بفضل المختبر Anseth كريستي من جامعة كولورادو في بولدر لتوريد بسخاء MIN6 الخلايا. وقد تم توفير التمويل لهذا المشروع من قبل جبهة الخلاص الوطني.

1. PEGDM التوليف ومتفاعل للضوء حل macromer إعداد PEGDM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن 2G من PEG (خطي ، 10،000 دا) إلى قارورة زجاجية 40mL مع غطاء من البلاستيك الصلب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 308μL تقريبا أنهيدريد ميثاكريليك فضفاضة وغطاء القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القارورة الميكروويف على ارتفاع لمدة 2 دقيقة في الميكروويف محلية القياسية. قفازات مقاومة للحرارة لبس ، دوامة القارورة جيدا ، ثم الميكروويف على ارتفاع لمدة 5 دقائق إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لفترة وجيزة القارورة ليبرد بما يكفي ليكون التعامل معها قفازات. إرفع قبعة وإضافة ببطء في حين يحوم كلوريد الميثيلين القارورة. إضافة كافية بحيث يبدو الحل واضح ومتجانس ، vortexing العينة حسب الحاجة. وينبغي أن إجمالي حجم كلوريد الميثيلين استخدامها 1،5-2 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PEGDM يعجل في 200 مل من البرد ، أثار إثيل الأثير عن طريق إضافة قطرة قطرة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع PEGDM الفراغ عن طريق الترشيح واتركه حتى يجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل PEGDM في كمية كافيةمن الماء منزوع الأيونات (عادة 100 -150 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze الحل ضد الماء منزوع الأيونات لمدة 5 أيام في أنابيب غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 1000 دا. استبدال المياه مرة واحدة يوميا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة الحل في حاويات مناسبة والتجميد في -80 درجة مئوية خلال الليل. Lyophilize الحل لمدة 4 أيام لتنقية تسفر عن مسحوق أبيض PEGDM. تخزين مسحوق عند 4 درجة مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد حل PEGDM متفاعل للضوء ، وإعداد لأول مرة في المائة من الوزن 0.5 photoinitiator حل الأسهم عن طريق تذويب Irgacure 2959 في الماء منزوع الأيونات. دوامة الحل وتخزينه في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ٪ بالوزن وPEGDM 0.025 ٪ بالوزن Irgacure 2959 حل في محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS). دوامة بدقة لضمان حل PEGDM. نحن نستعد عادة 1mL هذا الحل في وقت واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم حل عن طريق التصفية عليه من خلال تصفية حقنة 0.2 ميكرومتر في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوموتخزينها في 4 درجات مئوية </li></ol> 2. والثقافة ، والعدوى ، وتجميع الخلايا MIN6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تستزرع MIN6 الخلايا في المتوسط ​​1640 RPMI تستكمل مع FBS 10 ٪ والجلوكوز 7mM ، 100 وحدة / مل البنسلين / الستربتومايسين ، و0.5 ميكروغرام / مل ب amphotercin في بيئة ترطيب عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الافراج عن الخلايا من سطح القارورة ثقافة المعالجة ، ونضح والمتوسطة ، وشطف الخلايا مع 37 درجة مئوية الكالسيوم / المغنيسيوم خالية HBSS ، ونضح HBSS ، ثم يضاف 2 مل من 37 درجة مئوية التربسين - EDTA الحل وتسمح للخلايا احتضان لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جرة بحزم الى جانب القارورة لضرب الخلايا الحرة ، ثم تضاف 8 مليلتر من 37 درجة مئوية والمتوسطة بقوة ماصة تعليق الخلية أعلى وأسفل مع الحرص على عدم إدخال الفقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة الخلايا في العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي ، وإجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات أو خلية أخرى العد الداخلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في الاستعداد لتصيب الخلايا مع صانعالفيروس ، أولا تحديد العدد الكلي للخلايا المصابة ويكون لحساب حجم تعليق الفيروس اللازمة لتحقيق تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية) (5-10 الجزيئات المعدية في الخلية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الفيروس في HBSS بواسطة pipeting بعناية كمية مناسبة من التعليق الفيروس إلى وحدة تخزين من قبل aliquoted HBSS في أنبوب مل microcentrifuge 1.8. 50 ميكرولتر من HBSS لكل بئر من الخلايا في مجموعها مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفريق الخلايا pipeting لهم صعودا ونزولا في أنبوب بهم ، ثم الماصة حجم اللازمة لتحقيق 400،000 الخلايا لكل بئر من الآبار في تعليق لوحة الثقافة 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الحجم المناسب من الفيروس المخفف لكل بئر إلى تحقيق المنشود وزارة الداخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل بئر المتوسطة لتحقيق حجم يصل الإجمالي إلى 1.7 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة على شاكر المداري داخل الحاضنة. تعيين شاكر على إعداد منخفض بحيث المتوسطة يغسل بلطف حول الآبار (~ 100 دورة في الدقيقة). السماح للخلايا لaggregaالشركة المصرية للاتصالات ل24-36 ساعة. وينبغي تشكيل المجاميع التي يبلغ قطرها التقريبي لل75-175 ميكرون. </li></ol> 3. تغليف الخلايا في PEGDM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون مغلفة الخلايا كما تشتت (الخطوة 2.4) أو التجميع التالية (الخطوة 2.10). منذ PEGDM السلائف حل هيدروجيل هو السائل ، قد تميل إلى تسوية الخلايا قبل يشابك وتشكيل هيدروجيل. إذا كان من المتوقع أن تحدث تسوية بسرعة ، كما هو الحال مع المجاميع الكبيرة ، قد يكون من المفيد لانتاج هيدروجيل في خطوتين بحيث تستقر الخلايا إلى الطائرة المركزية للهلام. ويرد التوليف هيدروجيل خطوة واحدة الإجراء المناسب لخلايا متفرقة (الشكل 2) ، ويظهر الإجراء على مرحلتين وكذلك (الشكل 3) ومفصلة أدناه (3،2-3،9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء السفينة التي سيتم تشكيلها في هيدروجيل بقطع رأس مدبب الخروج من حقنة من البلاستيك 1 مل ووضعه في نهاية المطاف فتح في رفوف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة 20 ميكرولتر من PEGDM متفاعل للضوء ذلكlution في النهاية المفتوحة للحقنة على الغواص التأكد من حجم يغطي سطح المكبس بأكمله. ضبط المكبس بزيادات صغيرة لتحقيق سطح السائل المسطحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الماصة في رف رف وموقف تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية (365nm ، ~ 7 ميغاواط / سم 2) لحوالي 8 دقائق للسماح لليشابك هيدروجيل. خلال هذا الوقت ، قد بدأت التحضير للخلايا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة مجلد يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا / المجاميع في أنبوب 1.8 مل microcentrifuge ، وكأب ، والطرد المركزي في أنبوب 130 جرام لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام micropipettor ، إزالة بعناية وسائل الإعلام من دون إزعاج بيليه الخلية في طرف الأنبوب. رئيسا وسائل الاعلام النهج بيليه ، فإنه قد يكون من المفيد استخدام الدقيقة ، 10 ميكرولتر طرف الماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend بلطف بيليه الخلية في 20 ميكرولتر من محلول PEGDM متفاعل للضوء (استخدام طرف الماصة واسعة الفم إذا كان يعمل مع المجاميع) وإضافة تعليق الخلية إلى حقنة على رأس اله crosslinked سابقا جزء هيدروجيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح المحقنة إلى 8 دقائق إضافية من الأشعة فوق البنفسجية لاستكمال بناء هيدروجيل. عند الانتهاء ، يجب أن تكون خلايا مغلفة بشكل كامل في هيدروجيل اسطواني الشكل (3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخراج هيدروجيل من المحاقن وعلى 1 مل من HBSS في البئر من 24 لوحة ليغسل جيدا لفترة وجيزة من هلام. نقل الجل إلى 1 مل من وسائل الإعلام في البئر من 24 لوحة جيدا والثقافة وفقا للشروط المطلوبة. </li></ol> 4. تتبع نقص الأكسجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أي نقطة خلال الصور ، والثقافة الخلايا باستخدام المجهر الفلورسنت لتعقب بدء إشارات ميتة. اعتمادا على ما يجري تصويرها يمكنك الصورة في لوحة متعددة جيدا أو نقل الجل على شريحة المجهر قبل وضعها على المسرح المجهر. ويتم تحقيق الإثارة ذروتها الأحمر التاءات في 556nm والانبعاثات ذروتها في 586nm. الانبعاثات المكثفة إلى حد ما وبالتالي photobleaching لم observإد أن يكون مشكلة. الفارق الزمني بين الشروع في إنتاج البروتين وأول إشارة الكشف عن ما يقرب من 12 ساعة. إشارة محددة بما فيه الكفاية لتحديد الخلايا الفردية إشارات ، ولكن القرار قد لا تكون كافية لتحديد الخلايا توطين الإشارة. في الخلايا مما يشير ، يلاحظ عادة إشارة بشكل موحد في جميع أنحاء السيتوبلازم. ويمكن الإشارة أيضا زيادة كثافة مع التعرض لنقص الأكسجة الموسعة ، على الرغم من أننا حتى الآن لم يحدد تماما ما إذا كان هذا يرجع إلى زيادة البروتين التعبير ، عموما تراكم البروتين ، أو تأخر نضج البروتين. </li></ol> 5. ممثل النتائج ويبين المثال ممثل MIN6 المجاميع مغلفة في هيدروجيل PEG في الشكل 4. فإن جل crosslinked تكون صلبة في جميع أنحاء ، آخذا شكل السفينة التي كان يؤديها في رد الفعل. وهلام مع أسطح سلسة الخارجي هو الأفضل لزرع للمساعدة في منع إعادة جسم غريبsponse. في هلام ، ينبغي المجاميع الخلية المغلقة بالكامل في المصفوفة وتوزيعها متجانس للسماح لنقل المواد الغذائية على نحو أفضل. والصور المصورة ممثل يشير ميتة في MIN6 المجاميع في الشكل 5. وكانت متطابقة مثقف MIN6 المجاميع المصابة بالفيروس في علامة O 20 ٪ إما 2 (5A) أو 1 ٪ O 2 (5B) لمدة 44 ساعة قبل التقاط الصورة. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> الشكل 1. التخطيطي لنشاط نظامنا علامة نقص الأكسجة. الفيروسة الغدانية الإدراج من الجين التاءات DR الأحمر والمنبع المروج تعليم حقوق الإنسان يسمح لنقص الأكسجة الناجم عن إنتاج بروتين فلوري تحت سيطرة مؤسسة الحرمين - 1. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> الشكل 2. فرقت الإجرائية الرسم البياني للتغليف خطوة واحدة من الخلايا في MIN6 هيدروosslinked هيدروجيل PEGDM. لكل جيل ، وعلقت الخلايا الموزعة في 40μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء. يتم وضع هذا في حقنة a 1mL مقطوعة الرأس ، ويتم تشكيل هيدروجيل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية 365nm بعد 10-12 دقيقة. عند الانتهاء ، يتم إزالة القرص هيدروجيل من المحاقن ، وغسلها ووضعها في لوحة متوسطة مملوءة جيدا لحضانة. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> الشكل 3. الإجرائية الرسم البياني للتغليف المزدوج خطوة من الخلايا MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM crosslinked. لكل جيل ، يتم تشكيل لأول مرة نصف هلام الأشعة فوق البنفسجية التي يشابك من 20μL من macromer حل PEGDM متفاعل للضوء لمدة 8 دقائق. وعلقت بعناية MIN6 المجاميع في 20μL إضافية من حل macromer متفاعل للضوء الذي يضاف على الجزء العلوي من هلام نصف قبل تشكيلها. يتم تشكيل هلام الكامل من قبل 8 دقائق من التعرض للأشعة فوق البنفسجية إضافية مع المجاميع مغلفة بشكل كامل في الإنسيالطائرة من هلام. <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> الشكل 4. صورة من هيدروجيل 40μL 20X تحت التكبير. وينظر بشكل واضح MIN6 المجاميع (~ 400000 مجموع الخلايا) داخل هلام. قطرها حوالي 6mm هيدروجيل هو (شريط 1MM =). <img alt="الشكل 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> الشكل 5. نقص الأكسجين في الخلايا مما يشير نيون MIN6 مجمعة في هيدروجيل PEGDM. الخلايا التي تم تغليفها ثم توضع في الحضانة عند 20 ٪ O 2 لمدة 44 ساعة لا تعرض إشارات نقص الأكسجة (أ) في حين أن الخلايا التي تم تغليفها ثم حضنت في 2 ٪ O ​​2 لمدة 44 ساعة شاشة واضحة ، إشارة في كل مكان. (شريط 100μm =) (ب).

<ol>
	<li>Kelly, W., Lillehei, R., Merkel, F., Idezuki, Y., Goetz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allotransplantation+of+the+pancreas+and+duodenum+along+with+the+kidney+in+diabetic+nephropathy.">Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy.</a> Surgery. 61, 827-837 (1967).</li><li>Shapiro, J. A. M., Ricordi, C., Hering, B. J., Auchincloss, H., Lindblad, R., Robertson, R. P., Secchi, A., Brendel, M. D., Berney, T., Brennan, D. C., Cagliero, E., Alejandro, R., Ryan, E. A., DiMercurio, B., Morel, P., Polonsky, K. S., Reems, J., Bretzel, R. G., Bertuzzi, F., Froud, T., Kandaswamy, R., Sutherland, D. E. R., Eisenbarth, G., Segal, M., Preiksaitis, J., Korbutt, G. S., Barton, F. B., Viviano, L., Seyfert-Margolis, V., Bluestone, J., Lakey, J. R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+trial+of+the+Edmonton+Protocol+for+islet+transplantation.">International trial of the Edmonton Protocol for islet transplantation.</a> N. Eng. J. Med.. 355, 1318-1330 (2006).</li><li>Sun, A. M., O'Shea, G. M., Goosen, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+microencapsulated+islet+cells+as+a+bioartificial+pancreas.">Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas.</a> Appli. Biochem. Biotechnol. 10, 87-99 (1984).</li><li>Iwata, H., Amemiva, H., Matsuda, T., Takano, H., Hayashi, R., Akutsu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+microencapsulated+islets+in+agarose+gel+as+bioartificial+pancreas+by+studies+of+hormone+secretion+in+culture+and+by+xenotransplantation.">Evaluation of microencapsulated islets in agarose gel as bioartificial pancreas by studies of hormone secretion in culture and by xenotransplantation.</a> Diabetes. 39, 224-225 (1989).</li><li>Zhang, W. J., Laue, C., Hyder, A., Schrezenmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purity+of+alginate+affects+the+viability+and+fibrotic+overgrowth+of+encapsulated+porcine+iselt+xenografts.">Purity of alginate affects the viability and fibrotic overgrowth of encapsulated porcine iselt xenografts.</a> Transplant Proc. 33, 3517-3519 (2001).</li><li>Lin-Gibson, S., Bencherif, S., Cooper, J. A., Wetzel, S. J., Antonucci, J. M., Vogel, B. M., Horkay, F., Washburn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+characterization+of+PEG+dimethacrylates+and+their+hydrogels.">Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels.</a> Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).</li><li>Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG-based+hydrogels+as+an+in+vitro+encapsulation+platform+for+testing+controlled+&#x03B2;-cell+microenvironments.">PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled &#x03B2;-cell microenvironments.</a> Acta. Biomater. 2, 1-8 (2006).</li><li>Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+PEG+hydrogel+crosslinking+density+on+protein+diffusion+and+encapsulated+islet+survival+and+function.">Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 90, 720-729 (2009).</li><li>Bryant, S. J., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogel+properties+influence+ECM+production+by+chondrocyte+photoencapsulated+in+poly(ethylene+glycol)+hydrogels.">Hydrogel properties influence ECM production by chondrocyte photoencapsulated in poly(ethylene glycol) hydrogels.</a> J. Biomed. Mater. Res. 59, 63-72 (2001).</li><li>Bryant, S. J., Nuttelman, C. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytocompatibility+of+UV+and+visible+light+photoinitiating+systems+on+cultured+NIH/3T3+fibroblasts+in+vitro.">Cytocompatibility of UV and visible light photoinitiating systems on cultured NIH/3T3 fibroblasts in vitro.</a> J. Biomater. Sci. Polymer Edn. 11, 439-457 (2000).</li><li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+oxygen+on+isolated+pancreatic+tissue.">Effect of oxygen on isolated pancreatic tissue.</a> Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs. 35, 739-741 (1989).</li><li>Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+hypoxia+on+insulin+secretion+by+isolated+rat+and+canine+islets+of+Langerhans.">Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans.</a> Diabetes. 42, 12-21 (1993).</li><li>De Groot, M., Schuurs, T. A., Keizer, P. P. M., Fekken, S., Leuvenink, H. G. D., van Schilfgaarde, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response+of+encapsulated+rat+pancreatic+islets+to+hypoxia.">Response of encapsulated rat pancreatic islets to hypoxia.</a> Cell Transplant. 12, 867-875 (2003).</li><li>Fancy, M. L., Topiwala, R., Sahai, P., S, J. O., Blanchette, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+hypoxia+with+insulin+secretion+using+a+fluorescent+hypoxia+detection+system.">Correlating hypoxia with insulin secretion using a fluorescent hypoxia detection system.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. 97, 148-155 (2011).</li><li>Webb, J. D., Coleman, M. L., Pugh, C. W. H. y. p. o. x. i. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hypoxia-inducible+factors+(HIF),+HIF+hydroxylases+and+oxygen+sensing.">hypoxia-inducible factors (HIF), HIF hydroxylases and oxygen sensing.</a> Cell. Mol. Life Sci. 66, 3539-3554 (2009).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الطريقة المعروضة هنا تقدم تقنية سريعة وبسيطة لتغليف الخلايا في هيدروجيل الربط مع استخدام الحد الأدنى من الشروط غير الفسيولوجية. PEG يمثل مادة التغليف مفيدة جدا للتوافق مع الحياة وسهولة التعديل. اختلاف بسيط من نسبة الربط في حل متفاعل للضوء ، على سبيل المثال ، قد يتم استخدامها لضبط الخواص الميكانيكية ، مثل معامل الضغط ، وخصائص النقل عن طريق حجم المسام. أيضا ، يتم تعديل الربط بسهولة عن طريق إضافة السلاسل الجانبية. PEG الهلاميات المائية ، وبالتالي ، تمثل كل جهاز السريرية واعدة منصة مرنة للأبحاث في المختبر كما تم تتبع طريقة لنقص الأكسجة في الربط بين الخلايا مغلفة المقدمة. هذه الطريقة مفيدة للكشف عن نقص الأكسجة بساطة وتجنب الحاجة للتضحية خلايا الفائدة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا في مجموعة متنوعة من الظروف مما يجعلنا فيefulness اسعة. على سبيل المثال ، قد يتم تعقب نقص الأكسجة وتلميحا عن تمايز الخلايا الجذعية في الثقافات الجذعية micromass الخلية. ومع ذلك ، لا يمكن إلا أن تطبق هذه الطريقة لتفريق نظم الخلية أو النظام الذي يتم تجميعها في وقت لاحق فرقت الخلايا. أيضا ، قد كشف للإشارة الفلورسنت يكون من الصعب في الأنسجة أكبر أو أكثر كثافة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليق (اختياري </td></tr><tr><td> PEG </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 309028 - 500G </td><td></td></tr><tr><td> ميثاكريليك الاندريد </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 276685 - 100ML </td><td></td></tr><tr><td> الميكروويف </td><td> ايمرسون </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> الصناعات العلمية </td><td> SI - A236 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الميثيلين </td><td> سيغما الدريخ </td><td> D65100 - 1L </td><td></td></tr><tr><td> إثيل الأثير </td><td> سيغما الدريخ </td><td> 346136 - 1L </td><td></td></tr><tr><td> غسيل الأنابيب </td><td> طيف </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> المختبرات </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الفريزر </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> فراغ مضخة </td><td> وولش </td><td> 8917Z - 01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> شركة سيبا Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21-022 - CV </td><td></td></tr><tr><td> حقنة تصفية </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * صياغة مخصصة </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA مختبرات </td><td> A15 - 351 </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين الستربتوميسين </td><td> Mediatech </td><td> 30-002 - CI </td><td></td></tr><tr><td> الأمفوتريسين B </td><td> Mediatech </td><td> 30-003 - CF </td><td></td></tr><tr><td> حاضنة </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 3597 </td><td> نابكو سلسلة WJ 8000 ث / O2 قمع </td></tr><tr><td> التربسين EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-052 - CI </td><td></td></tr><tr><td> شاكر المداري</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> مصباح الأشعة فوق البنفسجية </td><td> سانيو Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> دورتين 40W ، 365nm المصابيح blacklight الأشعة فوق البنفسجية الزرقاء </td></tr><tr><td> الطرد المركزي </td><td> إيبندورف </td><td> * 5811 000.010 </td><td> * رقم الطلب. طراز R 5810 </td></tr><tr><td> مجهر </td><td> نيكون </td><td> TI - ND6 - PFS </td><td> مع filterset عن الإثارة 556nm / الانبعاثات 586nm </td></tr></table>

tracking hypoxic signaling within encapsulated cell aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates at JoVE.com

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

تم وصف طريقة لتغليف الخلايا الضوئية الشمسية في هيدروجيل PEG crosslinked. يتم تعقب إشارات ميتة داخل ورم جزيري الفئران مغلفة (MIN6) المجاميع باستخدام نظام علامة الفلورسنت. يسمح هذا النظام التسلسلي للفحص الخلايا في غضون سقالة هيدروجيل ويشير ارتباط نقص الأوكسجين مع التغيرات في النمط الظاهري الخلية.

وفي اشارة الى نقص الأوكسجين داخل تعقب المجاميع خلية مغلف

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.5K Views.  University of South Carolina. تم وصف طريقة لتغليف الخلايا الضوئية الشمسية في هيدروجيل PEG crosslinked. يتم تعقب إشارات ميتة داخل ورم جزيري الفئران مغلفة (MIN6) المجاميع باستخدام نظام علامة الفلورسنت. يسمح هذا النظام التسلسلي للفحص الخلايا في غضون سقالة هيدروجيل ويشير ارتباط نقص الأوكسجين مع التغيرا?...

Video: Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

تحليل الهجرة خلية داخل الكولاجين مصفوفة ثلاثية الأبعاد

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as cyclodextrin nanosponges (CDNSEDTA). Two different preparations are described with 1:4 and 1:8 CD-EDTA molar ratios. The corresponding cross-linked polymers were contacted with 0.27 M aqueous solution of ibuprofen sodium salt (IP) leading to homogeneous, colorless, drug loaded hydrogels.
The systems were characterized by high resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy. Pulsed field gradient spin echo (PGSE) NMR spectroscopy was used to determine the mean square displacement (MSD) of IP inside the polymeric gel at different observation times td. The data were further processed in order to study the time dependence of MSD: MSD = f(td). The proposed methodology is useful to characterize the different diffusion regimes that, in principle, the solute may experience inside the hydrogel, namely normal or anomalous diffusion. The full protocols including the polymer preparation and purification, the obtainment of drug-loaded hydrogels, the NMR sample preparation, the measurement of MSD by HR-MAS NMR spectroscopy and the final data processing to achieve the time dependence of MSD are here reported and discussed. The presented experiments represent a paradigmatic case and the data are discussed in terms of innovative approach to the characterization of the transport properties of an encapsulated guest within a polymeric host of potential application for drug delivery.

The motion regimes of ibuprofen encapsulated in &#946;-cyclodextrin nanosponges polymer network are investigated using pulsed-field-gradient spin-echo (PGSE) NMR technique. Synthesis, purification, drug loading, implementation of the NMR pulse sequence and data analysis to work out the mean square displacement of the drug at several observation times are described in detail.

خصائص نقل ايبوبروفين مغلف في سيكلودكسترين Nanosponge الهلاميات المائية: بروتون HR-MAS NMR الطيفي دراسة

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

الأنسجة الطلائية الهندسة ثلاثي الأبعاد جزءا لا يتجزأ من داخل خارج الخلية مصفوفة

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

تجميع وتتبع التنمية المجتمعية الميكروبية داخل منصة ميكرويل صفيف

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

وصف الهجرة الخلية في إطار ثلاثي الأبعاد في المختبر الجرح البيئات

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

بروتوكول لتتبع في الوقت الحقيقي 3D الجسيمات مفردة

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

المداري تهز ثقافة خلايا الثدييات في السفن على شكل س لإنتاج المجاميع الموحدة

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...