נתמך על ידי פרס קריירה ופיתוח ממחקר למנוע עיוורון, NIH מענקים EY19312 ו EY19543 (VJK), כמו גם על ידי מענק בלתי מוגבל של מחקר למניעת עיוורון EY02687 (מחלקת עיניים ו-Visual למדעים באוניברסיטת וושינגטון).

1. ביצוע אלקטרודות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות זכוכית. שוקל 120 מ&quot;ג אגר ומערבבים אותו במים מזוקקים 10 מ&quot;ל (ריכוז אגר האחרון 1.2%). ממיסים את הפתרון אגר באמבט מים חמים. מלאו כוס נימים (אנו משתמשים Presision מכשירים וורד TW100-4 נימים עם הממדים הבאים: אורך = 100 מ&quot;מ, OD / ID = 1/0.75 מ&quot;מ, ונפח פנימי = 44 μL) עם פתרון אגר באמצעות מזרק פלסטיק. לחזק אגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לכן, עד ~ 200 נימים יכול להיות מלא (את שאר התערובת אגר ניתן לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס, שימוש חוזר כמה פעמים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים לחצאים נימים באמצעות סכין יהלום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את אלקטרודות זכוכית וכתוצאה מכך לפתרון האלקטרודה העכבר לפחות 24 שעות 4 ° C. אחסן את האלקטרודות על 4 ° C, ולהשתמש בהם על פני תקופה של 3-4 חודשים. </li></ol> 2. הגדרת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כהה להתאים עכבר לילה. השתמש בסוג בטבע (למשל, C57Bl / 6) עכברים עבור מוט מונחה הקלטות transretinal ו T אלפא - / - עכברים מוט חסר איתות 8 להקלטות חרוט transretinal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 זלוף L פתרון, 100 אלקטרודה פתרון מ&quot;ל ו -20 מ&quot;ל הדגירה פתרון (ראה להלן) ולסנן שוקת פתרון זלוף כמה Millipore 0.45 מיקרומטר או 0.22 מיקרומטר פילטר (לא חובה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכייל את מקור האור (505 ננומטר LED או נורת הלוגן ממריץ אופטי) באמצעות פוטומטר ממוקם על המטוס של הרשתית. במקרה של מקור אור LED, השתמש מפזר אופטי כדי להשיג אחידות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין את חדר זלוף לניסוי (קונסטרוקציות קאמרית עשוי להשתנות). הלילה שלנו עשוי פרספקס 3 מ&quot;מ, עם תחתית עשויה מכסה של צלחת פטרי פלסטיק קטנה, ויש לו נפח זלוף פעיל ~ 400 μL (L = 25 מ&quot;מ, W = 8 מ&quot;מ, H ≈ 2 מ&quot;מ). למלא את החלל האלקטרודה התחתון של החדר עם פתרון אלקטרודה המכילה 2 מ&quot;מ L-גלוטמט ו 10 mM BaCl 2. באמצעות צינורות פלסטיק זכוכית נימי, ליצור חיבור בין הפתרון בחלל אלקטרודה נמוכה יותר (עשוי מחבר צינור פלסטיק מחובר אל תחתית תא) ובעל האלקטרודה. ודא שאין בועות האלקטרודה, צינורות חיבור, או בעל אלקטרודה (לטהר את הפתרון באמצעות מזרק פלסטיק במידת הצורך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר תא הקלטת על הבמה של מיקרוסקופ (לא חובה: מיקרוסקופ יכול להיות מותקן על השולחן נגד רעידות ו מוגן בתוך כלוב פאראדיי כדי למזער את הרעש מכני אלקטרומגנטי). חבר את מחזיק האלקטרודה נמוך לקוטב headstage החיובי של מגבר ההפרש (למשל וורנר מכשירים DP-311 מגבר). מרכז וליישר את האלקטרודה בתא התחתון לפתוח עם כתם האור גירוי. חבר את קו זלוף אל חדר ההקלטה ולהפוך זלוף על. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה זלוף פתרון עם 95% מ 2/5% CO 2 תוך דוגרים אותו 40 מעלות צלזיוס וואטאה אמבטיה. CO 2 מתאים את ה-pH של התמיסה ל 7.2. פתרון זורם מהבקבוק אל חדר ההקלטה על ידי כוח הכבידה עובר דרך הנגד קרמיקה מחמם שוב את אותה 36-37 ° C. כדי להפחית את אובדן החום, דוד צריך להיות ממוקם קרוב חדר ההקלטה ככל האפשר, באופן אידיאלי על במת המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם וסת זרימה להתאים את קצב הזרימה על 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את האלקטרודה העליונה אל עמוד (שלילי) של 2 headstage באמצעות בעל אלקטרודה 2. לאגד בדיקה תרמי על האלקטרודה העליונה באמצעות טבעת O-. ודא טיפים האלקטרודה תרמי הם קרובים זה לזה, כך הקריאה הטמפרטורה נלקח קרוב למרכז הרשתית ככל האפשר. לטבול את קצה האלקטרודה העליונה בפתרון זלוף ולמקם אותו במרכז החדר. אפשר 10-15 דקות לייצוב הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מתח DC של דוד, כך הטמפרטורה של הפתרון הוא 36 -37 ° C. </li></ol> 3. בידוד רשתית עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת אור אדום עמום, להרדים את העכבר כהה מותאם עם CO 2 ו פריקה צוואר הרחם. אופציונלי: להפוך את סימון ההפניה על גלגל העין בכל העכבר על ידי צריבה נקודת הגב רוב בלובן העין עם עט או סיכה כויה לנתח מחוממת. כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת אור אינפרא אדום באמצעות ממירים תמונה אינפרא אדום בכושר מיקרוסקופ כדי לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את העיניים עם מספריים מעוגלות על ידי הפעלת לחץ עדין ומתיחת העור על הצדדים של כל עין. Hemisect שתי עיניים תחת תאורה אינפרא אדום באמצעות microscissors או סכין גילוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרנית ואת העדשה. הסר גם של הזגוגית ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיל הרשתית 1 משכבת ​​אפיתל הפיגמנט, ואם יש צורך, לנקות ביסודיות עם מלקחיים כדי להסיר את גרגרי הנותרים של אפיתל הפיגמנט. אנחנו בדרך כלל באמצעות הרשתית כולה הן מוט חרוט transretinal הקלטות. עם זאת, אם אתם רוצים להקליט במיוחד מהחלק הגב של הרשתית העכבר כי יש יותר M / L-גביעי 9, לפני קילוף הרשתית להסיר את החלק הגחוני של עיינית בסכין גילוח או microscissors באמצעות סימן כויה כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את גלגל העין hemisected 2 בצלחת פטרי קטנה עם פתרון הדגירה דגירה הכנה בתיבה אור חזק רווי חמצן טהור עד לשימוש. בדרך כלל, בתנאים אלה עיינית העכבר 2 יכול להיות מאוחסן במשך כמה שעות בטמפרטורת החדר ומשמש להקלטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כוס או טפטפת פלסטיק להעביר את הרשתית בודד לירידה של פתרון זלוף (μl בקירוב 300) על מכסה של צלחת פטרי. להוסיף 5-6 טיפות קטנות של פתרון האלקטרודה המכילים BaCl 2 עד הרשתית מראש דגירה עם BaCl 2. מניחים חתיכת ריבוע (5x5 מ&quot;מ בקירוב) של הצד האחורי בפינה, משומנת (אנו משתמשים Dow Corning 111 סיכה השסתום איטום) Millipore מסנן נייר (0.45 מיקרומטר HARG סוג) עם חור מוכנות במרכזו (2-2.5 מ&quot;מ קוטר) לירידה פתרון זהה. באמצעות עמדת מלקחיים הרשתית על גבי נייר סינון (בצד photoreceptor למעלה) ולחץ על הקצוות שלה בפריפריה כדי שטוח להעלות אותו. הרשתית יש מרוכז על פתיחת בעיתון הסינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים להעביר את נייר הפילטר עם הרשתית לתא זלוף ומניחים אותו מעל גירוי במקום מיושר שטח אלקטרודה נמוכה יותר. קצת לחץ את הקצוות המשומנת של נייר פילטר לקשר את זה עם החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את האלקטרודה העליונה מעל מרכז הרשתית (מעט לגעת שכבת photoreceptor). מרכוז האלקטרודה העליונה על הרשתית מגביר את משרעת האות (עד ~ 20-40% לעומת מיקומו קרוב יותר לקצה הרשתית). למרות מיקום האלקטרודה כך מעוות מעט אור יעיל גירוי בעוצמה להגיע מגזר קטן של הרשתית (~ 12-15% של השטח הכולל שלה), היא עדיין הדרך האופטימלית של הצבת electrode. הכנה מוכן כעת הקלטות transretinal. </li></ol> 4. Transretinal הקלטות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לקו העכבר, להקליט או מוט M / L-חרוט מונחה פלאש התגובות הבדיקה מ עמום עוצמת אור בהירה מכויל 505 ננומטר הניתן מתוך מקור אור LED או ממריץ אופטי. במקרה של מקור אור LED שלנו, עוצמת הפלאש הוא נשלט על ידי שילוב של בקרה ממוחשבת של מתח הזנה LED, נגדים להחלפה, ומערכת של מסנני צפיפות ניטרלי (אנו משתמשים בצבע E-211 # 0.9 הסרט ND מסננים מ רוסקו מעבדות ) ממוקם בין LED לבין הרשתית. משך הבדיקה של ה-LED Flash (20 MS) נשלטת על ידי מחשב. אם באמצעות נורת הלוגן ממריץ אופטי, עוצמת המבחן פלאש הגל יכול להיות נשלט על ידי מערכת של מסנני צפיפות ניטרלי או צרים הפרעה מסננים הלהקה, בהתאמה. משך הבדיקה פלאש יכול להיות נשלט על ידי מחשב מונעי התריסים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לשמירה יעילהדיכוי של הרכיב של גליה photoresponse עם BaCl 2 לאורך כל היום, שנה את הפתרון אלקטרודה נמוכה מדי פעם (למשל, לפני בדיקה של כל הרשתית) על ידי מחיקת אותו באמצעות מזרק פלסטיק מלא פתרון טרי. </li></ol> 5. נציג תוצאות פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשתית העכבר פתרון זלוף: 112.5 mM NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 מ&quot;מ CaCl 2, 10 HEPES מ&quot;מ (pH 7.2), 20 מ&quot;מ NaHCO 3, 3 מ&quot;מ succinate Na Na, 0.5 מ&quot;מ גלוטמט, 0.02 mM EDTA, ו 10 mM גלוקוז. בנוסף, הפתרון הוא השלים עם 2 מ&quot;מ L-גלוטמט ו 10 מיקרומטר DL-AP-4 לחסום רכיבים מסדר גבוה יותר של photoresponse 10,11, עם 0.1% MEM ויטמינים ממ חומצות אמינו פתרונות (Sigma) כדי לשפר את הרשתית הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האלקטרודה פתרון עכבר: 140 מ&quot;מ NaCl, KCl mM 3.6, 2.4 mM MgCl 2, 1.2 מ&quot;מ CaCl 2, 3 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4, NaOH). פתרון ele נמוכהשטח ctrode מכיל גם 2 מ&quot;מ L-גלוטמט לחסום את ההולכה הסינפטית 10, ובנוסף, 10 mM BaCl 2 לדכא את הרכיב של גליה photoresponse 3,12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדגירה פתרון הרשתית: להמיס 272 מ&quot;ג L-15 בינוני (Sigma) ו - 20 מ&quot;ג BSA במים 20 מ&quot;ל deionized. סופי L-15 ריכוזי BSA הם 13.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ו - 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל, בהתאמה. התאם את ה-pH 7.4 עם 1 M HCl. </li></ol><img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig1.jpg" /> באיור 1. תרשים סכמטי המציג את הבידוד של הרשתית העכבר על הקלטות transretinal ERG. <img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig2.jpg" /> איור 2. צילום של החדר ואת זלוף אלקטרודות הקלטה עם מחזיקי שלהם. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף. <img alt="איור 3." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig3.jpg"/&gt; איור 3. תרשים תרשים סכמטי של הניסוי להקלטות transretinal ERG. חיצים אדומים מצביעים על כיוון הזרימה זלוף. <img alt="באיור 4." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig4.jpg" /> . איור 4 תוצאות נציג: רשמה המשפחה של העכבר מוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים מייצגים ממוצעים של 5-6 תגובות בעוצמות האור העמום 2-3 ותגובות בעוצמות אור רוויי. <img alt="איור 5." src="/files/ftp_upload/3424/3424fig5.jpg" /> איור 5 תוצאות נציג:. משפחה מוקלט של העכבר חרוט מונע תגובות transretinal. Photoresponses היו נמוך לעבור סינון ב-Hz 30 (8-מוט Bessel), דיגיטציה של kHz 1 ומאוחסנים במחשב לניתוח נוסף. עקבות המוצגים הם בסיס ממוצעes התגובות 5-10 בעוצמות האור העמום 3-5 ותגובות בעוצמות אור רוויי.

<ol>
	<li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments.">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li><li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings.">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J. Gen. Physiol. 127, 359-374 (2006).</li><li>Nymark, S., Heikkinen, H., Haldin, C., Donner, K., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+responses+and+light+adaptation+in+rat+retinal+rods+at+different+temperatures.">Light responses and light adaptation in rat retinal rods at different temperatures.</a> J. Physiol. 567, 923-938 (2005).</li><li>Heikkinen, H., Nymark, S., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cone+photoresponses+obtained+with+electroretinogram+from+the+isolated+retina.">Mouse cone photoresponses obtained with electroretinogram from the isolated retina.</a> Vision Res. 48, 264-272 (2008).</li><li>Frank, R. N., Dowling, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhodopsin+photoproducts:+effects+on+electroretinogram+sensitivity+in+isolated+perfused+rat+retina.">Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina.</a> Science. 161, 487-489 (1968).</li><li>Wang, J. S., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+alternative+pathway+mediates+the+mouse+and+human+cone+visual+cycle.">An alternative pathway mediates the mouse and human cone visual cycle.</a> Curr. Biol. 19, 1665-1669 (2009).</li><li>Kolesnikov, A. V., Tang, P. H., Parker, R. O., Crouch, R. K., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+cone+visual+cycle+promotes+rapid+M/L-cone+pigment+regeneration+independently+of+the+interphotoreceptor+retinoid-binding+protein.">The mammalian cone visual cycle promotes rapid M/L-cone pigment regeneration independently of the interphotoreceptor retinoid-binding protein.</a> J. Neurosci. 31, (2011).</li><li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit.">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 13913-13918 (2000).</li><li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+cone+photoreceptor:+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning.">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li><li>Sillman, A. J., Ito, H., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mass+receptor+potential+of+the+isolated+frog+retina.+I.+General+properties+of+the+response.">Studies on the mass receptor potential of the isolated frog retina. I. General properties of the response.</a> Vision Res. 9, 1435-1442 (1969).</li><li>Vinberg, F., Koskelainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sets+the+physiological+value+of+the+dominant+time+constant+of+saturated+mouse+rod+photoresponse+recovery.">Calcium sets the physiological value of the dominant time constant of saturated mouse rod photoresponse recovery.</a> PLoS One. 5, e13025-e13025 (2010).</li><li>Bolnick, D. A., Walter, A. E., Sillman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barium+suppresses+slow+PIII+in+perfused+bullfrog+retina.">Barium suppresses slow PIII in perfused bullfrog retina.</a> Vision Res. 19, 1117-1119 (1979).</li></ol>

מחבר אין לי מה לחשוף.

שיטת מוט ו חרוט מונחה הקלטות transretinal ERG המתואר לעיל הופך כלי רב עוצמה על חקירת פונקציה של photoreceptors עכבר בסוג הן פראית בבעלי חיים מהונדסים גנטית. בנוסף לאפיון קל של נכסים photoresponse בסיסיים, טכניקה פשוטה זו מספקת יציבות בתגובה רבה במהלך לטווח ארוך ניסויים שבוצעו על קרוב אל ש...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם החומר </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערה </td></tr><tr><td> DL-AP-4 </td><td></td><td> במדעי החיים TOCRIS </td><td> 0101 </td><td></td></tr><tr><td> כל ריאגנטים אחרים </td><td></td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td><td></td></tr><tr><td> זכוכית נימים </td><td></td><td> Precision של מכשירים בעולם </td><td> TW100-4 </td><td> להכנת אלקטרודות </td></tr><tr><td> מסנן נייר </td><td> HARG </td><td> Millipore </td><td> HABG01300 </td><td></td></tr><tr><td> פוטומטר </td><td></td><td> UDT מכשירים </td><td> S350 </td><td> לצורך כיול האור </td></tr><tr><td> סיליקון רדיומטרי חיישן </td><td></td&gt; <td> UDT מכשירים </td><td> 221 </td><td> לצורך כיול האור </td></tr><tr><td> נגד רעידות השולחן </td><td></td><td> טכני ייצור Corporation </td><td> TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 </td><td> כדי למזער את הרעש המכני </td></tr><tr><td> מדחס אוויר פנתר P 15TC </td><td></td><td> ורתר הבינלאומי </td><td> P 15TC </td><td> מחובר שולחן נגד רעידות </td></tr><tr><td> סטראו </td><td></td><td> LEICA </td><td> MZ9.5 </td><td> לנתיחה העין העכבר </td></tr><tr><td> תמונה ממירי אינפרא אדום </td><td></td><td> BEMeyers </td><td> ProwlerTM </td><td> חייב סטראו </td></tr><tr><td> ההפרש מגבר DP-311 </td><td></td><td> וורנר מכשירים </td><td> DP-311 </td><td></td></tr><tr><td> האקסון Digidata 1440A digitizer </td><td>; </td><td> התקנים מולקולריים </td><td> 1440A </td><td></td></tr><tr><td> ערוץ כפול 8-מוט מסנן </td><td></td><td> קרון-הייט Corporation </td><td> 3382 </td><td></td></tr><tr><td> קרמיקה נגד </td><td></td><td> TE קישוריות </td><td> הרמטכ&quot;ל SBCHE618RJ </td><td> עבור מחמם שוב את הפתרון זלוף </td></tr><tr><td> תרמי </td><td> T </td><td> Physitemp מכשירים </td><td> IT-18 </td><td></td></tr><tr><td> צג הטמפרטורה </td><td></td><td> אומגה </td><td> DPi32 </td><td> מחובר תרמי </td></tr><tr><td> נורית 505 ננומטר </td><td></td><td> TT אלקטרוניקה / Optek טכנולוגיה </td><td> Digi-Key P / N 365-1185-ND </td><td> כדי להחיל מבחן / גלי אור הלבנה </td></tr><tr><td> כויה עט </td><td></td><td> Bovie </td><td> AA25 </td><td> לסימון חלק הגביגלגל העין של העכבר </td></tr><tr><td> pCLAMP 10 Electrophysiology רכישת נתונים ותוכנה ניתוח </td><td></td><td> התקנים מולקולריים </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

transretinal erg recordings from mouse retina: rod and cone photoresponses

ישנם שני סוגים שונים של התמונה יוצרי photoreceptors ברשתית חוליות: מוטות קונוסים. מוטות מסוגלים לזהות פוטונים בודדים של אור בעוד גביעי לפעול ברציפות תחת המשתנה במהירות בתנאי תאורה בהירים. קליטת האור על ידי מוט ו חרוט ספציפיים פיגמנטים ויזואליים של המגזרים החיצוניים של photoreceptors מפעילה מפל phototransduction שבסופו של דבר מוביל סגירת נוקלאוטיד-מגודרת ערוצי מחזורית על קרום פלזמה hyperpolarization התא. שינוי זה האור הנגרמת בקרום הנוכחי ופוטנציאל יכול להיות רשום כ photoresponse, על ידי 1,2 קלאסית האלקטרודה יניקה הקלטה לטכניקה או הקלטות electroretinogram transretinal (ERG) של הרשתית מבודדים עם חסומים פרמקולוגית רכיבים תגובה postsynaptic 3-5. השיטה השנייה מאפשרת סמים נגישים לטווח ארוך הקלטות של photoreceptors העכבר הוא שימושי במיוחד עבור קבלת photoresponses יציבים frאום את הקונוסים עכבר נדיר ושברירי. במקרה של קונוסים, ניסויים כאלה יכולים להתבצע גם בתנאי חושך, המותאמים תאורה חזקה הבאה זה עלול להלבין למעשה כל פיגמנט ויזואלי, כדי לפקח על תהליך ההתאוששות של רגישות חרוט במהלך עיבוד כהה 6,7. בסרטון הזה, אנו נראה כיצד לבצע מוט ו-M / L-חרוט מונחה הקלטות transretinal של הרשתית כהה מותאם העכבר. הקלטות רוד יבוצע באמצעות הרשתית מסוג (C57Bl / 6) עכברים בטבע. לשם הפשטות, הקלטות חרוט יהיה לקבל מהונדסים גנטית מוט transducin α-למקטע בנוקאאוט (Tα - / -) עכברים אשר חסרים מוט איתות 8.

Watch this Scientific Journal Video about Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses at JoVE.com

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

transretinal-erg-recordings-from-mouse-retina-rod-cone

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.7K Views.  Washington University School of Medicine. אנו מתארים שיטה פשוטה יחסית של transretinal electroretinogram (ERG) הקלטות להשגת photoresponses מוט חרוט מן הרשתית העכבר ללא פגע. גישה זו מנצלת את הבלוק של הולכה סינפטית מ photoreceptors לבודד תגובות אור שלהם ולהקליט אותם באמצעות אלקטרודות המונחות על פני שטח הרשתית שטוח רכוב מבודד.

Video: Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" (or "startle") response during the adult stage is mediated by the multi-component neuronal circuit called the Giant Fiber System (GFS). The comparative large size of the neurons, their distinctive morphology and simple connectivity make the GFS an attractive model system for studying neuronal circuitry. The GFS pathway is composed of two bilaterally symmetrical Giant Fiber (GF) interneurons whose axons descend from the brain along the midline into the thoracic ganglion via the cervical connective. In the mesothoracic neuromere (T2) of the ventral ganglia the GFs form electro-chemical synapses with 1) the large medial dendrite of the ipsilateral motorneuron (TTMn) which drives the tergotrochanteral muscle (TTM), the main extensor for the mesothoracic femur/leg, and 2) the contralateral peripherally synapsing interneuron (PSI) which in turn forms chemical (cholinergic) synapses with the motorneurons (DLMns) of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), the wing depressors. The neuronal pathway(s) to the dorsovental muscles (DVMs), the wing elevators, has not yet been worked out (the DLMs and DVMs are known jointly as indirect flight muscles - they are not attached directly to the wings, but rather move the wings indirectly by distorting the nearby thoracic cuticle) (King and Wyman, 1980; Allen et al., 2006). The di-synaptic activation of the DLMs (via PSI) causes a small but important delay in the timing of the contraction of these muscles relative to the monosynaptic activation of TTM (~0.5 ms) allowing the TTMs to first extend the femur and propel the fly off the ground. The TTMs simultaneously stretch-activate the DLMs which in turn mutually stretch-activate the DVMs for the duration of the flight. The GF pathway can be activated either indirectly by applying a sensory (e.g."air-puff" or "lights-off") stimulus, or directly by a supra-threshold electrical stimulus to the brain (described here). In both cases, an action potential reaches the TTMs and DLMs solely via the GFs, PSIs, and TTM/DLM motoneurons, although the TTMns and DLMns do have other, as yet unidentified, sensory inputs. Measuring "latency response" (the time between the stimulation and muscle depolarization) and the "following to high frequency stimulation" (the number of successful responses to a certain number of high frequency stimuli) provides a way to reproducibly and quantitatively assess the functional status of the GFS components, including both central synapses (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) and the chemical (glutamatergic) neuromuscular junctions (TTMn-TTM and DLMn-DLM). It has been used to identify genes involved in central synapse formation and to assess CNS function.

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

The Giant Fiber System is a simple neuronal circuit of adult Drosophila melanogaster containing the largest neurons in the fly. We describe the protocol for monitoring synaptic transmission through this pathway by recording post synaptic potentials in dorsal longitudinal (DLM) and tergotrochanteral (TTM) muscles following direct stimulation of the Giant Fiber interneurons.

הקלטות אלקטרו מתוך מסלול של סיבים ענק ד melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

ב electroporation vivo של הרשתית עכבר פיתוח

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Assessment of Vascular Regeneration in the CNS Using the Mouse Retina

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). It is increasingly being recognized that several neurodegenerative diseases such as Alzheimer&#8217;s, multiple sclerosis, and amyotrophic lateral sclerosis present elements of vascular compromise. In addition, the most prominent causes of blindness in pediatric and working age populations (retinopathy of prematurity and diabetic retinopathy, respectively) are characterized by vascular degeneration and failure of physiological vascular regrowth. The aim of this technical paper is to provide a detailed protocol to study CNS vascular regeneration in the retina. The method can be employed to elucidate molecular mechanisms that lead to failure of vascular growth after ischemic injury. In addition, potential therapeutic modalities to accelerate and restore healthy vascular plexuses can be explored. Findings obtained using the described approach may provide therapeutic avenues for ischemic retinopathies such as that of diabetes or prematurity and possibly benefit other vascular disorders of the CNS.

The rodent retina has long been recognized as an accessible window to the brain. In this technical paper we provide a protocol that employs the mouse model of oxygen-induced retinopathy to study the mechanisms that lead to failure of vascular regeneration within the central nervous system after ischemic injury. The described system can also be harnessed to explore strategies to promote regrowth of functional blood vessels within the retina and CNS.

הערכה של כלי דם התחדשות במערכת העצבים המרכזית באמצעות רשתית העכבר

The rodent retina is perhaps the most accessible mammalian system in which to investigate neurovascular interplay within the central nervous system (CNS). ...

Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in contact with the retinal pigmented epithelium in the most distant part on the retina considering the direction of light, and the ganglion cells in the most proximal distance. This architecture allows the isolation of the photoreceptor layer by vibratome sectioning. The dissected neural retina of a mouse aged 8 days is flat-embedded in 4% gelatin on top of a slice of 20% gelatin photoreceptor layer facing down. Using a vibratome and a double edged razor blade, the 100 &#181;m thick inner retina is sectioned. This section contains the ganglion cells and the inner layer with notably the bipolar cells. An intermediary section of 15 &#181;m is discarded before 200 &#181;m of the outer retina containing the photoreceptors is recovered. The gelatin is removed by heating at 37 &#176;C. Pieces of outer layer are incubated in 500 &#181;l of Ringer&#39;s solution with 2 units of activated papain for 20 min at 37 &#176;C. The reaction is stopped by adding 500 &#181;l 10% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM), then 25 units of DNAse I is added before centrifugation at RT, washed several times to remove serum and the cells are resuspended in 500 &#181;l of DMEM and seeded at 1 x 105 cells/cm2. The cells are grown to 5 days in vitro and their viability scored using live/dead assay. The purity of the culture is first determined by microscopic observation during the experiment. The purity is then validated by seeding and fixing cells on a histological slide and analyzing using a rabbit polyclonal anti-SAG, a photoreceptor marker and mouse monoclonal anti-RHO, a rod photoreceptor specific marker. Alternatively, the photoreceptor layer (97% rods) can be used for gene or protein expression analysis and for transplantation.

Neural retina of a mouse aged 8 days is on top of a 4% gelatin block. After isolation of the photoreceptor layer (200 &#181;m) by vibratome, the photoreceptors are seeded after mechanical and enzymatic dissociation for culture. The photoreceptor layer can be used for molecular, biochemical analyses or transplantation.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

The retina is a part of the central nervous system that has organized architecture, with neurons in layers from the photoreceptors, both rods and cones in ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

ההדמיה Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Dynamics בסופי קון קולטי האור אקסון של רשתית העכבר

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the analysis of density and size gradients of retinal cell types, the direction tuning of direction-selective ganglion cells, and the examination of topographic degeneration patterns in some retinal diseases. However, there are many different ocular dissection methods reported in the literature that are used to identify and label retinal orientation in the mouse retina. While the method of orientation used in such studies is often overlooked, not reporting how retinal orientation is determined can cause discrepancies in the literature and confusion when attempting to compare data between studies. Superficial ocular landmarks such as corneal burns are commonly used but have recently been shown to be less reliable than deeper landmarks such as the rectus muscles, the choroid fissure, or the s-opsin gradient. Here, we provide a comprehensive guide for the use of deep ocular landmarks to accurately dissect and document the spatial orientation of an isolated mouse retina. We have also compared the effectiveness of two s-opsin antibodies and included a protocol for s-opsin immunohistochemistry. Because orientation of the retina according to the s-opsin gradient requires retinal reconstruction with Retistruct software and rotation with custom code, we have presented the important steps required to use both of these programs. Overall, the goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable set of methods for accurate retinal orientation that is adaptable to most experimental protocols. An overarching goal of this work is to standardize retinal orientation methods for future studies.

This protocol provides a comprehensive dissection and analysis guide for the use of deep ocular landmarks, s-opsin immunohistochemistry, Retistruct, and custom code to accurately and reliably orient the isolated mouse retina in anatomical space.

איפה אתה חותך בנושאים: דיסקציה ומדריך ניתוח האוריינטציה המרחבי של הרשתית העכבר מן ציוני דרך עינית

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel telemetric electroencephalography system in combination with standard self-adhesive hydrogel electrodes. The piglets are calmed down without the use of sedatives. After their release into the pigpen, the piglets behave normally&#8212;they drink and sleep in the same cycle as their siblings. Their sleep phases are used for the EEG recordings.

Here, we present a protocol to record telemetric electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen without the use of a sedative, making it possible to record typical EEG patterns during non-REM sleep, like spindle bursts.

EEG לא פולשנית הקלטות לנוע בחופשיות חזירונים

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the brains of AD patients, these do not improve memory functions. Since A&#946; aggregates in the brain before the appearance of memory impairments, targeting A&#946; may be inefficient for treating AD patients who already exhibit memory deficits. Therefore, downstream signaling due to A&#946; deposition should be blocked before AD development. A&#946; induces axonal degeneration, leading to the disruption of neuronal networks and memory impairments. Although there are many studies on the mechanisms of A&#946; toxicity, the source of A&#946; toxicity remains unknown. To help identify the source, we propose a novel protocol that uses microscopy, gene transfection, and live cell imaging to investigate early changes caused by A&#946; in axonal growth cones of cultured neurons. This protocol revealed that A&#946; induced clathrin-mediated endocytosis in axonal growth cones followed by growth cone collapse, demonstrating that inhibition of endocytosis prevents A&#946; toxicity. This protocol will be useful in studying the early effects of A&#946; and may lead to more efficient and preventative AD treatment.

Here a protocol to investigate the early effects of amyloid-&#946; (A&#946;) in the brain is presented. This shows that A&#946; induces clathrin-mediated endocytosis and collapse of axonal growth cones. The protocol is useful in studying early effects of A&#946; on axonal growth cones and may facilitate prevention of Alzheimer's disease.

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...

Transretinal ERG הקלטות של רשתית עכבר: רוד Photoresponses חרוט

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video