Dank der Kristi Anseth Labor der University of Colorado, Boulder für die großzügige Bereitstellung MIN6 Zellen. Die Finanzierung für dieses Projekt wurde von der NSF zur Verfügung gestellt.

1. PEGDM Synthese und photoaktive PEGDM Makromer-Aufbereitung <ol><li> Wiegen Sie 2 g PEG (linear, 10.000 Da) in ein 40 mL Glasröhrchen mit einem harten Kunststoffkappe. </li><li> Add rund 308μL Methacrylsäureanhydrid und lose Kappe der Ampulle. </li><li> Microwave das Fläschchen auf hoch für 2 Minuten in einer haushaltsüblichen Mikrowelle. Tragen hitzebeständige Handschuhe, gründlich vortexen das Fläschchen, dann Mikrowelle auf hoch für weitere 5 Minuten. </li><li> Kurz ermöglichen das Fläschchen, um genug kühl, um mit Handschuhen angefasst werden. Uncap es und langsam Methylenchlorid während wirbelnde das Fläschchen. Add genug, so dass die Lösung klar und homogen erscheint, Vortexen der Probe benötigt. 2 mL - Das Gesamtvolumen von Methylenchlorid verwendet werden sollte 1,5 betragen. </li><li> Niederschlag PEGDM in 200 ml kaltem, gerührt Diethylether, indem die Lösung getropft. </li><li> Sammeln Sie die PEGDM durch Vakuumfiltration und trocknen lassen. </li><li> Lösen Sie die PEGDM in ausreichender MengeVE-Wasser (in der Regel 100 -150 ml). </li><li> Dialysieren die Lösung gegen entionisiertes Wasser für 5 Tage in Dialyseschlauch mit einem Molekulargewicht cut-off von 1.000 Da. Ersetzen Sie das Wasser einmal täglich. </li><li> Aliquot der Lösung in geeignete Behälter und frieren bei -80 ° C über Nacht. Lyophilisieren die Lösung für 4 Tage, um ein gereinigtes weißes PEGDM Pulver zu erhalten. Bewahren Sie das Pulver bei 4 ° C, wenn nicht in Gebrauch ist. </li><li> So bereiten Sie eine photoaktive PEGDM Lösung, zunächst ein 0,5 Gewichtsprozent Photoinitiator Stammlösung durch Auflösen Irgacure 2959 in VE-Wasser. Vortex die Lösung und speichern sie in der Dunkelheit. </li><li> Bereiten Sie eine 10 Gew.% PEGDM und 0,025 wt% Irgacure 2959 Lösung in Balanced Salt Hanks Solution (HBSS). Vortex gründlich, um sicherzustellen, Auflösung der PEGDM. Wir bereiten in der Regel 1 ml dieser Lösung zu einem Zeitpunkt. </li><li> Sterilisation der Lösung durch Filtration durch einen 0,2 um Spritzenfilter in ein 1,8 ml Reaktionsgefäß. Wickeln Sie das Rohr in Alufolieund lagern bei 4 ° C </li></ol> 2. Kultur, Infektion und Aggregation von MIN6 Zellen <ol><li> MIN6 Zellen werden in RPMI 1640 Medium mit 10% FBS, 7mm Glukose, 100 Einheiten / ml Penicillin / Streptomycin und 0,5 ug / ml amphotercin B in eine feuchte Umgebung bei 37 ° C und 5% CO 2 kultiviert. </li><li> Zum Lösen der Zellen aus dem behandelten Kulturflasche Oberfläche absaugen des Mediums, waschen Sie die Zellen mit 37 ° C Calcium / Magnesium-freien HBSS absaugen HBSS, fügen Sie dann 2 ml 37 ° C Trypsin-EDTA-Lösung und damit die Zellen zu inkubieren für 3 Minuten. </li><li> Fest jar der Seite des Kolbens auf die Zellen frei zu klopfen, dann 8 ml 37 ° C mittlerer und kräftig Pipette die Zellsuspension nach oben und unten kümmert sich nicht um Blasen zu bringen. </li><li> Pipette die Zellen in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen und führen Sie eine Zellzahl mit einer Zählkammer oder andere Zellzählung Verfahren. </li><li> In Vorbereitung auf die Zellen mit dem Hersteller zu infizierenVirus, zunächst die Gesamtzahl der Zellen infiziert, und berechnen das Volumen der Virussuspension erforderlich, um die gewünschten Multiplizität der Infektion (MOI) (50 bis 100 infektiöse Partikel pro Zelle) zu erzielen. </li><li> Verdünnen Sie das Virus in HBSS durch vorsichtiges Pipettieren der richtigen Menge an Virus-Suspension in eine pre-aliquotiert Volumen von HBSS in einem 1,8 mL Mikrozentrifugenröhrchen. 50 ul HBSS pro Loch Aggregation Zellen geeignet ist. </li><li> Disperse die Zellen durch Pipettieren sie nach oben und unten in ihre Röhre, dann Pipette das notwendige Volumen bis 400.000 Zellen pro Vertiefung in die Vertiefungen einer 6-well Suspensionskultur Platte zu erreichen. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden Volumen der verdünnten Virus in jede Vertiefung, um die gewünschte MOI zu erzielen. </li><li> Add Medium in jede Vertiefung, um das Gesamtvolumen bis zu 1,7 mL zu bringen. </li><li> Legen Sie die Platte auf einem Schüttler im Inkubator. Setzen Sie den Shaker auf eine geringe Lautstärke, so dass das Medium sanft umspült den Vertiefungen (~ 100 rpm). Lassen Sie die Zellen, die Aggregationte für 24-36 Stunden. Aggregate mit einem ungefähren Durchmesser von 75-175 &amp;mgr; gebildet werden sollte. </li></ol> 3. Verkapselung von Zellen in PEGDM <ol><li> Zellen können als Dispersion (Schritt 2.4) oder nach Aggregation (Schritt 2.10) gekapselt werden. Da die Hydrogel-Vorläufer PEGDM Lösung ist ein flüssiges, können Zellen neigen dazu, vor der Vernetzung und Bildung von Hydrogelen zu begleichen. Wenn Abwicklung wird voraussichtlich schnell erfolgen, wie bei größeren Aggregaten, kann es vorteilhaft sein, das Hydrogel in zwei Schritten zu produzieren, so dass die Zellen auf einer mittleren Ebene des Gels zu begleichen. A one-step-Hydrogel-Synthese geeigneten Verfahren für die verteilte Zellen gezeigt (Abbildung 2) und die Zwei-Schritt-Verfahren wird ebenfalls gezeigt (Abbildung 3) und unten näher (3,2-3,9). </li><li> Erstellen Sie ein Gefäß, in dem das Hydrogel durch Aufschneiden der konischen Spitze aus einer 1 ml Kunststoff-Spritze und stellen Sie es open end up in einem Rack gebildet werden. </li><li> Pipettieren Sie 20 ul von photoaktiven PEGDM sosung in das offene Ende der Spritze auf den Kolben machen, dass die Lautstärke deckt die gesamte Kolbenfläche. Stellen Sie den Kolben in kleinen Schritten zu einer flachen Oberfläche der Flüssigkeit zu erreichen. </li><li> Platzieren Sie die Pipette in das Rack und die Position des Racks unter einer UV-Lampe (365nm, ~ 7 mW / cm 2) für ca. 8 Minuten bis zum Hydrogel Vernetzung ermöglichen. Während dieser Zeit kann die Herstellung der Zellen begonnen werden </li><li> Pipet ein Volumen mit der gewünschten Anzahl der Zellen / Aggregaten in eine 1,8 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Kappe und Zentrifuge das Rohr bei 130 g für 5 Minuten. </li><li> Mit einer Mikropipette, entfernen Sie vorsichtig den Medien, ohne die Zellpellet an der Spitze des Rohres. Da die Medien Kopf nähert sich dem Pellet, kann es hilfreich sein, um eine feinere verwenden, 10 ul Pipettenspitze. </li><li> Gently Zellpellet in 20 ul photoaktive PEGDM Lösung (mit einem weitmündigen Pipettenspitze, wenn die Arbeit mit Aggregaten) und fügen Sie die Zellsuspension auf die Spritze oben auf the zuvor Hydrogel Teil vernetzt. </li><li> Setzen Sie die Spritze, um weitere 8 Minuten UV-Licht zum Bau des Hydrogels abzuschließen. Wenn Sie fertig sind, sollten die Zellen vollständig innerhalb des zylindrischen Hydrogel (Abbildung 3) gekapselt werden. </li><li> Werfen Sie die Hydrogel aus der Spritze und in 1 ml HBSS in die Vertiefung einer 24-Well-Platte kurz waschen des Gels. Übertragen Sie die Gel auf 1 mL der Medien in der Vertiefung einer 24-Well-Platte und Kultur unter den gewünschten Bedingungen. </li></ol> 4. Hypoxie-Tracking <ol><li> Zu jedem Zeitpunkt während der Kultur-, Bild der Zellen mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie auf die Einleitung des hypoxischen Signalisierung zu verfolgen. Je nachdem, was wird abgebildet können Sie Bilder in der Multi-Well-Platte oder die Übertragung des Gels auf einen Objektträger vor der Platzierung auf dem Mikroskoptisch. Peak-Anregung von Ds Red ist bei 556nm erreicht und Peak-Emission erfolgt bei 586nm. Emission ist ziemlich intensiv und somit Bleichen nicht beobachtbare wordened problematisch zu sein. Lag der Zeit zwischen Beginn der Protein-Produktion und das erste Signal-Erkennung ist etwa 12 Stunden. Das Signal ist spezifisch genug, um individuelle Signalisierung Zellen zu identifizieren, aber die Auflösung nicht ausreichen können, für die Bestimmung intrazellulären Signal-Lokalisierung. In Signalisierung Zellen, wird das Signal in der Regel gleichmäßig über das Zytoplasma beobachtet. Die Signalintensität kann auch mit verlängerten Exposition gegenüber Hypoxie zu erhöhen, obwohl wir noch nicht vollständig bestimmt, wenn dies aufgrund der erhöhten Proteinexpression insgesamt Proteinakkumulation oder verzögert Proteinreifung. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Ein repräsentatives Beispiel für MIN6 Aggregaten in einer PEG-Hydrogel verkapselt ist in Abbildung 4 dargestellt. Das vernetzte Gel wird so fest, wobei die Form des Gefäßes, in dem die Reaktion durchgeführt wurde. Ein Gel mit glatten Außenflächen ist vorzuziehen zur Implantation in die Prävention eines Fremdkörpers re Hilfe fürResponse. Innerhalb des Gels sollte Zellaggregate vollständig in die Matrix eingeschlossen sein und homogen verteilt, um für eine bessere Nährstoff-Transport zu ermöglichen. Repräsentative Bilder hypoxischen Signalisierung in MIN6 Aggregate sind in Abbildung 5 dargestellt. Identische MIN6 Aggregate mit dem Marker-Virus infiziert wurden entweder in 20% O 2 (5a) oder 1% O 2 (5b) für 44 Stunden vor der Aufnahme von Bildern kultiviert. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Tätigkeit unserer Hypoxie-Marker-System. Adenovirale Einsetzen der Ds Red DR-Gen-und Upstream-HRE-Promotor ermöglicht Hypoxie-induzierte Produktion des fluoreszierenden Proteins unter der Kontrolle des HIF-1. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig2.jpg" /> Abbildung 2. Procedural Ablaufplan für die einstufige Verkapselung von zerstreuten MIN6 Zellen in einem crosslinked PEGDM Hydrogel. Für jedes Gel, sind die dispergierten Zellen in 40 ul der photoaktiven PEGDM Makromers suspendiert. Dies ist in einem abgeschlagenen 1ml Spritze gesetzt und das Hydrogel unter 365nm UV-Licht nach 10-12 Minuten gebildet. Nach der Fertigstellung wird das Hydrogel Festplatte aus der Spritze entfernt, gewaschen und in einem Medium gefüllten Well-Platte für die Inkubation. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig3.jpg" /> Abbildung 3. Procedural Flussdiagramm für die Dual-für-Schritt-Kapselung von aggregierten MIN6 Zellen in einer vernetzten PEGDM Hydrogel. Für jedes Gel, ist ein Halb-Gel zunächst durch UV-Vernetzung von 20 &amp;mgr; l der photoaktiven PEGDM Makromers Lösung für 8 Minuten gebildet. MIN6 Aggregate werden sorgfältig in einem zusätzlichen 20 &amp;mgr; l von photoaktiven Makromers Lösung, die auf der Oberseite des vorgeformten Halb-Gel zugesetzt wird unterbrochen. Die volle Gel wird durch eine zusätzliche 8 Minuten von UV-Exposition mit Aggregaten voll in der medialen gekapselt gebildetEbene des Gels. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig4.jpg" /> Abbildung 4. Das Bild eines 40 ul Hydrogel unter 20-facher Vergrößerung. MIN6 Aggregaten (~ 400.000 insgesamt Zellen) sind klar innerhalb des Gels zu sehen. Hydrogel Durchmesser beträgt ca. 6mm (bar = 1 mm). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3521/3521fig5.jpg" /> Abbildung 5. Fluorescent Hypoxie-Signalisierung in aggregierter MIN6 Zellen in einem PEGDM Hydrogel. Zellen, die gekapselt und wurden dann in den Brutschrank bei 20% O 2 für 44 Stunden nicht angezeigt Hypoxie-Signalisierung (a), während Zellen, die dann eingekapselt inkubiert in 2% O 2 für 44 Stunden Anzeige zu löschen, allgegenwärtige Signal. (Bar = 100 um) (b).

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier vorgestellte Methode bietet eine schnelle und einfache Methode zur Verkapselung von Zellen in einer PEG-Hydrogel mit minimalem Einsatz nicht-physiologischen Bedingungen. PEG ist ein sehr nützliches Verkapselungsmaterial für seine Biokompatibilität und einfache Modifikation. Einfache Variation der PEG Prozentsatz in die photoaktive Lösung, zum Beispiel, kann verwendet werden, um die mechanischen Eigenschaften, wie Druck-Modul, und Transport-Eigenschaften durch Porengröße eingestellt werden. Außerdem ist PEG einfach durch die Zugabe von Seitenketten modifiziert. PEG-Hydrogele, also stellen beide eine viel versprechende klinische Gerät und eine flexible Plattform für in-vitro-Forschung Eine Methode zur Verfolgung Hypoxie in PEG-verkapselten Zellen wurde ebenfalls vorgestellt. Diese Methode ist für die Einfachheit des Hypoxie-Erkennung und zur Vermeidung der Notwendigkeit, die Zellen von Interesse zu opfern nützlich. Die Technik kann auf eine Vielzahl von Zelltypen in einer Vielzahl von Bedingungen zu schaffen, ihre uns angewendet werdenefulness breit. Zum Beispiel kann eine Hypoxie als Stichwort für Stammzell-Differenzierung in der Stammzellforschung Micromass Kulturen verfolgt werden. Allerdings kann diese Methode nur angewandt, um Zellsysteme oder System, in dem Zellen später aggregiert verteilt dispergieren. Auch kann der Nachweis der Fluoreszenz-Signal werden in größeren oder dichteren Gewebe schwierig.

<table border="1"><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional </td></tr><tr><td> PEG </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 309028-500G </td><td></td></tr><tr><td> Methacrylsäureanhydrid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 276685-100ML </td><td></td></tr><tr><td> Mikrowelle </td><td> Emerson </td><td> MW8784SB </td><td></td></tr><tr><td> Vortexer </td><td> Scientific Industries </td><td> SI-A236 </td><td></td></tr><tr><td> Methylenchlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D65100-1L </td><td></td></tr><tr><td> Diethylether </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 346136-1L </td><td></td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Spektrum </td><td> 132640 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Laboratories </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Gefrierschrank </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td&gt; Lyophilisator </td><td> Labconco </td><td> 7670521 </td><td></td></tr><tr><td> Vakuumpumpe </td><td> Welch </td><td> 8917Z-01 </td><td></td></tr><tr><td> Irgacure 2959 </td><td> Ciba-Geigy </td><td> 029891301PS04 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Mediatech </td><td> 21 bis 022-CV </td><td></td></tr><tr><td> Spritzenvorsatzfilter </td><td> VWR </td><td> 28145-477 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> * </td><td> * Custom Formulierung </td></tr><tr><td> FBS </td><td> PAA Laboratories </td><td> A15-351 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 002-CI </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Mediatech </td><td> 30 bis 003-CF </td><td></td></tr><tr><td> Inkubator </td><td> Thermo Scientific </td><td> 3597 </td><td> Napco Serie 8000 WJ w / O2 Unterdrückung </td></tr><tr><td> Trypsin EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25 bis 052-CI </td><td></td></tr><tr><td> Orbital Shaker</td><td> VWR </td><td> 12620-926 </td><td></td></tr><tr><td> UV-Lampe </td><td> Sanyo Denri </td><td> FLR40SBLB / M </td><td> Nimmt zwei 40W, 365nm Schwarzlicht blau UV-Lampen </td></tr><tr><td> Zentrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5811 000.010 * </td><td> * Bestell-Nr. Modell 5810 R </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td> Nikon </td><td> TI-ND6-PFS </td><td> Mit Filtersatz für 556nm Anregung / 586nm-Emission </td></tr></table>

tracking hypoxic signaling within encapsulated cell aggregates

In Diabetes mellitus Typ 1, autoimmune Zerstörung der Bauchspeicheldrüse β-Zellen führt zu einem Verlust der Insulin-Produktion und potenziell tödlichen Hyperglykämie. Als alternative Behandlungsoption, um exogene Insulin-Injektion, hat die Transplantation von funktionell Pankreasgewebe wurde 1,2 erforscht. Dieser Ansatz bietet das Versprechen einer natürlicheren, langfristige Wiederherstellung der Normoglykämie. Schutz des Spenders Gewebe aus dem Immunsystem des Wirtes ist erforderlich, um zu verhindern Ablehnung und Kapselung ist eine Methode verwendet, um dieses Ziel zu erreichen. Biologisch gewonnene Materialien, wie Alginat 3 und Agarose 4, haben die traditionelle Wahl für Kapsel Bau gewesen, aber kann eine Entzündung oder fibrotische Überwucherung 5, die Nährstoff-und Sauerstofftransport behindert auslösen können. Alternativ sind auch synthetische Poly (ethylenglycol) (PEG)-basierte Hydrogele nicht erniedrigend, leicht funktionalisiert, in hoher Reinheit zur Verfügung,haben steuerbaren Porengröße, und sind äußerst biokompatibel, 6,7,8. Als zusätzlichen Vorteil können PEG-Hydrogele schnell in einem einfachen Foto-Vernetzungsreaktion, der keine Anwendung von nicht-physiologischen Temperaturen 6,7 gebildet werden. Ein solches Vorgehen ist hier beschrieben. In der Vernetzungsreaktion, UV-Degradation des Photoinitiators, 1 - [4 - (2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-Hydroxy-2-methyl-1-Propan-1-on (Irgacure 2959), produziert freie Radikale, die Attacke der Vinyl-Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen zu Di-PEG (PEGDM) induzieren Vernetzung an den Kettenenden. Die Vernetzung kann innerhalb von 10 Minuten erreicht werden. PEG-Hydrogele in einer solchen Art und Weise aufgebaut haben gezeigt, dass positiv Stützzellen 7,9, und die geringe Photoinitiatorkonzentration und kurze Exposition gegenüber UV-Bestrahlung wirkt sich nicht nachteilig auf die Lebensfähigkeit und Funktion der eingekapselten Gewebe 10. Während wir unsere Methacrylat-PEG mit dem unten beschriebenen Verfahren können PEGDM auch directly von Herstellern wie Sigma bezogen. Eine Konsequenz der Kapselung ist die Isolierung der Zellen aus einem Gefäßnetz. Zufuhr von Nährstoffen, vor allem Sauerstoff, wird somit reduziert und begrenzt durch Diffusion. Dies reduziert die Verfügbarkeit von Sauerstoff kann insbesondere Auswirkungen β-Zellen, deren Insulin-Sekretion ist stark abhängig von Sauerstoff 11-13. Capsule Zusammensetzung und Geometrie wird auch Auswirkungen Diffusionsraten und Längen für Sauerstoff. Deshalb beschreiben wir auch eine Technik zur Identifizierung von hypoxischen Zellen in unserem PEG-Kapseln. Die Infektion der Zellen mit einem rekombinanten Adenovirus kann für ein fluoreszierendes Signal erzeugt, wenn intrazelluläre Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) Wegen 14 sind aktiviert. Als HIFs die primäre Regulatoren der transkriptionellen Antwort auf Hypoxie sind, stellen sie ein ideales Ziel Marker für den Nachweis von Hypoxie-Signalisierung 15. Dieser Ansatz ermöglicht eine einfache und schnelle Erkennung von HYPOXIc-Zellen. Kurz gesagt, hat das Adenovirus die Sequenz für ein rot fluoreszierendes Protein (Ds Red DR von Clontech) unter der Kontrolle eines Hypoxie-responsive element (HRE) Trimer. Stabilisierung von HIF-1 durch niedrigen Sauerstoffgehalt fahren Transkription des fluoreszierenden Proteins (Abbildung 1). Weitere Einzelheiten über den Bau des Virus wurden bisher 15 veröffentlicht. Das Virus ist in 10% Glycerin bei -80 ° C so viele 150 ul Aliquots in 1,5 ml Röhrchen in einer Konzentration von 3,4 x 10 10 pfu / mL. Frühere Studien in unserem Labor haben gezeigt, dass MIN6 Zellen als Aggregate ihre Lebensfähigkeit zu erhalten über 4 Wochen der Kultur in 20% Sauerstoff gekapselt. MIN6 Aggregate bei 2 kultiviert oder 1% Sauerstoff zeigten beide Zeichen von nekrotischen Zellen (immer noch etwa 85-90% lebensfähig) durch Färbung mit Ethidiumbromid sowie morphologische Veränderungen in Bezug auf Zellen in 20% Sauerstoff. Die glatte Kugelgestalt der Aggregate bei 20% angezeigt wurde lost und Aggregate erschien eher wie unorganisiert Gruppen von Zellen. Während die niedrigen Sauerstoff-Stress nicht verursacht einen ausgeprägten Rückgang der Rentabilität, ist es eindeutig Auswirkungen auf MIN6 Aggregation und Funktion als durch Glukose-stimulierte Insulinsekretion 15 gemessen. Western-Blot-Analyse der eingekapselten Zellen in 20% und 1% Sauerstoff zeigten ebenfalls eine signifikante Erhöhung der HIF-1α für Zellen in den niedrigen Sauerstoffgehalt, die mit dem Ausdruck des DsRed DR-Protein korreliert kultiviert.

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Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

Ein Verfahren zur Foto-Verkapselung von Zellen in einer vernetzten PEG-Hydrogel beschrieben. Hypoxische Signalisierung innerhalb gekapselt murine Insulinom (MIN6) Aggregate verfolgt wird mit einem fluoreszierenden Marker-System. Dieses System ermöglicht serielle Untersuchung von Zellen in einem Hydrogel Gerüst und Korrelation von hypoxischen Signalisierung mit Veränderungen in der Zelle Phänotyp.

Tracking Hypoxische Signaling in Encapsulated Zellaggregate

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

tracking-hypoxic-signaling-within-encapsulated-cell-aggregates

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.6K Aufrufe.  University of South Carolina. Ein Verfahren zur Foto-Verkapselung von Zellen in einer vernetzten PEG-Hydrogel beschrieben. Hypoxische Signalisierung innerhalb gekapselt murine Insulinom (MIN6) Aggregate verfolgt wird mit einem fluoreszierenden Marker-System. Dieses System ermöglicht serielle Untersuchung von Zellen in einem Hydrogel Gerüst und Korrelation von hypoxischen Signalisierung mit Veränderungen in der Zelle Phänotyp.

Serie: Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Forschung

Biotechnik

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

Analyse der Zellmigration in eine dreidimensionale Kollagenmatrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluoreszenz-Abschrecken eines Liposomenverkapseltes NIR-Fluorophore als Instrument zur<em&gt; In-vivo-</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions are likely affected by the mechanical environment in which binding and signaling take place. A recent study demonstrated that mechanical force can regulate antigen recognition by and triggering of the T-cell receptor (TCR). This was made possible by a new technology we developed and termed fluorescence biomembrane force probe (fBFP), which combines single-molecule force spectroscopy with fluorescence microscopy. Using an ultra-soft human red blood cell as the sensitive force sensor, a high-speed camera and real-time imaging tracking techniques, the fBFP is of ~1 pN (10-12 N), ~3 nm and ~0.5 msec in force, spatial and temporal resolution. With the fBFP, one can precisely measure single receptor-ligand binding kinetics under force regulation and simultaneously image binding-triggered intracellular calcium signaling on a single live cell. This new technology can be used to study other membrane receptor-ligand interaction and signaling in other cells under mechanical regulation.

We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Transport Properties of Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogels: A Proton HR-MAS NMR Spectroscopy Study

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as cyclodextrin nanosponges (CDNSEDTA). Two different preparations are described with 1:4 and 1:8 CD-EDTA molar ratios. The corresponding cross-linked polymers were contacted with 0.27 M aqueous solution of ibuprofen sodium salt (IP) leading to homogeneous, colorless, drug loaded hydrogels.
The systems were characterized by high resolution magic angle spinning (HR-MAS) NMR spectroscopy. Pulsed field gradient spin echo (PGSE) NMR spectroscopy was used to determine the mean square displacement (MSD) of IP inside the polymeric gel at different observation times td. The data were further processed in order to study the time dependence of MSD: MSD = f(td). The proposed methodology is useful to characterize the different diffusion regimes that, in principle, the solute may experience inside the hydrogel, namely normal or anomalous diffusion. The full protocols including the polymer preparation and purification, the obtainment of drug-loaded hydrogels, the NMR sample preparation, the measurement of MSD by HR-MAS NMR spectroscopy and the final data processing to achieve the time dependence of MSD are here reported and discussed. The presented experiments represent a paradigmatic case and the data are discussed in terms of innovative approach to the characterization of the transport properties of an encapsulated guest within a polymeric host of potential application for drug delivery.

The motion regimes of ibuprofen encapsulated in &#946;-cyclodextrin nanosponges polymer network are investigated using pulsed-field-gradient spin-echo (PGSE) NMR technique. Synthesis, purification, drug loading, implementation of the NMR pulse sequence and data analysis to work out the mean square displacement of the drug at several observation times are described in detail.

Transporteigenschaften von Ibuprofen Encapsulated in Cyclodextrin Nanosponge Hydrogele: Ein Proton HR-MAS-NMR-Spektroskopie-Studie

The chemical cross-linking of &#946;-cyclodextrin (&#946;-CD) with ethylenediaminetetraacetic dianhydride (EDTA) led to branched polymers referred to as ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Gezielte Plasma Membrane Lieferung eines Hydrophobic Transport Encapsulated in einem Liquid Crystal Nanoparticle Träger

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Zusammenbau und Verfolgung der mikrobiellen Gemeinschaftsentwicklung innerhalb einer Microwell Array Plattform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Zellwanderung in dreidimensionales In Vitro Charakterisierung Wunde Umgebungen

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

Ein Protokoll für Echtzeit-3D Einzelkorn-Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...