O financiamento do NIH K08EY015829, R21EY019561, R24EY015656, P41 EB002520 e R01 Pesquisa EY020856 para prevenir a cegueira Prêmio de Desenvolvimento de Carreira, e Tri-Institucional Iniciativa Stem Cell. Linha celular HCLE uma cortesia da Dr. Ilene Gipson. Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Liu Aihong do Weill Cornell Medical College por sua assistência e orientação técnica com cultura de células, Anthony Labissiere no Hospital de Cirurgias Especiais para a assistência técnica com imagens SEM, a Engenharia de Tecidos Resource Center (TERC) em Tufts University para suporte técnico com o desenvolvimento material, e do Centro Cornell de Nanociência e Tecnologia Facility (CNF) para a assistência na fabricação de wafer de silício.

1. Fabricação de moldes de borracha de silicone <ol><li> Produzir ou comprar uma superfície topográfica desejada para a fundição. Para esta publicação um padrão 100 milímetros bolacha de silício gravado será descrito (Figura 1). </li><li> Pesar polidimetilsiloxano (PDMS) envasamento (componente A) e catalisador de solução (componente B) numa proporção de 01:09 (9 g envasamento e 1 g de catalisador), como fornecido com o kit comprado. </li><li> Misture soluções completamente para iniciar o processo de cura. </li><li> O local de superfície bolacha de silício dentro de um prato de fundição. </li><li> Pesar 4,5 g de solução de PDMS para bolacha de silício. </li><li> Dispersão da solução PDMS forma a cobrir uma área de 100 mm de diâmetro da superfície da bolacha. </li><li> Incline bolacha para espalhar uniformemente solução PDMS. </li><li> Cubra bolacha com 100 mm de diâmetro tampa prato de petri. </li><li> Local de instalação de fundição em forno de 60 ° C durante a noite, fazendo certo que a cura está ocorrendo em uma superfície plana. </li><li> Lugar curado PDMS / silício bolacha em etanol a 70%banho antes da remoção. </li><li> Comece removendo PDMS de wafer usando lâmina de barbear para levantar borda (circunferência inteira) primeiro. </li><li> Puxe delicadamente PDMS fora de usar uma pinça dentro de um banho de etanol 70% tomando cuidado para não rasgar silicone fundição de borracha. </li><li> Punch Out moldes individuais de PDMS utilizando 14 furador mm. Este diâmetro é concebido para encaixar uma configuração placa de 24 cavidades. </li></ol> 2. Produção de solução de seda <ol><li> Traga 2 L de água destilada (dH2O) a uma fervura dentro de um copo de vidro de 7. </li><li> Corte 5 g de casulos de Bombyx mori-da-seda em terços. </li><li> Descarte de casulos amplamente contaminadas como indicado pela excessiva revestimento de partículas de insetos na superfície interior do casulo. </li><li> Medir 4,24 g de carbonato de sódio. </li><li> Adicionar carbonato de sódio lentamente até à ebulição dH 2 volume de O para evitar a ebulição ao longo de água, e permitir a dissolução completa antes de prosseguir. </li><li> Adicione os pedaços de casulo para dH ebulição <sub&gt; 2 O durante 40 min., e usar um Teflon barra de agitação revestida a agitar casulos durante o processo de ebulição. </li><li> Após a fervura, escorra cuidadosamente dH 2 O na pia e ressoar com o extrato de seda com as mãos para remover o excesso de água. </li><li> Lavar seda extrair três vezes durante 20 min. cada em 1 L de dH 2 O em um copo de laboratório, e usar uma barra de agitação para circular volume dentro copo. </li><li> Após lavagem, o anel de fora do extracto de seda com a mão e extracto lugar da fibra de seda dentro de uma capa química para permitir a secagem para um hr 12. período. </li><li> No dia seguinte, pesar as fibras de seda secos, que normalmente é ~ 3,5 g: ___________-g </li><li> Preparar solução de 9,3 M LiBr para uma solução a 20% w / v de seda. Utilize seguintes equações para calcular o peso necessário e volumes: <ol class="lalpha"><li> (Peso de seda extracto a partir do passo 10) x (4) = ___________ mL de solução total de 9,3 M LiBr </li><li> [(807,705) x (LiBr volume a partir da peça 11.a)] / 1000 = ___________ g de LiBr para adicionar à de dH2O </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Adicionar peso LiBr medido num copo de vidro da seguinte dH volume de O 2: <ol class="lalpha"><li> (0,8) x (volume calculado a partir do passo 11.a) = ___________ mL de dH2O </li></ol></li><li> Verter desta solução para um tamanho apropriado cilindro graduado, e trazer solução até ao volume final tal como calculado em parte 11.a. </li><li> Coloque o extrato de seda em copo e despeje solução LiBr sobre as fibras de seda certificando-se as fibras de seda estão imersos dentro de solução LiBr usando uma espátula de laboratório. </li><li> Coloque a seda dissolvido em 60 ° C forno durante 4 hr: Hora de início: ___________ Fim tempo: ___________ </li><li> Utilizando uma seringa de tamanho adequado elaborar 12 mL da solução de seda. Coloque uma agulha de 18G no final da seringa, e então injetar a solução em um cassete de diálise (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Após o enchimento da cassete, extrair o ar restante para fora da cassete com a seringa esvaziado. </li><li> Local ficassete de diálise preencheram dentro de 1 L de dH 2 O. </li><li> Alterar dH 2 volume de O após 1 h, 4 h, 8 h, e em seguida cada hr 12 3x para um total de 6 alterações: <ol class="lalpha"><li> Begin: ___________ </li><li> 1h: ___________ </li><li> 4h: ___________ </li><li> 8 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> 12 horas: ___________ </li><li> End: ___________ </li></ol></li><li> Após a diálise, lentamente recolher a solução de seda a partir de cassetes com seringa. Solução lugar em 10.000 g tubos de centrífuga de classificação. </li><li> Centrifugar a solução duas vezes a 10.000 g, a 4 ° C durante 20 min cada. Depois de cada sobrenadante da centrifugação lugar para um novo tubo. </li><li> Armazenar a Solução de seda thr em 4 ° C geladeira. </li><li> Pipetar 2 amostras de 0,5 ml em solução de seda prato pesar pequeno, eo local pesar pratos dentro de um forno de 60 ° C seco durante 12 horas ou até a secagem da solução de seda. </li><li> Pesar o filme de seda restante sólido a partir de botamostras h para medir seda por cento em peso de solução de concentração de proteína volume: <ol class="lalpha"><li> Peso da combinadas 2 amostras de seda filmes: ___________ mg </li><li> (Peso da 23.a) x (100) de seda = ___________% </li></ol></li></ol> 3. Preparação de filmes de seda e Configuração do Sistema Cultura <ol><li> Preparar as superfícies de fundição de PDMS com a limpeza com fita adesiva transparente para remover a poeira. </li><li> Limpeza PDMS substratos por imersão em EtOH a 70% e lavar três vezes com dH2O </li><li> O local de 14 mm de PDMS moldes na placa de suporte, que é tipicamente uma tampa placa de 24 poços. </li><li> Para produzir uma película 50 mm de espessura, espalhar 70 μls de solução de seda 8%, em moldes de PDMS, utilizando uma ferramenta de líquido derramado que é tipicamente um seringa de 1 mL ponta 2. </li><li> Permitir que as películas de seda para secar a descoberto em um banco limpo executando uma pressão de fluxo de ar de 150 Pa durante um período de 90 min ou até que os filmes são seco. </li><li> Uma vez que os filmes são lugar seco conjunto de filmes inteiro, incluindo PDMS midade, para uma câmara de água-recozimento durante mais de 4 horas para produzir um filme insolúvel em água. Isto é tipicamente de uma câmara de exsicador vazio com água no fundo da bacia puxado a um vácuo 25 15 kPa. </li><li> Remover filmes de seda de água-de recozimento de câmara e lugar para uma bancada limpa. </li><li> Preparar um banho de EtOH a 70% dentro de uma placa de Petri de 35 mm, e substratos local de controlo (isto é, vidro ou superfícies plásticas) e anéis de aço inoxidável dentro dos poços durante pelo menos 10 min para esterilizar. </li><li> Remover filmes a partir de moldes de seda de PDMS, utilizando fórceps, mergulhar-los em EtOH 70%, e em lugar de amostra de 24 poços da placa pré-preenchido com 1 mL de EtOH 70%, tornando lado modelado certeza está virada para cima para permitir a adesão celular. </li><li> Após a colocação de cada amostra de película de seda em alguns correspondentes bem lugar pesos de aço inoxidável de anel (11,65 mm de diâmetro interior, 15,45 mm de diâmetro exterior, e 1,18 mm de espessura) no topo. </li><li> Permitir que as amostras com anéis a incubar durante 10 minutos para assegurar a esterilidade. </li><li> Remove EtOH e lavar 3x com cada amostra de 1 mL de PBS. Deixe cada lavagem sentar-se por 5 min para permitir a difusão completa. </li><li> Remover PBS usando pipeta de vidro de aspiração, assegurando ao mesmo tempo para remover maioria de bolhas sob amostras de filmes de seda. </li><li> Prepare linha de células para a semeadura. Como um exemplo, trypsinize humano córneo-limbo linha celular epitelial (HCLE) com tripsina a 0,25% e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de solução para 7 min. Desactivar tripsina utilizando 1:1 de volume de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) meios de comunicação de passagem com FBS 10%, adicionada. Centrifugar tripsinizadas células HCLE, adicionar 8 mL de queratinócitos de soro meios de comunicação livres (K-SFM) de pellet celular, agitar suavemente para dispersar HCLEs, e gerar contagem de células. </li><li> UL de amostra 500 da suspensão HCLE por poço usando tipicamente um 10.000 células / cm 2 de densidade. </li><li> Culturas lugar dentro da incubadora, a 37 ° C e 5% de CO 2 e executar desejado protocolo experimental. </li></ol> 4. Os resultados representativos &lt;classe p = &quot;jove_content&quot;&gt; <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig1.jpg" /> Figura Fluxograma 1. Ilustrando resumida processo de 10 etapas da produção de seda filme e preparação do sistema de cultura. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig2.jpg" /> Figura 2. (A) de matriz 21-corante de topografias de linha estampados superfície produzida sobre uma bolacha de silício 90 mm ​​de diâmetro empregando técnicas padrão de condicionamento de fotolitografia e seco. (B), os filmes de seda manter características originais da linha paralelas estampados, após a fundição em superfícies de moldagem de PDMS. (C) desenho esquemático tamanho demonstrando recurso escolhido para promover o alinhamento celular. (D) Seção transversal de filme de seda ilustrando retido superfície e paralelo alinhado padronizado. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig3.jpg" /> Figura 3. Scanning micrografias electrónicas de linha de células HCLE aderindo a (A) modeladoe (B), os filmes de seda planas em dia 2 de cultura. Culturas HCLE continuam a proliferar até à confluência em (C) modelado e (D) por superfícies planas dia 8 em cultura. <img alt="A Figura 4" src="/files/ftp_upload/3646/3646fig4.jpg" /> Figura 4. (A, D, G) e modelado (B, E, H) filmes de seda planas cultura HCLE células comparativamente a (C, F, I) substratos de controlo de vidro em (AC) dias 1, (DF) dias 4, e 8 dias (GI) em cultura. (J) do teor de ácido nucleico CyQuant e (K) (3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) os dados da actividade metabólica de ensaio que demonstram a viabilidade HCLE em ambos modelado e substratos de película plana de seda quando comparado com as superfícies de vidro de controlo ao longo do tempo (barras de escala = 100 mm). Vídeo 1. Lapso de tempo imagens de contraste de fase de células que migram HCLE sobre uma superfície de filme de seda estampados durante uma hora 18. período de tempo. As células foram semeadas a 10k/cm densidade 2 e cultivadas durante 2 horas. antes de imagem. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie1.MOV" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> . Video 2. Lapso de tempo imagens de contraste de fase de células que migram HCLE sobre uma superfície plana de controle TCP durante uma hora 18. período de tempo. As células foram semeadas a 10k/cm densidade 2 e cultivadas durante 2 horas. antes de imagem. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3646/3646movie2.MOV" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

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E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+gone+awry.">Mechanotransduction gone awry.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 63-73 (2009).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A utilização de películas de seda regeneradas como um substrato para a cultura de células ganhou em popularidade ao longo das duas últimas décadas, devido à extensa caracterização das propriedades do material desta proteína e aumento da compreensão da sua utilidade biomaterial 3,8. O sistema de cultura descrito aqui representa um novo sistema de testes in vitro para avaliar as interações de superfície celular em seda estampados filme biomaterial substratos 7. O sistema permite a análise em profundidade das interações celulares ao longo do tempo que podem ser facilmente adotados para alto rendimento de coleta de dados. Isto é largamente activado porque os filmes de seda possuir um número de propriedades sintonizáveis ​​biomaterial que pode ser modificada para afectar directamente a função da célula 8,9,12, incluindo: controlo de superfície micro / nano-topografia de superfície 7; químicas de superfície diferentes através da modificação covalente ou adsorção de moléculas biologicamente ativas 13; mech robustapropriedades anical 15,16, controle da hidrofilicidade material / hidrofobicidade 16; carregamento em massa de compostos biológicos para a liberação 4,8,17, e de dissolução controlada / taxas de degradação enzimática através do controle da estrutura secundária (conteúdo folha beta) 11,18,19 . A transparência de filmes de seda é conseguido através de recozimento dos filmes por um período de tempo sob vácuo na presença de vapor de água 7,15. Esta abordagem permite o processamento para a formação de folhas β estrutura secundária, promovendo a insolubilidade do material em água, permitindo simultaneamente difracção mínima de luz 15. Essa transparência de filmes é fundamental para permitir que imagens ao vivo direto de célula que pode ser contratado com um número de modalidades de imagem (ou seja, de campo amplo e fluorescência) usando qualquer número de sistemas de microscópio 12,20. Além vivo de células de imagem, os filmes de seda pode ser facilmente removido do thsistema de cultura e para permitir a fixação adicional e análise. Assim, a grande variedade de directos avaliações experimentais que podem ser realizados neste sistema são aplicáveis ​​a uma grande variedade de células / tecido fontes para muitos campos técnicos 3,8,9,12,13,21. Os resultados lapso de tempo de imagens ilustram como os dados em tempo real de cultura podem ser recolhidos, e como exemplo, foram utilizadas para ilustrar como topografia da superfície afeta as interações celulares. Os resultados representativos demonstram como biomateriais filme de seda podem ser utilizadas para suportar o crescimento da cultura HCLE, e são alteráveis ​​a um número de proliferação celular padrão e ensaios de metabólicas (Fig. 4). Além disso, as culturas são fixadas e processadas para digitalização de imagens de electrões ou outros protocolos (Fig. 3). Substratos filme de seda são produzidas no laboratório com alta fidelidade, a consistência, e com um custo relativamente baixo (Fig. 1). Isto permite reprodutibilidadedade, tanto na configuração do sistema de cultura e os resultados experimentais. Tem sido demonstrado que a água-anneal processamento produz um material de película estável dentro da cultura de seda que tem definido taxas de degradação enquanto se aguarda a concentração de proteases em solução 2,15,22. Como resultado, estes materiais podem ser usados ​​durante períodos de tempo prolongados para a longo prazo de cultura de células, ou permanecer implantado por meses ou anos, dependendo da localização fisiológica 8. Além disso, trabalhos recentes demonstraram que tanto a estrutura da proteína e as propriedades do material de filmes água-recozido de seda são consistentes de lote para lote permitindo resultados da cultura reprodutíveis como mostrado através de vários métodos de ensaio mecânicas e biofísica 15,16. Além disso, a superfície do material mostrou grande fidelidade entre lotes de película, tal como indicado por SEM, de força atómica micrscopy (AFM), e os estudos de cultura de células {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 7,23,24} 2011kq. Stabil materialdade e consistência é um fator importante a forma como a célula irá sentir o substrato de cultivo através das vias mecanotransdução vários, e, finalmente, produzir uma resposta desejada / não desejada celular 25,26. Normas históricos para substratos de cultura, tais como o plástico de cultura de tecidos tratados ou de vidro, proporcionar substratos adequados para ligação celular. No entanto, estes materiais não são alteráveis ​​para a utilidade adicional in vivo. Pode ser previsto que um filme de seda biomaterial pode ser personalizado in vitro, e uma vez expectativas experimentais foram realizados a película personalizado pode ser directamente convertido para um modelo in vivo. Desenho emparelhado tais entre in vitro e in vivo experimentação oferece uma grande vantagem para tais biomateriais de seda implantáveis ​​mais de outros substratos que são rotineiramente usados ​​in vitro.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> Casulos de seda </td><td> Tajima Shoji Co., LTD. </td><td> NA </td></tr><tr><td> PDMS e monômero de reticulação </td><td> Momentive </td><td> RTV615A 01P </td></tr><tr><td> Carbonato de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S2127 </td></tr><tr><td> Brometo de lítio </td><td> Sigma </td><td> 213225 </td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66110 </td></tr><tr><td> Seringa de 1 mL </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 309602 </td></tr><tr><td> Arruela de aço inoxidável </td><td> Arruela Superior </td><td> 81610 </td></tr><tr><td> 24-bem placa </td><td> VWR </td><td> 353047 </td></tr></tbody></table>

silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design

Películas de seda são promissores proteína à base de biomateriais que podem ser fabricadas com alta fidelidade e economicamente dentro de um ambiente de investigação 1,2 laboratório. Estes materiais são desejáveis ​​porque possuem altamente controlável características dimensionais e material, são biocompatíveis e promover a adesão celular, pode ser modificado através de padronização topográfica ou pela alteração química de superfície, e pode ser usado como um depósito para as moléculas biologicamente activas para aplicações de entrega de drogas relacionados 3-8. Além disso, as películas de seda são relativamente simples de design personalizado, pode ser concebido para dissolver dentro de minutos ou degradar ao longo do ano, in vitro ou in vivo, e são produzir com o benefício adicional de ser transparente na natureza e, portanto, altamente adequado para aplicações de imagiologia 9 - 13. A metodologia de sistema de cultura aqui apresentada representa uma abordagem escalável para avaliações rápidas de células-seda superfície do filmeinterações. De particular interesse é a utilização de películas de superfície de seda estampados para estudar as diferenças na proliferação celular e respostas das células para o alinhamento 12,14. As culturas semeadas foram cultivadas em dois micro-padronizado e substratos filme plano de seda, e, em seguida, avaliados através de lapso de tempo de imagens de contraste de fase, microscopia eletrônica de varredura e avaliação bioquímica da atividade metabólica e teor de ácido nucléico. Em resumo, o filme de seda sistema in vitro de cultura oferece uma configuração customizável experimental adequado para o estudo da superfície celular interacções sobre um substrato biomaterial, que podem então ser optimizadas e, em seguida, traduzido a modelos in vivo. Observações utilizando o sistema de cultura aqui apresentados estão actualmente a ser utilizada para auxiliar em aplicações que variam de interacções de células básicas para concepção de dispositivos médicos, e, portanto, são relevantes para uma ampla gama de campos biomédicas.

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Filmes de seda são uma nova classe de biomateriais facilmente personalizáveis ​​para uma vasta gama de aplicações biomédicas. O sistema de cultura de seda apresentado filme é altamente adaptável a uma variedade de<em&gt; In vitro</em&gt; Análises. Este sistema representa uma oferta de plataforma biomaterial projeto<em&gt; In vitro</em&gt; Otimização antes de tradução direta para<em&gt; In vivo</em&gt; Modelos.

Silk Sistema de Cultura de Cinema para In vitro Análise e Desenho Biomaterial

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

19.3K visualizações.  Weill Cornell Medical College. Filmes de seda são uma nova classe de biomateriais facilmente personalizáveis ​​para uma vasta gama de aplicações biomédicas. O sistema de cultura de seda apresentado filme é altamente adaptável a uma variedade de In vitro Análises. Este sistema representa uma oferta de plataforma biomaterial projeto In vitro Otimização antes de tradução direta para In vivo Modelos.

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A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Um método para Encapsulation ovário folículo e Cultura em um proteoliticamente Degradáveis ​​3 Sistema Dimensional

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Bioengenharia

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Andaimes auto-relato para cultura de células 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

Análise sistemática de<em&gt; In Vitro</em&gt; Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

Projetando proteína de seda-seda liga Materiais para aplicações biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

A cultura in vitro modelo celular para Toxic Chemical Testing Inhaled

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritação dos olhos Test (EIT) para identificação de perigos de olho irritantes químicos usando reconstruída Humano Córnea-like epitelial (RHCE) Modelo Tissue

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Robótico líquido manipulação montagem de dispositivos modulares DNA automática

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

A<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Cultura Órgão da Murino Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major pathogens in BAI. Current experimental BAI mammalian animal models such as mouse models are costly and time-consuming, and therefore not suitable for high throughput analysis. Thus, novel animal models as complementary systems for investigating BAI in vivo are desired. In the present study, we aimed to develop a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of bacterial infection in the presence of biomaterials based on fluorescence microscopy. In addition, the provoked macrophage response was studied. To this end, we used fluorescent protein-expressing S. aureus and transgenic zebrafish embryos expressing fluorescent proteins in their macrophages and developed a procedure to inject bacteria alone or together with microspheres into the muscle tissue of embryos. To monitor bacterial infection progression in live embryos over time, we devised a simple but reliable method of microscopic scoring of fluorescent bacteria. The results from microscopic scoring showed that all embryos with more than 20 colony-forming units (CFU) of bacteria yielded a positive fluorescent signal of bacteria. To study the potential effects of biomaterials on infection, we determined the CFU numbers of S. aureus with and without 10 &#181;m polystyrene microspheres (PS10) as model biomaterials in the embryos. Moreover, we used the ObjectJ project file &#34;Zebrafish-Immunotest&#34; operating in ImageJ to quantify the fluorescence intensity of S. aureus infection with and without PS10 over time. Results from both methods showed higher numbers of S. aureus in infected embryos with microspheres than in embryos without microspheres, indicating an increased infection susceptibility in the presence of the biomaterial. Thus, the present study shows the potential of the zebrafish embryo model to study BAI with the methods developed here.

A Zebrafish Embryo Model for In Vivo Visualization and Intravital Analysis of Biomaterial-associated Staphylococcus aureus Infection

The present study describes a zebrafish embryo model for in vivo visualization and intravital analysis of biomaterial-associated infection over time based on fluorescence microscopy. This model is a promising system complementing mammalian animal models such as mouse models for studying biomaterial-associated infections in vivo.

Um modelo de embrião de Zebrafish para na visualização de Vivo e Intravital análise de biomateriais-associado Staphylococcus aureus infecção

Biomaterial-associated infection (BAI) is a major cause of the failure of biomaterials/medical devices. Staphylococcus aureus is one of the major ...

Design and Analysis for Fall Detection System Simplification

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system that can be easily implemented and adopted. The methodology is based on the configuration of specific types of sensors, machine-learning methods and procedures. The protocol is divided into four phases: (1) database creation (2) data analysis (3) system simplification and (4) evaluation. Using this methodology, we created a multimodal database for fall detection and human activity recognition, namely UP-Fall Detection. It comprises data samples from 17 subjects that perform 5 types of falls and 6 different simple activities, during 3 trials. All information was gathered using 5 wearable sensors (tri-axis accelerometer, gyroscope and light intensity), 1 electroencephalograph helmet, 6 infrared sensors as ambient sensors, and 2 cameras in lateral and front viewpoints. The proposed novel methodology adds some important stages to perform a deep analysis of the following design issues in order to simplify a fall detection system: a) select which sensors or combination of sensors are to be used in a simple fall detection system, b) determine the best placement of the sources of information, and c) select the most suitable machine learning classification method for fall and human activity detection and recognition. Even though some multimodal approaches reported in literature only focus on one or two of the above-mentioned issues, our methodology allows simultaneously solving these three design problems related to a human fall and activity detection and recognition system.

We present a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition system. The goal is to build a system for accurate fall detection that can be easily implemented and adopted.

Design e Análise para Simplificação do Sistema de Detecção de Queda

This paper presents a methodology based on multimodal sensors to configure a simple, comfortable and fast fall detection and human activity recognition ...