NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 및 실명 경력 개발 상을, 그리고 트라이 기관 줄기 세포 이니셔티브를 방지하기 위해 R01 EY020856 연구에서 자금. HCLE 세포주 박사 Ilene Gipson의 호의를 제공했습니다. 저자들은 세포 배양, SEM 이미징 사이트에서 조직 엔지니어링 리소스 센터 (TERC)와 그녀의 기술 지원을위한 특별 수술을위한 병원의 안토니 Labissiere로 그녀의 기술 지원과지도를 위해 웨일 코넬 의과 대학에서 박사 Aihong 리우에게 감사를 표합니다 기술 소재 개발을 지원하고, 실리콘 웨이퍼 제조에 도움 NanoScale 과학 기술 시설에 대한 코넬 센터 (CNF)의 Tufts 대학.

1. 실리콘 고무 금형 제작 <ol><li> 캐스팅에 대한 원하는 지형 표면을 제작하거나 구입할 수 있습니다. 본 출판물의 경우 표준 100mm 에칭처리된 실리콘 웨이퍼는 (그림 1) 설명됩니다. </li><li> polydimethylsiloxane (PDMS) potting (구성 요소)과 구입한 키트에 제공된 등 1시 9분 비율 (9g potting와 1g 촉매)의 촉매 (부품 B) 솔루션을 달다. </li><li> 경화 과정을 시작하기 위해 철저하게 솔루션을 섞는다. </li><li> 주조 요리 이내 플레이스 실리콘 웨이퍼 표면. </li><li> 실리콘 웨이퍼 위에 PDMS 용액은 4.5 g을 달다. </li><li> 확산 PDMS 용액 웨이퍼 표면의 100 밀리미터 직경의 영역을 커버하는 등. </li><li> 고르게 PDMS 솔루션을 확산하기 위해 웨이퍼를 기울이십시오. </li><li> 100mm 직경 페트리 접시의 뚜껑으로 웨이퍼를 커버. </li><li> 장소는 경화가 평평한 표면에 일어나는 것을 확신하고, 60 박 이상 ° C 오븐에 설치를 주조. </li><li> 장소는 70 % 에탄올로 PDMS / 실리콘 웨이퍼를 치료제거하기 전에 목욕. </li><li> 첫번째 에지 (전체 둘레)를 올려 면도날을 사용하여 웨이퍼에서 PDMS를 제거 시작합니다. </li><li> 부드럽게 실리콘 고무 주조 찢어하지 않도록주의되는 70 % 에탄올 욕조 안에 집게를 사용하여 해제 PDMS를 당겨. </li><li> 14mm의 구멍 펀치를 사용하여 개별 PDMS 금형 밖으로 펀치. 이것은 지름이 24-잘 플레이트 설치에 적합하도록 설계되었습니다. </li></ol> 2. 실크 솔루션 제작 <ol><li> 유리 비커 7 ~ 종기에 증류수 (DH 2 O) 2 패를 가져와. </li><li> 3 가지로 Bombyx 모리 누에 누에를 5 G를 자르고. </li><li> 과도한 곤충 입자 코팅 내부 누에고치 표면에 표시된대로 광범위하게 오염된 고치 밖으로 배출. </li><li> 나트륨 탄산염의 4.24 g을 측정합니다. </li><li> 물이 끓어을 방지하기 위해 DH 2 O 볼륨을 끓고에 느리게 나트륨 탄산을 추가하고, 계속하기 전에 완전한 해체를 허용합니다. </li><li> 끓는 DH로 누에고치 조각 추가 <sub&gt;을 2 40 분., 그리고 끓는 과정에서 고치로 휘몰아 테플론 코팅 볶음 막대를 사용을위한 O,. </li><li> 끓는 후 신중하게 과잉 수분을 제거하기 위해 손으로 실크 추출물 밖으로 싱크 및 링으로 DH 2 O 드레인. </li><li> 실크는 20 분 동안 세 번 추출 씻으십시오. 실험실 비이커에 DH 2 O 1 L 각, 그리고 비커 내에서 볼륨을 유포하는 볶음 막대를 사용합니다. </li><li> 화학 후드 내부에 손을과 장소 실크 섬유 추출물로 실크 추출물 밖, 반지를 세척 후 12 시간 동안 건조를 허용합니다. 기간. </li><li> 다음날, 일반적으로 ~ 3.5 g입니다 말린 실크 섬유, 무게 : ___________-G </li><li> 실크의 20 % W / V 솔루션을 위해 9.3 M의 LiBr 용액을 준비한다. 필요한 무게와 볼륨을 계산하는 다음과 같은 방정식을 활용 : <ol class="lalpha"><li> (10 단계에서 실크 추출물 무게) × (4) = 총 9.3 M LiBr 솔루션의 ___________-ML </li><li> [(807.705) x는 (일부 11.a에서 LiBr 볼륨)] / 1000 = LiBr의 ___________ g DH 2 O에 추가 </li></ol> &lt;/ 리&gt; <li> 다음 DH 2 O 볼륨의 유리 비커에 측정 LiBr 무게를 추가 : <ol class="lalpha"><li> (0.8) × (11.a 단계에서 계산된 부피) = ___________ DH의 ML 2 O </li></ol></li><li> 실린더 졸업 적절한 규모로이 솔루션을 붓고, 그리고 일부 11.a. 계산으로 최종 볼륨 솔루션을 기르다 </li><li> 비커에 실크 추출물을 넣은 실크 섬유 실험실 주걱을 사용하여 LiBr 용액 안에 포장되어 있는지 만드는 실크 섬유를 통해 LiBr 용액을 붓는다. </li><li> 60로 해산 실크를 놓고 ° 4 시간을위한 C 오븐 : 시작 시간 : ___________ 시간 종료 : ___________ </li><li> 적절한 크기의 주사기를 사용하여 실크 솔루션 12 ML을 그립니다. 주사기 끝에 18G 바늘을 놓고 다음 투석 casette (3,500 MW의 coutoff, 슬라이드-A-Lyzer, 써모 과학)에 솔루션을 주입. 카세트를 작성 후, 비어 주사기와 카세트의 여지없이 남아있는 공기를 그립니다. </li><li> 장소 좋DH 2 O. 1 패 이내 카이로 투석 카세트 </li><li> 1 시간, 4 시간, 8 시간 후 6 변화의 총 3 배 매 12 시간 후에 DH 2 O 볼륨을 변경 : <ol class="lalpha"><li> 시작 : ___________ </li><li> 1 시간 : ___________ </li><li> 4hr : ___________ </li><li> 8 시간 : ___________ </li><li> 12 시간 : ___________ </li><li> 12 시간 : ___________ </li><li> 12 시간 : ___________ </li><li> 끝 : ___________ </li></ol></li><li> 투석 후, 천천히 주사기와 카세트에서 실크 솔루션을 수집합니다. 1만그램 정격 원심 튜브에 플레이스 솔루션입니다. </li><li> 20 분 각각에 대해 4 ° C에서 1만그램에서 두 솔루션을 원심 분리기. 새로운 튜브에 각각의 원심 분리 플레이스 뜨는 후에. </li><li> 4 ° C의 냉장고에 저장 thr 실크 솔루션입니다. </li><li> 작은 무게 요리, 장소에 0.5 ML 실크 솔루션의 피펫이 샘플 안에 요리를 달다 60 ° 12 시간이나 실크 솔루션 마른까지 C 건조 오븐. </li><li> 봇으로부터 남은 고체 실크 필름을 달다H는 샘플 볼륨 단백질 농도에 실크 솔루션 %의 무게를 측정하기 : <ol class="lalpha"><li> ___________ MG : 결합된 두 실크 필름 샘플의 무게 </li><li> (23.a의 무게) × (100) = ___________ % 실크 </li></ol></li></ol> 3. 실크 영화 문화 시스템 설치의 준비 <ol><li> 먼지를 제거하려면 투명 테이프로 세척하여 PDMS 주조 표면을 준비합니다. </li><li> 클린 PDMS 70 % EtOH에 몸을 담글하여 기판과 DH 2 O.로 세 번 씻어 </li><li> 일반적으로 24도 플레이트 뚜껑입니다 홀더 플레이트, 고정 장소 14mm PDMS 금형합니다. </li><li> 50 μm의 두께의 필름을 생산하기 위해 일반적으로 1 ML 주사기 팁 2 액상 확산 도구를 사용하여 PDMS 금형에 8 % 실크 솔루션의 70 μls 뿌리 더군요. </li><li> 90 분 동안이나 필름까지 150 파의 공기 흐름의 압력을 실행 클린 벤치에 덮개가 마르도록 실크 필름을 허용은 말라있을 수가 있죠. </li><li> 일단 영화는 건조한 장소는 PDMS m를 포함하여 필름의 집합 전체가어린이, 물 불용성 필름을 생산하기&gt; 4 시간을위한 물 어닐링 챔버로. 이것은 일반적으로 25 kPa 진공 15 가져온 분지의 바닥에 물을 빈 건조기 챔버입니다. </li><li> 실크 필름 깨끗한 벤치를 향해 물 어닐링 챔버와 장소에서 제거합니다. </li><li> 멸균을 위해 최소 10 분 동안 우물 안에 70 %의 35mm 배양 접시 내에서 EtOH 욕조, 장소 제어 기판 (예 : 유리 또는 플라스틱 표면)과 스테인레스 스틸 고리를 준비합니다. </li><li> 집게를 사용하여 PDMS 금형에서 실크 필름을 제거, 70 % EtOH로 그들을 찍어, 그리고 확실 패턴 측면을 만들고 70 % EtOH 1 ML과 prefilled 24 잘 플레이트로 대신 샘플은 세포 접착을 허용하도록 직면하고있다. </li><li> 위에 해당 잘 곳에 스테인레스 스틸 링 가중치 (11.65 mm 내경, 15.45 mm 외경 및 1.18 밀리미터 두께)로 각 실크 필름 샘플을 배치 후에. </li><li> 고리가있는 샘플 불임을 보장하는 10 분 동안 품어하도록 허용합니다. </li><li> RemoEtOH이 있어요 그리고 PBS 1 ML과 3 배 각각의 샘플을 씻는다. 각 세차가 완료 보급을 할 수 있도록 5 분 동안 앉아 보자. </li><li> 실크 필름 샘플을 아래에 거품의 대부분을 제거해야하는 반면, aspirating 유리 피펫을 사용하여 PBS를 제거합니다. </li><li> 시딩 위해 세포주를 준비합니다. 예를 들어, 7 분 0.25 %의 트립신과 ethylenediaminetetraacetic 산성 (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션으로 인간 각막-limbal 상피 (HCLE) 세포 라인을 trypsinize. 트립신 10 % FBS와 Dulbecco의 수정된 독수리 중간 (DMEM) 통과 미디어의 1시 1분 볼륨을 사용하여 비활성화가 추가되었습니다. trypsinized HCLE 세포를 원심 분리기, 세포 펠렛에 keratinocyte-혈청 무료 미디어의 8-ML (K-SFM)을 추가 부드럽게 HCLEs을 분산하기 위해 활발히 논의하고, 셀 카운트를 생성합니다. </li><li> 물론 일반적으로 만 셀 / ㎝에게이 밀도를 사용하여 당 HCLE 정지 시료 500 μL. </li><li> 37 인큐베이터 내에서 플레이스 문화 ° C에서 5 % CO 2, 원하는 실험 프로토콜을 실행합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 &lt;P 클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> 비단 영화 제작과 문화 시스템 준비 요약을 보여주는 그림 1. 흐름 차트는 10 단계 프로세스. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> 그림 2. 표준 photolithographic 및 건식 에칭 기법을 채용 90 밀리미터 직경의 실리콘 웨이퍼에 따라 생산 패턴 라인 표면 topographies의 () 21 - 염료 배열입니다. (B) 실크 필름 PDMS 성형 표면에 주조 후 원래 평행선 패턴 기능을 유지합니다. (C) 도식 보여주는 기능 크기 디자인은 세포 정렬을 추진하기로. 유지 병렬 줄지어 패턴 표면을 보여주는 실크 필름 (D) 크로스 섹션. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> 그림 3. () 패턴을 지키는 HCLE 세포주의 전자 micrographs 스캐닝그리고 (b) 문화 일 2시 플랫 실크 필름. HCLE 문화는 문화 일 8 시까지 (C) 패턴 및 (D) 평평한 표면에 합류에 분아 따위에 의해 중식 것을 계속한다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> 그림 4. (A, D, G) 패턴 그리고 (교류) 제 1 일 (DF) 4 일에서 비교적에 (B, E, H) 평면 실크 영화 문화 HCLE 세포 (C, F, I) 유리 제어 기판, 문화 및 (GI) 하루 8. (J) CyQuant 핵산 컨텐츠 (K) (3 - 패턴과 평면 실크 필름 기판에서 모두 HCLE 생존을 보여주는 (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium 브로마이드 (MTT) 대사 활동 분석 데이터 시간의 경과에 유리 제어 표면 (스케일 바는 = 100 μm의)와 비교했을 때. 동영상 1. 18 시간 동안 패턴 실크 필름 표면 위에 이주 HCLE 세포의 저속 위상 대조 영상. 기간. 세포 10k/cm이 밀도에 놓는와 2 시간 동안 배양해되었습니다. 이미징 전에. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 비디오 2. 18 시간 동안 평면 TCP 제어 표면을 통해 이주 HCLE 세포의 저속 위상 대조 영상. 기간. 세포 10k/cm이 밀도에 놓는와 2 시간 동안 배양해되었다. 이미징 전에. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

세포 배양을위한 기판과 같은 재생 실크 필름의 사용은이 단백질의 재료 특성의 광범위한 특성으로 인해 지난 20 년 동안 인기를 얻고 있으며 biomaterial 유틸리티 3,8의 이해를 증가하고있다. 여기에 설명된 문화 제도는 꽃무늬 실크 필름 biomaterial 기판 7 세포 표면 상호 작용을 평가하기위한 체외 테스트 시스템의 소설을 나타냅니다. 시스템은 쉽게 높은 처리량 데이터 수집을 위해 채택 수 시간에 따른 세포의 상호 작용 심층 분석을 허용합니다. 공유 결합 수정이나 흡착을 통해 다양한 표면 화학, 표면 제어 마이크로 / 나노 표면 지형 7 : 실크 필름을 포함하여 직접적으로 세포 기능 8,9,12 영향을 수정할 수있는 조정할 수 biomaterial 속성의 번호를 가지고 있기 때문에 이것은 크게 활성화되어 강력한 mech, 생물학적으로 활성 분자 13anical 등록 15,16; 재료 친수성 / 소수성 16 제어, 릴리스 4,8,17에 대한 생물 학적 화합물의 대량 로딩 및 이차 구조의 제어를 통해 제어 해산 / 효소 저하 속도 (베타 시트 콘텐츠) 11,18,19 . 실크 필름의 투명성은 수증기 7,15의 앞에서 진공 하에서 일정 기간 동안 영화를 어닐링을 통해 이루어진다. 이러한 처리 방식은 빛의 15 최소한의 회절을 허용하면서 물에 소재의 불용성을 육성, β-시트 이차 구조의 형성을 허용합니다. 영화의 이러한 투명성은 현미경 시스템 12,20의 번호를 사용하여 이미징 modalities (즉, 넓은 필드와 형광)의 수를 아래 고용 수있는 직접 라이브 세포 이미징을 활성화의 열쇠입니다. 라이브 세포 이미징 외에도 실크 필름은 쉽게 번째에서 제거할 수 있습니다전자 문화 시스템은 추가적인 고정 및 분석을 허용합니다. 따라서이 시스템에서 수행할 수있는 직접적인 실험적 평가 넓은 다양한 많은 기술 분야 3,8,9,12,13,21 대한 세포 / 조직 소스의 다양한 적용됩니다. 시간 경과 영상 결과는 실시간 문화 데이터가 수집될 수 있고, 예제 표면 지형은 세포 상호 작용에 어떻게 영향을 미치는지를 설명하기 위해 이용 하였다대로 방법을 보여줍니다. 대표적인 결과는 비단 영화 biomaterials가 HCLE 문화의 성장을 지원하기 위해 활용할 수있는 방법을 보여줍니다 및 표준 세포 증식과 신진 대사 assays (그림 4)의 개수에 수정할 수있는 있습니다. 또한, 문화가 고정되며 전자 영상 또는 기타 프로토콜 (그림 3) 스캔을위한 처리. 실크 필름 기판은 높은 충성심, 일관성있는 실험실에서 생산하고, 상대적으로 저렴한 비용으로 (그림 1). 있습니다 이것은 reproduci 수문화 시스템 설정 및 실험 결과 모두에서 bility. 그것은 물 어닐링 처리 솔루션 2,15,22의 프로 테아제의 농도 보류 저하 속도를 정의했습니다 문화 내에서 안정적인 실크 필름 소재를 생산하는 입증되었습니다. 결과적으로 이러한 자료는 장기 세포 배양을위한 장시간 동안 사용할 수있다, 또는 생리 위치에 따라 8 개월 또는 수년 동안 심어 유지합니다. 또한, 최근 작품은 단백질 구조와 물 annealed 실크 필름의 재질 특성이 모두 일괄 처리에서 각종 기계 및 biophysical 테스트 방법 15,16 통해 그림과 같이 재현할 문화 결과에 대해 허용하는 배치에 일관성이있는 것으로 나타났습니다. 7,23,24 SEM, 원자 힘 micrscopy (AFM) 및 세포 배양 연구 {: 2008wr, Omenetto : 2008tc, 브레이 2011kq 로렌스}로 표시로서뿐만 아니라, 재료의 표면이 필름 일괄 처리간에 큰 정절을 보이지 않고있다. 자재 stability 및 일관성은 세포가 다양한 mechanotransduction 경로를 통해 문화 기판을 감지하고, 궁극적으로 바람직하지 / 원하는 세포 반응 25,26를 산출하는 방법에 중요한 요소이다. 이러한 조직 문화를 치료 플라스틱이나 유리와 같은 문화 기판에 대한 역사적인 기준은, 세포 부착을 위해 적절한 기판을 제공합니다. 그러나 이러한 자료는 생체내의 추가 유틸리티에 대해 수정할 수있는 수 없습니다. 그것은 비단 영화 biomaterial은 체외로 사용자 정의할 수있는, 그리고 한번 실험적인 기대가 맞춤형 필름을 직접 생체내 모델로 번역될 수 달성되었다고 상상하실 수 있습니다. 시험 관내 및 생체내 실험에서 간의 이러한 이점 디자인은 정기적으로 체외에서 사용되는 다른 기판 위에 같은 implantable 실크 biomaterials에게 큰 이점을 제공합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 자재 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 실크 누에를 </td><td> 다지마 쇼지 주식 회사. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS 단량체 및 가교제 </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> 나트륨 탄산염 </td><td> 시그마 </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> 리튬 브로마이드 </td><td> 시그마 </td><td> 213,225 </td></tr><tr><td> 슬라이드-A-Lyzer </td><td> 써모 과학 </td><td> 66,110 </td></tr><tr><td> 한 ML의 주사기 </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309,602 </td></tr><tr><td> 스테인레스 스틸 와셔 </td><td> 우수한 와셔 </td><td> 81,610 </td></tr><tr><td> 24 잘 플레이트 </td><td> VWR </td><td> 353,047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

실크 필름 연구 실험실 환경 1,2 내에서 높은 충실도 및 경제적으로 조작 할 수있는 단백질 기반 biomaterials을 약속하고 있습니다. 그들은 고도로 제어 치수 및 재료 특성을 가진 세포 접착력을 biocompatible하고 촉진하기 때문에 이러한 자료는 바람직한 있으며, 지형 patterning이나 화학적으로 표면을 변경하여 수정할 수 있으며, 약물 전달 관련 어플 리케이션을위한 생물 학적 활성 분자를위한 기지로 사용할 수 3-8. 또한, 실크 필름 분 이내에 용해 또는 시험 관내 또는 생체내에서 년간 저하될 수 있도록 설계 수 있으며, 사용자 정의 디자인 비교적 간단하며, 자연의 투명 및 이미징 어플 리케이션 9 그러므로 매우 적합한되는 추가 혜택과 함께 생산하고 있습니다 - 13. 여기에 제시된 문화 시스템 방법론 셀 실크 필름 표면의 신속한 평가를위한 확장 가능한 접근 방법을 나타냅니다상호 작용. 특히 관심이 정렬 12,14 대한 세포 증식과 세포의 반응의 차이를 공부하는 표면 패턴 실크 필름의 사용입니다. 씨앗을 품고 문화는 마이크로 패턴과 평면 실크 필름 기판 모두에서 배양해 후 시간 경과 위상 대조 영상, 전자 현미경을 검색하고, 신진 대사 활동과 핵산 내용의 생화 학적 평가를 통해 평가되었다. 요약에서 체외 배양 시스템의 실크 필름 그러면 생체내 모델에 최적화된 다음으로 번역될 수 biomaterial 기판의 셀 - 표면 상호 작용의 연구에 적합한 맞춤형 실험적인 설정을 제공합니다. 여기에 제시된 문화 시스템을 사용하여 관찰은 현재 기본적인 세포 상호 작용으로부터 의료 기기 디자인에 이르기까지 다양한 어플 리케이션에 투입하는 데 사용되고, 따라서 생명 의학 분야의 광범위한 관련성이있다.

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

실크 필름은 생물 의학 응용 프로그램의 배열에 대해 쉽게 사용자 지정 biomaterials의 소설 클래스입니다. 제시 실크 영화 문화 시스템의 다양한 고도의 적응<em&gt; 체외에서</em&gt; 분석합니다. 이 시스템은 biomaterial 디자인 플랫폼 제공을 나타냅니다<em&gt; 체외에서</em직접 번역하기 전에&gt; 최적화<em&gt; 생체내에서</em&gt; 모델.

위한 실크 영화 문화 시스템 체외에서 분석 및 Biomaterial 디자인

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

19.3K 조회수.  Weill Cornell Medical College. 실크 필름은 생물 의학 응용 프로그램의 배열에 대해 쉽게 사용자 지정 biomaterials의 소설 클래스입니다. 제시 실크 영화 문화 시스템의 다양한 고도의 적응 체외에서 분석합니다. 이 시스템은 biomaterial 디자인 플랫폼 제공을 나타냅니다 체외에서 최적화 생체내에서 모델.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

연구

생체공학

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3 차원 세포 배양을위한 자기보고 발판

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

의 체계적인 분석<em&gt; 체외</em멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용하여&gt; 셀 롤링

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

복원 된 인간의 각막 모양의 상피 (RHCE) 조직 모델을 사용하여 눈에 자극성 화학 물질의 위험 식별을위한 눈 자극 시험 (EIT)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Zebrafish 태아 모델 Vivo 시각화 및 Intravital 소재 분석 관련 된 황색 포도상구균 에 감염

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system that can be easily implemented and adopted. The methodology is based on the configuration of specific types of sensors, machine-learning methods and procedures. The protocol is divided into four phases: (1) database creation (2) data analysis (3) system simplification and (4) evaluation. Using this methodology, we created a multimodal database for fall detection and human activity recognition, namely UP-Fall Detection. It comprises data samples from 17 subjects that perform 5 types of falls and 6 different simple activities, during 3 trials. All information was gathered using 5 wearable sensors (tri-axis accelerometer, gyroscope and light intensity), 1 electroencephalograph helmet, 6 infrared sensors as ambient sensors, and 2 cameras in lateral and front viewpoints. The proposed novel methodology adds some important stages to perform a deep analysis of the following design issues in order to simplify a fall detection system: a) select which sensors or combination of sensors are to be used in a simple fall detection system, b) determine the best placement of the sources of information, and c) select the most suitable machine learning classification method for fall and human activity detection and recognition. Even though some multimodal approaches reported in literature only focus on one or two of the above-mentioned issues, our methodology allows simultaneously solving these three design problems related to a human fall and activity detection and recognition system.

We present a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system. The goal is to build a system for accurate fall detection that can be easily implemented and adopted.

낙하 감지 시스템 단순화를 위한 설계 및 해석

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

장기 나노 물질 노출 다음 체외 물질 독성 테스트를 위한 고급 3D 간 모델

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...