ بين الفقاريات. ويتم تنظيم الخلايا العصبية للشبكية العصبية في طبقات، مع الأكثر بعدا عن الضوء الساقط، وطبقة مبصرة على اتصال وثيق مع ظهارة الصباغية الشبكية (RPE) في الجزء الخلفي من العين. قضيب ومخروط photorecptors هي خلايا حساسة الخفيفة التي تعتمد على جزيئات الحساسة أوبسين لالتقاط الفوتون. يتم تضمين هذه الجزيئات على الأغشية القرص هيكل الخلوي، وتقع على الجزء الخارجي من مستقبلة للضوء الذي يشير في اتجاه RPE 1. ويتم تجديد هذا الهيكل، والتي غالبا ما تتأثر في حالات الإنحطاط مبصرة في وقت مبكر جدا، بمعدل 10٪ كل يوم. ما يسمى الطبقة الداخلية تحتوي معظم الخلايا العصبية الأخرى التي حساب إشارة وردت من المستقبلات الضوئية، والقطبين، عديم الاستطالات والخلايا الأفقية وكذلك خلايا العقدة. هذه الأخيرة مع محاور لهاتشكيل شعاع وهو العصب البصري. هذه الطبقات هي الحفظ بحيث علماء الأحياء ويستخدم هذا المصطلح النازحين خلايا عديم الاستطالات عندما يتم العثور على الخلايا خارج الطبقة الداخلية ضفيري 2. ويتم توزيع طبقات من الخلايا العصبية داخل المحرك من الخلايا الدبقية شعاعي مولر. خلايا المستقبلات الضوئية بين القطبين تصل إلى خلايا العقدة. فهي تقع بين طبقة ضفيري الخارجية وطبقة ضفيري الداخلية. الخلايا العقدية تشكل طبقة ضفيري الداخلية في اتصال مع خلايا القطبين. تتم تسمية الخلايا كخلايا amacrin جمعية الموجود في الطبقة الداخلية ضفيري بين الخلايا القطبين والخلايا العقدية. طبقة ضفيري الخارجي يحتوي على خلايا الأفقية. هذا الترتيب الفريد من طبقات الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي يسمح عزل طبقة مبصرة من طبقة الخلايا الداخلية تشريح شبكية العين مسطحة شنت باستخدام vibratome من قبل. في الأصل، تم استخدام هذه التقنية لعزل خلايا مستقبلة للضوء لترانsplantation في عين الماوس RD1، وهذا نموذج من التهاب الشبكية الصباغي البشري (RP) 3. الماوس RD1 يحمل طفرة المتنحية في الجينات Pde6b الذي يشفر للقضيب محددة فسفودايستراز بيتا فرعية. الطفرات المتنحية من هذه النتيجة الجينات في RP في البشر (4). بعد أن تحولت مبصرات قضيب، والمريض يفقد الرؤية الليلية، ومبصرات مخروطية من المستغرب، والتي لا تعبر عن الجين المتحور، تتحول كخطوة ثانية. لأن يطلب من المخاريط للرؤية اللون والبصر، والمرضى بالعمى تدريجيا وعلاج فعال لهذا المرض لم تضع حتى الان. عن طريق تطعيم طبقة مستقبلة للضوء من النوع البري الماوس انحطاط مخروط من الفأرة المضيف تأخر 3،5. قضبان خسر في نموذج التنكسية قضيب مخروط لا يمكن الاستعاضة عن زرع لأن الاتصال متشابك بين قضبان وخلايا القطبين لا يمكن الحصول عليها في مرحلة معينة من صتطوير etinal، والتي تمثلت في ظهور المختبر الوطني المرجعي التعبير 6. هو عرض طبقة من خلايا مستقبلة للضوء عن طريق الجراحة في الفضاء شبه الشبكية الشبكية RD1 قضيب أقل، وبين RPE والشبكية الخارجية الموافق 3٪ فقط من المستقبلات الضوئية المتبقية، المخاريط. بعد أسبوعين من الجراحة، و 40٪ من المخاريط من الحيوان المزروعة مع طبقة مبصرة العادية نجا بالمقارنة مع الحيوان المزروعة مع طبقة طبيعية من الخلايا الداخلية الشبكية، أو للحيوان الشام التي تديرها. تضاريس بقاء مخروط،-موزعة على كامل سطح الشبكية تحور تقع في موقف الأنسجة المطعمة يشير إلى أن التأثير الوقائي يرجع إلى جزيء إنتشاري 7. وبعد ذلك، استخدمنا نظام المشاركة في الثقافة وكذلك وسائل الإعلام ثقافة مشروطة للتحقق من صحة حقيقة أن تأثير وقائي يعتمد على إفراز بروتين عن طريق قضبان 8،9. ونحن نفترض أن هذا البروتين سوف EXPRإسيد بشكل مستمر وتحديدا من قبل قضبان وأن وفاتهم خلال المرحلة الأولى من المرض سوف يؤدي التنكس مخروط الثانوي بحلول فقدان إشارة وقائية من قضبان في غير الخلية بطريقة مستقلة 10. ونظرا لأهمية مخروط بوساطة الرؤية المركزية في الرئيسيات هذا البروتين المفترض سيكون أداة علاجية ذات الصلة للغاية لRP. ان الحفاظ على المخاريط في RP منع نظريا ما مجموعه 1.5 مليون مريض في جميع أنحاء العالم ليصبح أعمى 11. وقد استخدمنا منهج فحص محتوى عالية ونموذجا ثقافة التخصيب مخروط لتحديد [كدنا ترميز رود المستمدة من المخروط الجدوى عامل (RdCVF) من مكتبة [كدنا الشبكية 12. RdCVF هو نتاج تقسم من الجينات التي NXNL1، هو المثير للاهتمام مثلي لترميز الجين للبروتينات thioredoxin المشاركة في الأكسدة التوازن (13). المنتج تقسم الثاني من هذا الجين، RdCVFL هو انزيم يحمي هدفها، البروتين جامعة تل ابيب ضد الأكسدة دamage 14. إدارة RdCVF يمنع الضمور الثانوي من المخاريط وفقدان وظيفتها البصرية في المتنحية، والنموذج السائد للRP 12،15. وهذا يدل على اثنين من الجوانب الهامة لهذه الاستراتيجية العلاجية المبتكرة 16. أولا، يمكن تطبيقه في معظم الحالات RP بطريقة الجينات مستقل. ثانيا، يرتبط يتعارض مع عامل المنافسة بقاء CNTF، RdCVF مع الحفاظ على وظيفة البصرية 17. غياب تأثير وظيفي قد يفسر سبب غياب فائدة سريرية من إدارة CNTF للمرضى RP 18. هو على الأرجح واحدة من إشارة بقاء هامة بين قضبان ومخاريط لأن مستعمل الإنقاذ مخروط في المختبر عن طريق RdCVF immunodepletion 12 RdCVF. وبالإضافة إلى ذلك، تعطل جدوى مخروط الجينات المستمدة قضيب يؤدي إلى خلل وظيفي مبصرة والقابلية للالاكسدة 19. استخدامطبقة مستقبلة للضوء هي في أصل تحديد RdCVF وإشارة الأكسدة جديدة تشارك في أمراض الاعصاب 20. توضح هذه المخطوطة البروتوكول المستخدم لعزل والخلايا الثقافة من طبقة مبصرة لتوصيف نشاط RdCVF. يمكن الحفاظ على المستقبلات الضوئية في الثقافة لمدة 5 إلى 7 أيام 21. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة التعبير عن جينات محددة مستقبلة للضوء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:319px;"><a name="RANGE!A1:D28">Name of Material / Equipment</a></td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:131px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:368px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0256</td>
			<td>4.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphocholin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0456</td>
			<td>2.7 &#181;M Cytidine 5&#8242;-diphosphoethanolamine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8384</td>
			<td>100 &#181;g/ml linole&#239;c acid/ bovine serum albumin (BSA)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-L-thyronine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6397</td>
			<td>0.03 &#181;M Triiodo-L-thyronine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-wells plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>655-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binocular microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">CO2 independent (CO2-i)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18045054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps n&#176;5 Dumont</td>
			<td>Bionic</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gelatin from porcin skin type A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GeneChip&#160;</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>U74v2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gentamicin solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15710049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortison*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H0888</td>
			<td>0.55 &#181;M hydrocortison</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Insulin* (I)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.86 &#181;M insulin (I)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Papain</td>
			<td>Worthington-biochem</td>
			<td>WOLS03124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P-6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Progesterone*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7556&#160;</td>
			<td>2.0 &#181;M progesterone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostaglandin*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5172</td>
			<td>0.28 &#181;M prostaglandin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Putrescine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5780</td>
			<td>&#160;182 &#181;M putrescine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scalpel Albion</td>
			<td>EMS</td>
			<td>72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissor&#160;</td>
			<td>Moria</td>
			<td>15396-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636</td>
			<td>1 mM sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Selenite* (S)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.29 &#181;M Na2SeO3&#160;&#160; (S)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taurine*</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8691</td>
			<td>3 mM taurine</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transferrin* (T)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1884 (ITS)</td>
			<td>0.07 &#181;M transferrin (T)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome apparatus</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">* Supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

vibratome sectioning mouse retina to prepare photoreceptor cultures

شبكية العين هي جزء من الجهاز العصبي المركزي الذي نظم الهندسة المعمارية، مع الخلايا العصبية في طبقات من خلايا مستقبلة للضوء، سواء قضبان ومخاريط في اتصال مع ظهارة الصباغية الشبكية في الجزء الأكثر البعيد على الشبكية النظر في اتجاه الضوء، و خلايا العقدة في المسافة أكثر الداني. هذه العمارة تسمح للعزل طبقة مبصرة من قبل vibratome باجتزاء. الشبكية العصبية تشريح على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي مسطحة جزءا لا يتجزأ من 4٪ الجيلاتين على رأس شريحة من 20٪ الجيلاتين طبقة مبصرة أسفل. باستخدام vibratome وشفرة حلاقة ذو حدين، هو مقطوع شبكية العين الداخلية سميكة 100 ميكرون. يحتوي هذا القسم على خلايا العقدة والطبقة الداخلية مع اسيما الخلايا القطبين. يتم تجاهل قسم سيط من 15 ميكرون قبل أن يتم استردادها 200 ميكرون من شبكية العين الخارجية التي تحتوي على المستقبلات الضوئية. تتم إزالة الجيلاتين عن طريق التسخين عند 37 درجة مئوية. قطعة من الطبقة الخارجية هي incubaتيد في 500 ميكرولتر من محلول رينغر مع 2 وحدات من غراء تفعيلها لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C. توقف رد الفعل من خلال إضافة 500 ميكرولتر 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)، يضاف بعد ذلك 25 وحدة من الدناز I قبل الطرد المركزي في RT، وغسلها عدة مرات لإزالة المصل ومعلق الخلايا في 500 ميكرولتر من DMEM والمصنف في 1 × 10 5 خلية / سم 2. وتزرع الخلايا إلى 5 أيام في المختبر، وسجل الجدوى الخاصة بهم باستخدام الحية / الفحص ميت. يتم تحديد نقاء الثقافة لأول مرة عن طريق الملاحظة المجهرية أثناء التجربة. ثم يتم التحقق من صحة الطهارة من البذر وتحديد الخلايا على شريحة نسيجية وتحليلها باستخدام بولكلونل الأرنب مكافحة SAG، علامة مبصرة والفأر وحيدة النسيلة المضادة للRHO، علامة محددة قضيب مبصرة. بدلا من ذلك، طبقة مبصرة (97٪ قضبان) يمكن استخدامها لتحليل الجينات أو البروتين التعبير وللزرع.

وبصرف النظر عن زراعة الأعضاء، كما تم استخدام طبقات مبصرة لدراسة الإشارات الخلية عن طريق بذر خلايا لصنع الثقافات مبصرة 12،22. بالإضافة إلى ذلك، فهي تستخدم لدراسة التعبير الجيني والساعة البيولوجية إيقاع 23،24. وقد استخدمنا طبقة مبصرة خلية من النوع البري الماوس في يوم ما بعد الولادة 8 لإعداد الثقافات مستقبلة للضوء في غياب FCS والحفاظ على خلايا لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO 2 (الشكل 1E ). الخلايا ثم تم ثابتة باستخدام 4٪ paraformadehyde ثم شرع لتحليل immunocytochemical باستخدام أساليب المقدمة من الموردين الأجسام المضادة وحيدة النسيلة إما مع الماوس مكافحة RHO (1: 250، ميليبور Mab5316) أو أرنب بولكلونل مكافحة SAG (1: 200، سخية هدية من إيغال جيري وديفيد هيكس). كنا مكافحة RHO ومكافحة SAG (على الرغم من المخاريط التسمية مكافحة SAG وقضبان) يرجع ذلك إلى حقيقة أن مكافحة SAG هو علامة السابقة، من مكافحة RHO. نسبة سلليرة سورية إيجابية للأجسام المضادة لمكافحة RHO أقل من تلك التي إيجابية للأجسام المضادة للتبلد (الشكل 2). ويمكن تفسير ذلك من خلال حقيقة أن SAG، وأعرب عن قضيب arrestin أيضا الأقماع التي تجعل 3٪ من المستقبلات الضوئية في طبقة معزولة، أو بدلا من ذلك من حقيقة أنه خلال نضوج ما بعد الولادة من شبكية العين، والتعبير عن SAG يسبق أن من RHO 25،26. تم استخدام طبقة مبصرة أيضا لمراقبة التعبير معين من الجينات التي المستقبلات الضوئية في شبكية العين من النوع البري والدماغ من الحيوانات تتراوح أعمارهم بين 35 يوما أعدت RNA باستخدام CSCL تنبيذ فائق 27 و تهجين إلى الماوس DNA رقاقة صفيف. رسل لرودوبسين (رو)، يتم التعبير عن S-arrestin (ساج) ومخروط transducin (Gnat2) وتحديدا في شبكية العين بالمقارنة إلى الدماغ (الشكل 3A). التعبير هو بارز في طبقة مبصرة (PR) مما كانت عليه في شبكية العين بأكملها والذي يشملطبقة الشبكية الداخلية تظهر أن يتم التعبير عن هذه الجينات في الواقع من قبل خلايا مستقبلة للضوء. لGnat2، والتعبير النسبي بالمقارنة مع رو والضعف يظهر أن يتم التعبير عن ذلك من خلال المخاريط الواردة في طبقة مبصرة معزولة. التعبير عن recoverin (Rcvrn) في طبقة مبصرة بالمقارنة مع شبكية العين بأكملها يتم زيادة (الشكل 3B). تم استخدام طبقة مبصرة أيضا لمراقبة التعبير عن RHO وGNAT2 باستخدام النشاف الغربي التالية أساليب المقدمة من قبل الموردين الأجسام المضادة ومقارنة لطبقة الشبكية الداخلية (الشكل 4). لاحظ عدم وجود RHO وGNAT2 28، علامات من قضبان ومخاريط على التوالي في شبكية العين بأكملها وفي شبكية RD1 الماوس في يوم ما بعد الولادة 35. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig1highres.jpg" /> فايجوري 1. عرض تخطيطي للباجتزاء vibratome من الماوس شبكية العين. (A) تركيب شبكية العين مسطحة شنت مع مبصرة لأسفل على شريحة الجيلاتين. (ب) قسم الشبكية الداخلية مع شفرة vibratome. (C) قسم الشبكية الخارجية أضيف من الجيلاتين. (D) مراقبة وجود مستقبلة للضوء على حافة جزء من شبكية العين بعد عزل طبقة مبصرة. ويستخدم على نطاق وشريط تستخدم لمضان أخضر من مجهر الضوء الأبيض. وتقع خلايا مستقبلة للضوء في حافة الصورة. (E) خلايا مستقبلة للضوء مثقف (بعد خمسة أيام). (F) التكبير العالي للوحة E. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" width="550" /> الشكل 2. التفاضلية التعبير عن RHO وSAG في الثقافة الماوس مبصرة. (A) تلون نوى (الأزرق)، (B) SAG تلطيخ (الأخضر)، (C) RHO تلطيخ (الحمراء). (D) مدموجة الصورة. لأنه يتم التعبير عن تلطيخ SAG في وقت سابق من RHO تلطيخ، وصفت خلايا اثنين فقط ضعف SAG وRHO (انظر *). شريط مقياس: 23 ميكرون <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig3highres.jpg" /> الشكل 3. مقارنة بين التعبير عن ثلاثة جينات في الدماغ وشبكية العين بأكملها ومبصرات من الحيوانات البرية من نوع الذين تتراوح أعمارهم بين خمسة وثلاثين يوما. (A) رهودوبسن] (رو)، S-arrestin (ساج) ومخروط transducin (Gnat2). (ب) Calbindin (Calb1) وRecoverin (Rcvrn). يتم عرض البيانات كما التعبير النسبي. التعبير النسبي هو قيمة التعبيرتم الحصول عليها من البيانات ميكروأري بعد normaliszation مع برنامج قوي متعدد مجموعة متوسط ​​(RMA) المتوفرة في قاعدة بيانات المعرفة KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" width="400" /> الشكل 4. التعبير عن RHO وGNAT2 في شبكية العين الخارجية من النوع البري شبكية العين في مرحلة ما بعد الولادة يوم 35. غياب التعبير عنها في الشبكية الداخلية وفي شبكية الفأر RD1 في ما بعد الولادة يوم 35. ACTB، بيتا -actin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51954/51954fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <!-- Repeat of the materials table
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> اسم المادة / معدات </td><td> شركة </td><td> عدد كتالوج </td><td>تعليقات / الوصف </td></tr><tr><td> سيتيدين 5&#39;-diphosphocholin * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> C0256 </td><td> 4.7 ميكرومتر سيتيدين 5&#39;-diphosphocholin </td></tr><tr><td> سيتيدين 5&#39;-diphosphoethanolamine * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> C0456 </td><td> 2.7 ميكرومتر سيتيدين 5&#39;-diphosphoethanolamine </td></tr><tr><td> اللينوليك الزلال حمض / المصل البقري (BSA) * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> L8384 </td><td> 100 ميكروغرام / مل حمض اللينوليك / المصل البقري الزلال (BSA) </td></tr><tr><td> Triiodo-L-ثيرونين * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T6397 </td><td> 0.03 ميكرومتر Triiodo-L-ثيرونين </td></tr><tr><td> 96-الآبار لوحة </td><td> واحد الحيوية غرينر </td><td> 655-095 </td><td></td></tr><tr><td> المجهر مجهر </td><td> لايكا </td><td> MZ-75 </td><td></td></tr><tr><td> CO 2 المستقلة (CO 2- ط) </td><td> الحياة تيchnologies </td><td> 18045054 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> تكنولوجيا الحياة </td><td> 41966029 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط ن ° 5 دومون </td><td> ذو أعضاء آلية </td><td> 11254-20 </td><td></td></tr><tr><td> الجيلاتين من نوع الجلد porcin A </td><td> سيغما الدريتش </td><td> G2500 </td><td></td></tr><tr><td> GeneChip </td><td> Affymetrix </td><td> U74v2 </td><td></td></tr><tr><td> حل جنتاميسين </td><td> تكنولوجيا الحياة </td><td> 15710049 </td><td></td></tr><tr><td> Hydrocortison * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> H0888 </td><td> 0.55 ميكرومتر hydrocortison </td></tr><tr><td> الأنسولين * (I) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.86 ميكرومتر الأنسولين (I) </td></tr><tr><td> غراء </td><td> رثينجتون-دكاك </td><td> WOLS03124 </td><td></td></tr><tr><td> بولي-D-ليسين </td><td> سيغما الدريتش </td><td>P-6407 </td><td></td></tr><tr><td> البروجسترون * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> P7556 </td><td> 2.0 ميكرومتر البروجسترون </td></tr><tr><td> البروستاغلاندين * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> P5172 </td><td> 0.28 ميكرومتر البروستاجلاندين </td></tr><tr><td> بوتريسين * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> P5780 </td><td> 182 ميكرومتر بوتريسين </td></tr><tr><td> مشرط البيون </td><td> EMS </td><td> 72000 </td><td></td></tr><tr><td> قص </td><td> موريا </td><td> 15396-00 </td><td></td></tr><tr><td> الصوديوم البيروفات * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> S8636 </td><td> 1 ملي البيروفات الصوديوم </td></tr><tr><td> زيلونيت الصوديوم * (S) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.29 ميكرومتر نا 2 سيو 3 (S) </td></tr><tr><td> التورين * </td><td> سيغما الدريتش </td><td> T8691 </td><td> 3 ملي التورين </td></tr><tr><td&gt; ترانسفيرين * (T) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> I1884 (ITS) </td><td> 0.07 ميكرومتر ترانسفيرين (T) </td></tr><tr><td> جهاز Vibratome </td><td> لايكا </td><td> VT1000-S </td><td></td></tr><tr><td> * المكملات الغذائية </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 1: المواد المحددة والمعدات لاستخدامها. -&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures at JoVE.com

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجزيئية، التحاليل البيوكيميائية أو الزرع.

Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

vibratome-sectioning-mouse-retina-to-prepare-photoreceptor-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  UMR_S 968, Institut de la Vision.  الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجز...

Video: Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

Vibratome Sectioning for Enhanced Preservation of the Cytoarchitecture of the Mammalian Organ of Corti

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of this cellular mosaic often requires that the organ of Corti is cross-sectioned. In particular, the nonsensory pillar and Deiters' cells, whose nuclei are located basally with respect to the hair cells, cannot be visualized without cross-sectioning the organ of Corti. However, the delicate cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, including the fine cytoplasmic processes of the pillar and Deiters' cells, is difficult to preserve by routine histological procedures such as paraffin and cryo-sectioning, which are compatible with standard immunohistochemical staining techniques.
Here I describe a simple and robust procedure consisting of vibratome sectioning of the cochlea, immunohistochemical staining of these vibratome sections in whole mount, followed by confocal microscopy. This procedure has been used widely for immunhistochemical analysis of multiple organs, including the mouse limb bud, zebrafish gut, liver, pancreas, and heart (see 3-6 for selected examples). In addition, this procedure was sucessful for both imaging and quantitificaton of pillar cell number in mutant and control organs of Corti in both embryos and adult mice 7. This method, however, is currently not widely used to examine the mammalian organ of Corti. The potential for this procedure to both provide enhanced preservation of the fine cytoarchitecture of the adult organ of Corti and allow for quantification of various cell types is described.

A simple procedure of vibratome sectioning the organ of Corti, followed by immunohistochemistry and confocal microscopy is described. This procedure allows for improved preservation of the fine cytoarchitecture of the mammalian organ of Corti, and consequently allows for accurate quantification of cell types.

Vibratome Sectioning للحفاظ على المحسن من التهندس الخلوي للجهاز الثدييات كورتي

The mammalian organ of Corti is a highly ordered cellular mosaic of mechanosensory hair and nonsensory supporting cells (reviewed in 1,2).Visualization of ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

كله جبل تلوين مناعي للشبكية الفأر حديثي الولادة المعنية بالتحقيق في الأوعية الدموية<em&gt; في الجسم الحي</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

تقييم الأوعية الدموية التجديد في الجهاز العصبي المركزي عن طريق الماوس الشبكية

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

التصوير كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; حيوية في محطات المخروط مبصرة أكسون من شبكية العين الفأر

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Cone-Enriched Cultures from the Retina of Chicken Embryos to Study Rod to Cone Cellular Interactions

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form of inherited retinal degeneration, retinitis pigmentosa, lose night vision because of mutation driven loss of rod photoreceptors, a phenomenon followed by a progressive loss of function and death of cones leading to blindness. Geneticists have identified many genes with mutations causing this disease, but the first mutations identified questioned the mechanisms of secondary cone degeneration and how a dominant mutation in the rhodopsin gene encoding for the visual pigment expressed exclusively in rods can trigger cone degeneration.
This result of transplantations in a genetic model of the disease led to the concept of cell interactions between rods and cones and of non-cell autonomous degeneration of cones in all genetic forms of retinitis pigmentosa.
Cones comprise 5% of all photoreceptors in humans and only 3% in the mouse, so their study is difficult in these species, but cones outnumber rods in bird species. We have adapted 96-well plates to culture retinal precursors from the retina of chicken embryos at stage 29 of their development. In these primary cultures, cones represent 80% of the cells after in vitro differentiation. The cells degenerate over a period of one week in the absence of serum. Here, we describe the methods and its standardization.
This cone-enriched culture system was used to identify the epithelium-derived cone viability factor (EdCVF) by high content screening of a rat retinal pigmented epithelium normalized cDNA library. Recombinant EdCVF prevents the degeneration of the cones.

We describe a method to obtain primary cultures of cone photoreceptors from the retina of chicken embryos and its use for high content screening.

مخروط المخصب الثقافات من شبكية العين من أجنة الدجاج لدراسة رود إلى مخروط التفاعلات الخلوية

Human daytime vision relies on the function of cone photoreceptors at the center of the retina, the fovea. Patients suffering from the most prevalent form ...

Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are laterally packed in the outermost layer of the retina, the photoreceptor layer, resulting in alignment of analogous subcellular compartments. Traditionally, tangential sectioning of the frozen flat-mounted retina has been used to study the movement and localization of proteins within different rod compartments. However, the high curvature of the rod-dominant mouse retina makes tangential sectioning challenging. Motivated by the study of protein transport between compartments, we developed two peeling methods that reliably isolate the rod outer segment (ROS) and other subcellular compartments for western blots. Our relatively quick and simple techniques deliver enriched and subcellular-specific fractions to quantitatively measure the distribution and redistribution of important photoreceptor proteins in normal rods. Moreover, these isolation techniques can also be easily adapted to isolate and quantitatively investigate the protein composition of other cellular layers within both healthy and degenerating retinae.

This protocol presents two techniques to isolate the subcellular compartments of murine rod photoreceptors for protein analysis. The first method utilizes live retinae and cellulose filter paper to separate rod outer segments, while the second employs lyophilized retinae and adhesive tape to peel away rod inner and outer segment layers.

طريقتان للتقشير لعزل مقصورات خلايا المستقبلات الضوئية في شبكية العين للفأر لتحليل البروتين

Rod photoreceptors are highly polarized sensory neurons with distinct compartments. Mouse rods are long (~80 &#181;m) and thin (~2 &#181;m) and are ...

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To properly leverage this greater translatability, there is a need to devise reproducible methods of drawing quantitative data from these images. Optical coherence tomography (OCT) imaging can resolve retinal histology at micrometer resolution and reveal functional differences in vascular blood flow. Here, we delineate noninvasive vascular readouts that we use to characterize pathological damage post vascular insult in an optimized mouse model of retinal vein occlusion (RVO). These readouts include live imaging analysis of retinal morphology, disorganization of retinal inner layers (DRIL) measure of capillary ischemia, and fluorescein angiography measures of retinal edema and vascular density. These techniques correspond directly to those used to examine patients with retinal disease in the clinic. Standardizing these methods enables direct and reproducible comparison of animal models with clinical phenotypes of ophthalmic disease, increasing the translational power of vascular injury models.

In Vivo Vascular Injury Readouts in Mouse Retina to Promote Reproducibility

Here, we present three data analysis protocols for fluorescein angiography (FA) and optical coherence tomography (OCT) images in the study of Retinal Vein Occlusion (RVO).

في الجسم الحي قراءات إصابة الأوعية الدموية في شبكية الفأر لتعزيز التكاثر

Advancements in ophthalmic imaging tools offer an unprecedented level of access to researchers working with animal models of neurovascular injury. To ...

Mouse Retina Isolation and Flattening

After fixing the enucleated eyeball of the euthanized mouse, transfer it to a glass slide and place it under a dissecting microscope. Using forceps, clamp the margin of the cornea to prevent eyeball movement. With the dissecting scissors, cut around the cornea at a depth of approximately one millimeter through the cornea scleral limbus, and then remove the lens and vitreous body.Holding the optic disc at the center, cut the retina radially along the four quadrants, reaching approximately 2/3 of the retina's radius. Clamp one of the scleral edges using toothed forceps. Hold the sclera edge with untoothed forceps and move from the toothed forceps toward the sclera base.Carefully peel the retina. Wet the retina with 200 microliters of PBS using a pipette. Remove excess PBS using absorbent paper, and flatten the retina with a small bristle brush if needed.Slowly add cold methanol drop-by-drop onto the retina's inner surface until it covers completely. Once the retina turns white and develops increased tenacity, gently flatten the retina and remove impurities, such as residual pigment membranes and the vitreous body, with a small bristle brush. After inverting the retina, treat it with methanol as previously demonstrated, and transfer it into a well of 24 well plate, Soak it in methanol and store it at 20 degrees Celsius for one to two hours for immediate immunostaining.Then rinse the retina with PBS after removing methanol from the plate. The retinol ganglion cells of the retinas before and after methanol treatment were visualized using confocal microscopy, which indicated that the 12 months of methanol preservation did not affect the RGC immunostaining.

عزل وتسطيح شبكية العين بالماوس

Ex Vivo Confocal Imaging of Mouse Retina

Enucleate the eyes of a euthanized mouse, marking the temporal side for orientation purposes. Remove the anterior chamber. Then remove the lens and vitreous and place eye cups in paraformaldehyde for 30 minutes.Wash eye cups with PBS for 30 minutes. Replacing the solution three times. Then, wash with 0.5%Triton X-100 for 30 minutes.Incubate eye cups in the blocking buffer for two hours at room temperature. After immunostaining, isolate the retinas from the eye cups using a microscope. Divide the retinas into four leaves and flat mount them with the retinal ganglion cell layer facing up.Ensure the mark on the temporal side remains attached for orientation. Cover the retinas with mounting medium. Place cover slips.And seal the slides using nail polish. Turn on the confocal microscope and under Locate mode, find the area of interest using the eye piece. Switch to Acquisition mode and set up tiles to cover the entire retina, along with Z-Stack slices for all layers of information.Image at least 25 tiles across the whole retina to achieve a total volume. Project the Z-Stack slices to generate two-dimensional on-face confocal microscopy images. The composite vis-OCT fibergram is compared with the corresponding confocal image of flat mounted retina immunostained with TuJ1 for RGC axons.Blood vessels exhibit distinguishable branching structures which can be matched with the ICAM-2 labeled blood vessels on the confocal image. Side-by-side comparison between ex vivo confocal microscopy and in vivo vis-OCT revealed identical RGC axon bundle networks and surrounding retinal vasculature.