La financiación de los NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520, y R01 EY020856 Investigación para Prevención de la Ceguera Premio al Desarrollo de Carrera, y Tri-Institucional Iniciativa de Células Madre. Línea celular HCLE proporcionados por cortesía de la Dra. Ilene Gipson. Los autores desean agradecer al Dr. Aihong Liu en Weill Cornell Medical College, por su asistencia técnica y orientación con el cultivo celular, Anthony Labissiere en el Hospital para Cirugías Especiales para su asistencia técnica con el SEM de imágenes, la Ingeniería de Tejidos del Centro de Recursos (TERC) en la Universidad de Tufts para el apoyo técnico con el desarrollo material, y el Centro de Cornell para la ciencia a nanoescala y el Fondo para la Tecnología (CNF) para obtener ayuda en la fabricación de obleas de silicio.

1. Fabricación de moldes de caucho de silicona <ol><li> Producir o adquirir una superficie topográfica deseada para la fundición. Para esta publicación un estándar de 100 mm de la oblea de silicio grabada se ha descrito (Figura 1). </li><li> Pesar polidimetilsiloxano (PDMS) encapsulamiento (componente A) y catalizador (componente B) solución en una relación 1:9 (9 g encapsulamiento y 1 g de catalizador) según lo dispuesto en el kit comprado. </li><li> Mezcle las soluciones de fondo para iniciar el proceso de curado. </li><li> Colocar oblea de silicio superficie dentro de un plato de colada. </li><li> Pesar 4,5 g de solución de PDMS sobre obleas de silicio. </li><li> Propagación PDMS solución como para cubrir un área de 100 mm de diámetro de la superficie de la oblea. </li><li> Incline la oblea para difundir solución de PDMS de manera uniforme. </li><li> Cubrir oblea con 100 mm de diámetro tapa placa de Petri. </li><li> Lugar de fundición de instalación en estufa a 60 º C durante la noche, asegurándose de que el curado se lleva a cabo sobre una superficie plana. </li><li> Colocar curado PDMS / obleas de silicio en 70% de etanolbaño antes de la eliminación. </li><li> Comienza la eliminación de PDMS de obleas mediante el uso de hoja de afeitar para levantar el borde (circunferencia) en primer lugar. </li><li> Tire suavemente de PDMS fuera de uso de fórceps en un baño de etanol al 70% teniendo cuidado de no romper la fundición de caucho de silicona. </li><li> Rompa los moldes individuales con PDMS 14 perforadora mm. Este diámetro está diseñado para encajar en una configuración de placa de 24 pocillos. </li></ol> 2. La producción de solución de seda <ol><li> Llevar 2 L de agua destilada (dH 2 O) a ebullición dentro de un vaso de vidrio 7. </li><li> Cortar 5 g de Bombyx mori capullos de seda en tres partes. </li><li> Elimine los capullos ampliamente contaminados por insectos, como se indica exceso de recubrimiento de las partículas en la superficie del capullo interior. </li><li> Medir 4,24 g de carbonato de sodio. </li><li> Añadir carbonato de sodio lentamente hasta ebullición dH 2 O volumen para evitar que se desborde de agua, y permitir la completa disolución antes de continuar. </li><li> Agregue los trozos de capullo hasta que hierva dH <sub&gt; 2 O durante 40 min., y usar una barra de teflón recubierto revuelo para agitar capullos durante el proceso de ebullición. </li><li> Después de hervir, escurrir con cuidado DH 2 O en el fregadero y el anillo de extracto de seda a mano para eliminar el exceso de agua. </li><li> Lavar seda extraer tres veces durante 20 min. cada uno en 1 L de H 2 O en un vaso de precipitados de laboratorio, y utilizar una barra de agitación para hacer circular el volumen dentro de vaso de precipitados. </li><li> Después de lavar, el anillo a cabo el extracto de seda a mano y el extracto de seda fibra lugar dentro de una campana química para permitir el secado de una hora 12. período. </li><li> Al día siguiente, pesan las fibras de seda secas, que es típicamente ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Preparar 9,3 solución LiBr M para un 20% w / v de seda. Utilizar siguientes ecuaciones para calcular el peso necesario y volúmenes: <ol class="lalpha"><li> (Peso de la Seda extracto de la etapa 10) x (4) = ___________ ml de solución total de 9,3 M LiBr </li><li> [(807.705) x (volumen de la parte LiBr 11.a)] / 1000 = ___________ g de LiBr para añadir a DH 2 O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Añadir peso medido LiBr en un vaso de vidrio de la siguiente volumen de DH 2 O: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (volumen calculado a partir del paso 11.a) = ___________ ml de H 2 S </li></ol></li><li> Verter esta solución en un tamaño adecuado cilindro graduado, y llevar solución hasta el volumen final, calculado en la parte 11.a. </li><li> Coloque el extracto de seda en el vaso y vierta la solución LiBr sobre las fibras de seda que hacen que las fibras de seda están inmersas en la solución LiBr con una espátula de laboratorio. </li><li> Colocar la seda disuelto en 60 ° horno C durante 4 horas: Hora de inicio: ___________ Hora de finalización: ___________ </li><li> Usando una jeringa de tamaño adecuado elaborar 12 ml de la solución de seda. Coloque una aguja 18G en el extremo de la jeringa, y luego inyectar la solución en un casette de diálisis (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Después de llenar la bandeja, sacar el aire que queda fuera de la cinta con la jeringa vacía. </li><li> Lugar ficasete de diálisis lled el plazo de 1 L de H 2 O. </li><li> Cambiar DH 2 de O después de 1 hora, 4 horas, de 8 horas y luego cada 12 horas 3 veces para un total de 6 cambios: <ol class="lalpha"><li> Inicio: ___________ </li><li> 1 hora: ___________ </li><li> 4 horas para situaciones: ___________ </li><li> 8 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> Final: ___________ </li></ol></li><li> Después de la diálisis, lentamente recoger la solución de la seda de cassettes con la jeringa. Coloque la solución en tubos de centrífuga de 10.000 g nominales. </li><li> Centrifugar la solución dos veces a 10.000 ga 4 ° C durante 20-minutos cada uno. Después de cada sobrenadante lugar centrifugación en un tubo nuevo. </li><li> Tienda thr solución de seda en 4 ° C refrigerador. </li><li> Pipeta 2 muestras de 0,5 ml de solución de seda en pequeños pesar la cápsula, y el lugar pesan los platos dentro de un horno a 60 ° C en seco durante 12 horas o hasta que se seque de seda de la solución. </li><li> Pesar la película restante de seda sólido a partir de both muestras para medir solución de seda por ciento en peso de concentración en volumen de proteína: <ol class="lalpha"><li> Peso de la combinación de 2 muestras de cine de seda: ___________ mg </li><li> (Peso de la 23.a) x (100) = seda ___________% </li></ol></li></ol> 3. Preparación de las películas de seda y de instalación de sistema de cultivo <ol><li> Prepare las superficies de PDMS de fundición de una limpieza con cinta adhesiva transparente para eliminar el polvo. </li><li> Limpieza PDMS sustratos por inmersión en el 70% de etanol y lavar tres veces con dH 2 O. </li><li> Colocar 14 mm moldes PDMS en el plato de soporte, que es típicamente una tapa 24 y placa. </li><li> Para producir una película de 50 micras de espesor, se extendió 70 μls de solución de seda 8% en moldes de PDMS utilizando una herramienta de propagación líquido que es típicamente un 1 ml jeringa con punta 2. </li><li> Permitir las películas de seda para secar cubierto en un banco corriente limpia una presión de flujo de aire de 150 Pa durante un período de 90 minutos o hasta que las películas están secos. </li><li> Una vez que las películas son un lugar seco todo el conjunto de películas, incluyendo PDMS medad, en una cámara de agua-recocido durante más de 4 horas para producir una película insoluble en agua. Esto es típicamente una cámara de vacío desecador con agua en el fondo de la cuenca tiró de un vacío kPa 25 15. </li><li> Quite las películas de seda de agua la cámara de recocido y coloque en una mesa de trabajo limpia. </li><li> Preparar un baño de EtOH 70% en un 35 mm placa de Petri, y sustratos lugar de control (es decir, vidrio o plástico) y anillos de acero inoxidable dentro de los pozos por lo menos durante 10 minutos para esterilizar. </li><li> Quite las películas de seda a partir de moldes de PDMS con fórceps, a sumergirse en EtOH al 70%, y muestra el lugar en placa de 24 pocillos prellenada con 1 ml de EtOH al 70% haciendo que el lado estampado quede hacia arriba para permitir la adhesión celular. </li><li> Después de colocar cada muestra de cine de seda en un lugar así correspondientes inoxidable pesos de acero del anillo (11,65 mm de diámetro interior, 15,45 mm de diámetro exterior y 1,18 mm de espesor) en la parte superior. </li><li> Deje que las muestras con anillos de incubar durante 10 minutos para mantener la esterilidad. </li><li> RemoVe EtOH y lavar cada muestra 3 veces con 1 ml de PBS. Que cada lavado reposar durante 5 min para permitir la difusión completa. </li><li> Retire PBS utilizando una pipeta de aspiración de vidrio, mientras se asegura de eliminar la mayoría de las burbujas por debajo de las muestras de cine de seda. </li><li> Preparar la línea celular para la siembra. Como un ejemplo, trypsinize humano corneal limbal-epitelial (HCLE) línea celular con 0,25% de tripsina y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para solución de 7-min. Desactivar el uso de la tripsina 01:01 volumen de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), los medios de comunicación de paso con FBS al 10% añadido. Centrifugar las células con tripsina HCLE, añadir 8 ml de queratinocitos medio libre de suero (K-SFM) al pellet de células, agitar suavemente para dispersar HCLEs, y generar el recuento de células. </li><li> Muestra de 500 l de la suspensión HCLE por pozo típicamente usando una de cada 10.000 células / cm 2 de la densidad. </li><li> Coloque las culturas dentro de la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 y ejecutar el protocolo que desee experimental. </li></ol> 4. Los resultados representativos &lt;clase p = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Figura 1. Flujograma que ilustra resumida proceso de 10 pasos de la producción de seda, el cine y la preparación del sistema de cultivo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figura 2. (A) 21-colorante matriz de topografías superficiales estampadas línea producidas sobre una oblea de silicio de 90 mm ​​de diámetro empleando técnicas estándar de grabado fotolitográficas y seco. (B) las películas originales de seda conservan características de la línea en paralelo con dibujos después de la fundición de moldeo en las superficies de PDMS. (C) Esquema mostrando el diseño tamaño de la característica elegida para facilitar la alineación celular. (D) Sección transversal de la película de seda que ilustra retenido superficie paralela alineada con dibujos. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías electrónicas de barrido de línea celular HCLE adherirse a (A) con patróny (B) las películas planas de seda en el día 2 en cultivo. Culturas HCLE siguen proliferando en la confluencia de (C) con dibujos y (D) las superficies planas el día 8 en la cultura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figura 4. (A, D, G) con dibujos y (B, E, H) películas planas de seda de cultivo las células HCLE comparativamente a (C, F, I) sustratos de vidrio de control en (AC) el día 1, (DF) el día 4, y (GI) el día 8 en la cultura. (J) contenido CyQuant ácido nucleico y (K) (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) datos de la actividad metabólica de ensayo que demuestran la viabilidad HCLE tanto en estampado y planas sustratos de película de seda cuando se compara con las superficies de control de vidrio en el tiempo (barras de escala = 100 micras). Video 1. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie de película de estampado de seda durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Video 2. Lapso de tiempo de contraste de fases de imágenes de células que migran HCLE sobre una superficie plana de control de TCP durante una hora 18. período de tiempo. Las células se sembraron a 10k/cm 2 densidad y se cultivaron durante 2 h. antes de la exploración. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

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No hay conflictos de interés declarado.

El uso de películas de seda regeneradas como un sustrato para el cultivo celular se ha ganado en popularidad en las últimas dos décadas debido a la amplia caracterización de las propiedades de los materiales de esta proteína y mayor comprensión de su utilidad biomaterial 3,8. El sistema de cultivo descrito aquí representa una novela en el sistema de ensayo in vitro para la evaluación de las interacciones de la superficie celular de la seda con dibujos de cine biomaterial sustratos 7. El sistema permite un análisis en profundidad de las interacciones celulares en el tiempo que puede ser fácilmente adoptados para alto rendimiento de recolección de datos. Esto es en gran medida permitido por las películas de seda poseen un número de propiedades sintonizables biomaterial que puede ser modificado para afectar directamente la función celular 8,9,12, incluyendo: control de la superficie de micro / nano topografía de la superficie 7; químicas diferentes de la superficie mediante la modificación covalente o adsorción de moléculas biológicamente activas 13; robusta mechpropiedades anical 15,16, control de material de hidrofilicidad / hidrofobicidad 16, la carga a granel de compuestos biológicos para la liberación de 4,8,17, y de disolución controlada / las tasas de degradación enzimática a través del control de la estructura secundaria (el contenido de la hoja beta) 11,18,19 . La transparencia de las películas de seda se consigue a través de las películas de recocido durante un período de tiempo en vacío en la presencia de vapor de agua 7,15. Este enfoque permite el procesamiento para la formación de la estructura β-lámina secundaria, fomentando la insolubilidad del material en agua al tiempo que permite difracción mínimo de luz 15. Esta transparencia de las películas es clave para permitir directa de imágenes en vivo de células que pueden ser empleados en virtud de una serie de modalidades de imagen (es decir, de gran campo y fluorescencia) con cualquier número de sistemas de microscopio 12,20. Además de imágenes de células vivas-, las películas de seda se puede quitar fácilmente de thsistema de correo para permitir que la cultura para la fijación y análisis adicionales. Así, la gran variedad de directos evaluaciones experimentales que se pueden realizar en este sistema son aplicables a una amplia variedad de fuentes de células / tejidos para muchos ámbitos técnicos 3,8,9,12,13,21. Los resultados de time-lapse de imágenes ilustran cómo en tiempo real los datos del cultivo puede ser recogida, y como ejemplo se utilizaron para ilustrar cómo la topografía de la superficie afecta a las interacciones celulares. Los resultados representativos demostrar cómo biomateriales de seda de película puede ser utilizada para soportar el crecimiento del cultivo HCLE, y son susceptibles de ser un número de proliferación celular estándar y ensayos metabólicos (Fig. 4). Además, los cultivos se fijaron y procesaron para la digitalización de imágenes de electrones u otros protocolos (Fig. 3). Sustratos de seda de la película se produce en el laboratorio con alta fidelidad, consistencia, y con un costo relativamente bajo (fig. 1). Esto permite reproducibilidaddad, tanto en la configuración del sistema cultural y los resultados experimentales. Se ha demostrado que el agua de recocido de procesamiento produce un material de seda película estable dentro de la cultura que ha definido tasas de degradación en espera de la concentración de las proteasas en solución 2,15,22. Como resultado, estos materiales pueden ser utilizados durante largos períodos de tiempo para el cultivo celular a largo plazo, o permanecer implantado durante meses o años, dependiendo de la ubicación fisiológica 8. Además, el trabajo reciente ha demostrado que tanto la estructura de la proteína y las propiedades del material de las películas de seda recocido de agua son consistentes de un lote a otro teniendo en cuenta los resultados del cultivo reproducibles como se muestra a través de diversos métodos de pruebas mecánicas y biofísicas 15,16. Además, la superficie del material ha demostrado una gran fidelidad entre los lotes de películas, como se indica por la SEM, la fuerza atómica micrscopy (AFM), y los estudios de cultivo celular {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} 7,23,24. Material de la estabilidaddad y la consistencia es un factor importante a la forma en la celda detectará el sustrato de cultivo a través de las vías mecanotransducción diferentes, y, finalmente, producir una respuesta celular deseada / no deseada 25,26. Normas Históricos para sustratos de cultivo, tales como plástico de cultivo de tejidos tratados o de vidrio, proporcionan sustratos adecuados para la fijación celular. Sin embargo, estos materiales no son modificables por utilidad adicional en vivo. Se puede prever que una película de seda biomaterial puede ser personalizado in vitro, y una vez que las expectativas de experimentación se han logrado de la película personalizado puede ser trasladada a un modelo in vivo. Tal diseño emparejamiento entre in vitro y la experimentación in vivo ofrece una gran ventaja para estos biomateriales de seda implantables más de otros sustratos que se utilizan rutinariamente in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del Material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Los capullos de seda </td><td> Tajima Shoji Co., LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS monómero y transversal enlazador- </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Carbonato de Sodio </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> De bromuro de litio </td><td> Sigma </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> 1 ml de jeringa </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> Arandela de acero inoxidable </td><td> Lavadora Superior </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24-pocillos </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

Películas de seda son prometedores basados ​​en proteínas biomateriales que pueden ser fabricados con alta fidelidad y rentabilidad en un entorno de laboratorio de investigación 1,2. Estos materiales son deseables debido a que poseen características dimensionales y material altamente controlables, son biocompatibles y promover la adhesión celular, se puede modificar a través de patrón topográfico o por modificación de la superficie, y puede ser utilizado como un depósito para las moléculas biológicamente activas para aplicaciones de suministro de fármacos relacionados 3-8. Además, las películas de seda son relativamente sencillos de diseño personalizado, se pueden diseñar para disolver en cuestión de minutos o se degradan con el año in vitro o in vivo, y se producen con la ventaja añadida de ser transparente en la naturaleza y por lo tanto muy adecuado para aplicaciones de imágenes 9 - 13. La metodología de sistema de cultivo que aquí se presenta representa un enfoque escalable para la evaluación rápida de la superficie de la película de células de sedainteracciones. De particular interés es el uso de películas superficiales de seda estampadas para estudiar las diferencias en la proliferación celular y las respuestas de las células para la alineación 12,14. Los cultivos con semillas fueron cultivadas en tanto micro-patrones y planos sustratos de película de seda, y luego evaluaron a través de contraste de fase time-lapse de imágenes, microscopía electrónica de barrido, y la evaluación bioquímica de la actividad metabólica y contenido de ácido nucleico. En resumen, la película de seda en el sistema de cultivo in vitro ofrece una configuración adaptable experimental adecuado para el estudio de las interacciones de la superficie celular en un sustrato biomaterial, que luego pueden ser optimizadas y luego traducido a modelos in vivo. Las observaciones con el sistema de cultivo que aquí se presenta, actualmente se utilizan para ayudar en aplicaciones que van desde las interacciones celulares básicos para el diseño de dispositivos médicos, y por lo tanto son relevantes para una amplia gama de campos de la biomedicina.

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Películas de seda son una nueva clase de biomateriales fácilmente personalizables para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. La película presentó seda sistema de cultivo es altamente adaptable a una variedad de<em&gt; In vitro</em&gt; Análisis. Este sistema representa una oferta de diseño de plataforma de biomateriales<em&gt; In vitro</em&gt; Optimización de la traducción directa al<em&gt; En vivo</em&gt; Modelos.

Cine Cultura de la Seda del sistema para In vitro Análisis y Diseño de Biomateriales

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

19.3K vistas.  Weill Cornell Medical College. Películas de seda son una nueva clase de biomateriales fácilmente personalizables para una amplia gama de aplicaciones biomédicas. La película presentó seda sistema de cultivo es altamente adaptable a una variedad de In vitro Análisis. Este sistema representa una oferta de diseño de plataforma de biomateriales In vitro Optimización de la traducción directa al En vivo Modelos.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Investigación

Bioingeniería

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Análisis sistemático de<em&gt; In Vitro</em&gt; Celda balanceo Utilizando un sistema de microfluidos placa de múltiples pocillos

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

El diseño de proteínas de seda-seda aleaciones para aplicaciones biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Órgano Cultura Modelo Murino del disco intervertebral

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Un modelo de embrión de pez cebra para In Vivo visualización y análisis Intravital de Biomaterial asociados Staphylococcus aureus infección

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system that can be easily implemented and adopted. The methodology is based on the configuration of specific types of sensors, machine-learning methods and procedures. The protocol is divided into four phases: (1) database creation (2) data analysis (3) system simplification and (4) evaluation. Using this methodology, we created a multimodal database for fall detection and human activity recognition, namely UP-Fall Detection. It comprises data samples from 17 subjects that perform 5 types of falls and 6 different simple activities, during 3 trials. All information was gathered using 5 wearable sensors (tri-axis accelerometer, gyroscope and light intensity), 1 electroencephalograph helmet, 6 infrared sensors as ambient sensors, and 2 cameras in lateral and front viewpoints. The proposed novel methodology adds some important stages to perform a deep analysis of the following design issues in order to simplify a fall detection system: a) select which sensors or combination of sensors are to be used in a simple fall detection system, b) determine the best placement of the sources of information, and c) select the most suitable machine learning classification method for fall and human activity detection and recognition. Even though some multimodal approaches reported in literature only focus on one or two of the above-mentioned issues, our methodology allows simultaneously solving these three design problems related to a human fall and activity detection and recognition system.

We present a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system. The goal is to build a system for accurate fall detection that can be easily implemented and adopted.

Diseño y análisis para la simplificación del sistema de detección de caídas

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Modelos avanzados de hígado 3D para pruebas de genotoxicidad in vitro tras la exposición a nanomateriales a largo plazo

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...