المعاهد الوطنية للصحة، NHLBI (RD، PY، PS). جمعية القلب الأميركية (JL). جامعة ستانفورد، VPUE غرانت (JL).

مقتبس من الدراسة قبل 1. 1. اقتران الخامس Annexin إلى SPIO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أكسدة جزيئات SPIO (المحيط تكنولوجيا النانو وشركة، 5 ملغ / مل) لمدة 1 ساعة على 20 درجة مئوية في الظلام في حل مع 0.15 بريودات الصوديوم M (NaIO 4) (4:01 الوزن: نسبة الوزن) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان SPIO أكسدة لمدة 12 ساعة مع تنقيته ANX البروتين (نسبة 1:1، الوزن: الوزن) في 0.15 متر بورات الصوديوم (نا 2 B 4 O 7 10H 2 O) في 20 درجة مئوية </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحد من خليط أخرى ل1 ساعة مع بوروهيدريد الصوديوم (NABH 4) تحت غطاء محرك السيارة والدخان ثم سقى مع 0.15 متر تريس، حمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل ANX خالية من ANX-SPIO بواسطة الطرد المركزي في 14000 XG (75 ميكرون المسام Microcon مرشح، ميليبور، فالجهاز يبث اشعة تماثل، MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيد من التنقيح للمجمع عن طريق إزالة الشوائب غير منضم باستخدام جهاز الفاصل المغناطيسي (المحيط تكنولوجيا النانو، وشركة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس retentate فلتر (ANX-SPIO) مستويات البروتينبواسطة فحص بروتين برادفورد ومخزن في -80 درجة مئوية في 2 ملغ / مل في 0.1 م تريس، حمض الهيدروكلوريك مع مثبطات المصل بنسبة 1٪ والزلال البروتيني (وقف مثبط للبروتياز، الحرارية العلمية، 1-50 ملغ / ANX ملغ). </li></ol> 2. ديناميكية تشتت الضوء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع بشكل منفصل SPIO وANX SPIO في برنامج تلفزيوني لكثافة بصرية من 0.1 وتحليل من قبل تناثر ضوء دينامية في جهاز Zetasizer DLS نانو (مالفيرن شركة، ورسيستيرشاير، المملكة المتحدة) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على قمم monomodal (المثالية) للمجمع، مع حجم الجسيمات Z-المتوسط، ومؤشر التشتت المتعدد (PDI). قارن هذا الحجم إلى حجم DLS قياسها من جسيمات متناهية الصغر أكسيد الحديد وحدها. وأظهرت النتائج SPIO ANX-DLS 1 الهيدروديناميكية الجسيمات القطر المتقارن من 78 نانومتر مع PDI 0.13 1، وهو ما يعكس متجانسة ANX-SPIO الأنواع 3. </li></ol> 3. الثقافة الخلية، الحث على موت الخلايا المبرمج في الثقافة، والتصوير بالرنين المغناطيسي من الخلايا المستزرعة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة عظم فأر بالغ نخاع الوسيطة قتستكمل الخلايا تيم (mMSCs) في DMEM مع FBS 10٪ و 1٪ البنسلين، الستربتومايسين (إينفيتروجن، وشركة)، ويفضل في مرور 20-30 أبريل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفز الخلايا في الخلايا الثقافة عن طريق علاج لفترات مختلفة على 37 درجة مئوية مع أيام سينما الواقع DOX (سيغما، 1 ملم في المياه المالحة 0.9٪، 1 ميكرومتر تركيز في وسائل الاعلام) 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كمية من موت الخلايا المبرمج في ثقافة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي مع ANX-SPIO (الوارد وصفها في 3.4 أدناه) أو باستخدام المجهر بعد صمة عار TUNEL (APO-BrdUTM أدوات الفحص TUNEL، المسابر الجزيئية / إينفيتروجن، يوجين، OR) أو بعد وصمة عار مع ANX-FITC (روش، سويسرا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية الخلايا مع ANX-SPIO (10 ملغ بروتين / مل المتوسطة باستثناء كما ورد)، أو مع الوزن يعادل SPIO حرة (5 ملغ)، لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. غسل 4 مرات مع برنامج تلفزيوني، وتراكب مع 1 مل من الاغاروز 1٪ لمنع انتشار جزيئات SPIO. إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي من الأطباق (موضح أدناه). بدلا من ذلك، وغسل الخلايا ويعرض للتريبسين بعد أيام سينما الواقع DOX ووضع العلامات ANX-SPIO، ثم السماح للخلايا إلىتشكل الكريات في أنابيب إيبندورف. </li></ol> 4. في المختبر التصوير بالرنين المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1.5 أو 3 تسلا EXCITE Signa GE الماسح الضوئي مع مستوى الركبة لفائف المتلقي لتحليل التصوير بالرنين المغناطيسي في المختبر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أطباق ثقافة أو أنابيب الى شبح أجار، والصورة باستخدام التدرج الصدى تسلسل التدرج مدلل: دوام التكرار (TR) 550 مللي، صدى الوقت (TE) 10 مللي، وزاوية الوجه 15 درجة، مصفوفة 256 × 256، الميدان من رأي 3 سم × 3 سم، سماكة 1.3 مم شريحة، وعدد من المتوسطات (NEX) 2، والمباعدة بين 0 5 مم. صورة محوريا من خلال طبقة الخلية على لوحة لخسارة T2 إشارة *، وذلك باستخدام المناطق في المصالح (رويس) من منطقة محددة (على سبيل المثال، 0.8 مم 2). ضبط الخلفية باستخدام مراقبة عائدات الاستثمار إشارة من شبح أجار. قياس الضوضاء في الخلفية من إشارة من الهواء المحيط الوهمية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب التباين التصوير بالرنين المغناطيسي إلى الضجيج نسبة (لجنة المصالحة الوطنية: [SI عينة العائد على الاستثمار ROI-SI سيطرة] / [SD من SI من الضوضاء في الخلفية]، حيث SI هو كثافة الإشارة، وتم احتساب قيمة الانحراف المعياري SD هو) لكل طبق الثقافة. </li></ol> 5. ممثل النتائج قياس خسارة T2 إشارة * في المختبر يتطلب الوهمية أجار متجانسة وعدم وجود فقاعات الهواء، والتي سوف تخلق قطعة أثرية إشارة لاغية. هذه الأداة من الصعب تمييزها عن الحقيقية T2 فقدان إشارة * من SPIO، وأمر بالغ الأهمية لتفسير النتائج. الرجاء انظر الشكل 1 للحصول على مثال قطعة أثرية الهواء، فضلا عن أكسيد الحديد حقيقي T2 فقدان إشارة *. في المختبر لثقافة التصوير طبق، تطبيق حجم مناسب من هلام أجار إلى كل طبق والثقافة، وبحيث يمكن تقديم ما يكفي من الشرائح المحورية التصوير بالرنين المغناطيسي، والتي هي حوالي 1 مم، إلى صورة وافية طبق كامل. ويوضح الشكل 2 إشارة المتوقعة التصوير بالرنين المغناطيسي من لوحات ثقافة الفرد في أجار. هناك عادة بعض الاختلاف إشارة على حواف الصفيحة، وذلك من تحليل مناطق مادباوينبغي تجنب erest هذه المجالات متفاوت. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/3775/3775fig1.jpg" /> الشكل 1. ANX-SPIO بالكشف عن الخلايا العضلية في مثقف الفئران حديثي الولادة. الشكل 1A يظهر صورة لحديثي الولادة العضلية مكعبات تعامل مع حل التحكم (أنبوب إلى اليسار)، ANX-SPIO (وسط أنبوب)، وأيام سينما الواقع DOX + ANX-SPIO (أنبوب اليمين) . لاحظ اللون البني من أيام سينما الواقع DOX + ANX-SPIO الخلايا المعالجة، والتي تعكس زيادة احتفاظ المجمع ANX-SPIO في خلايا أفكارك. الشكل 1B في صور الرنين المغناطيسي في المختبر تبين مكثفة إشارة * T2 فقدان الخلايا أيام سينما الواقع DOX ANX-SPIO +. أيضا، وينظر الى فقاعة هواء في الفترة الواقعة بين 4 و 5 عشر إيبندورف أنابيب (صغير باطل إشارة الأسود)، الذي يشبه الفراغ إشارة من ANX-SPIO، والتي يمكن أن تؤثر على تحليل لجنة المصالحة الوطنية. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/3775/3775fig2.jpg" /> الشكل 2. ANX-SPIOملزم غير محدد للخلايا أفكارك في الثقافة. 2A الشكل يوضح العضلية الفئران أفكارك حديثي الولادة في أطباق والثقافة، وتعرض لتلطيخ ANX-FLUOS أو ANX SPIO تلطيخ، مع التركيزات المنخفضة والعالية (اليسار واليمين، على التوالي) من ANX-SPIO. لاحظ مختلف T2 * فقدان إشارة (إشارة الأسود) من الخلايا أفكارك التي تم تناولها مع ANX فلوري (ANX-FLUOS) ومستويات منخفضة مقابل ارتفاع مستويات ANX-SPIO. وزيادة T2 يرتبط * فقدان إشارة على اليمين مع إشارة ANX-FLUOS انخفضت بشكل ملحوظ، والتي تم تنافست قبالة عن طريق تركيزات أعلى ASX-SPIO. الشكل 2B يوضح ملزم التنافسية للANX-SPIO مقابل إشارة ANX-FLUOS والتفكك في ثابت، ك ط. على المحور السيني يدل على تركيز البروتين Annexin في نطاق السجل. فيلم 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3775/3775movie1.mov" target="_blank">انقر هنا لعرض إضافي</a>فيلم.

<ol>
	<li>Dash, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+MRI+probe+to+detect+treatment+of+cardiac+apoptosis+in+vivo.">A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo.</a> Magn. Reson. Med. , (2011).</li><li>Khym, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+of+methylamine+with+periodate-oxidized+adenosine+5'-phosphate.">The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate.</a> Biochemistry. 2, 344-350 (1963).</li><li>Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+controlled+release+of+novel+nanoparticles+based+on+MMA/beta-CD+copolymers.">Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers.</a> Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).</li><li>Seo, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeCo/graphitic-shell+nanocrystals+as+advanced+magnetic-resonance-imaging+and+near-infrared+agents.">FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents.</a> Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).</li><li>Hsiao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticle+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+without+transfection+agent:+cellular+behavior+and+capability+of+detection+with+clinical+1.5+T+magnetic+resonance+at+the+single+cell+level.">Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level.</a> Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).</li><li>Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+apoptosis+using+magnetic+resonance+imaging+and+a+targeted+contrast+agent.">Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent.</a> Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).</li><li>van Tilborg, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+annexin+A5-functionalized+iron+oxide+particles+by+apoptotic+Jurkat+cells.">Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).</li><li>Sosnovik, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+of+cardiomyocyte+apoptosis+with+a+novel+magneto-optical+nanoparticle.">Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle.</a> Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).</li><li>Sosnovik, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+MRI+detects+low+levels+of+cardiomyocyte+apoptosis+in+a+transgenic+model+of+chronic+heart+failure.">Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure.</a> Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).</li><li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+death+induced+by+myocardial+ischemia+and+reperfusion:+measurement+with+recombinant+human+annexin-V+in+a+mouse+model.">Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model.</a> Circulation. 102, 1564-1568 (2000).</li><li>Blankenberg, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+and+imaging+of+phosphatidylserine+expression+during+programmed+cell+death.">In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).</li><li>Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magneto/optical+annexin+V,+a+multimodal+protein.">Magneto/optical annexin V, a multimodal protein.</a> Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة تصريف الافعال المذكورة لربط SPIO إلى الخامس Annexin تستغل جماعات أمين جانب سلسلة من Annexin والأنصاف الكربوكسيل من nanoparticle SPIO. من خلال خطوات محددة للحد من أكسدة، لا يمكن تحقيق الربط التساهمية من هذه المركبات، ويمكن أن تكون معزولة عن جسيمات متناهية الصغر الناتجة functionalized....

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج # </td></tr><tr><td> Superparamagnetic أكسيد الحديد </td><td> المحيط تكنولوجيا النانو، وشركة </td><td> إك، 40-005 </td></tr><tr><td> دوكسوروبيسين </td><td> سيغما </td><td> D1515-10MG </td></tr><tr><td> SuperMag فاصل </td><td> المحيط تكنولوجيا النانو، وشركة </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Zetasizer آلة نانو DLS </td><td> مالفيرن، وشركة </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

synthesis of an in vivo mri-detectable apoptosis probe

موت الخلايا المبرمج الخليوي هي سمة بارزة من كثير من الأمراض، وهذا موت الخلايا المبرمج يحدث عادة قبل المظاهر السريرية للمرض واضحة للعيان. وثمة وسيلة للكشف عن موت الخلايا المبرمج في مراحله المبكرة، عكسها تحمل ما قبل السريرية &#39;نافذة&#39; خلالها يمكن اتخاذ تدابير وقائية أو علاجية لحماية القلب من ضرر دائم. نقدم هنا طريقة بسيطة وقوية لتصريف الإنسان Annexin الخامس (ANX)، الذي يربط بشوق إلى الخلايا في المراحل المبكرة، عكسها من موت الخلايا المبرمج، على جزيئات حديد superparamagnetic (SPIO) أكسيد، والتي تكون بمثابة وكيل النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف. طريقة اقتران يبدأ أكسدة النانوية SPIO، التي يكسد مجموعات الكربوكسيل على قذيفة السكاريد من SPIO. تنقية ANX البروتين ثم يضاف في الإعداد للصوديوم بورات حل لتسهيل التفاعل التساهمية من ANX مع SPIO في منطقة عازلة الحد. خطوة تخفيض نهائي مع borohydrid الصوديوميتم تنفيذ ه لاستكمال الحد من الفقر، ومن ثم تطفئ رد الفعل. تتم إزالة ANX Unconjugated من المزيج عن طريق الترشيح microcentrifuge. يتم التحقق من حجم ونقاء المنتج ANX-SPIO التي تشتت الضوء الحيوي (DLS). هذا الأسلوب لا يتطلب بالإضافة إلى، أو تعديل، والسكاريد SPIO قذيفة، في مقابل عبر ربط طرق الحديد أكسيد اقتران الجسيمات النانوية أو البيوتين المسمى. ونتيجة لذلك، وهذه الطريقة يمثل بسيطة، ونهج القوية التي يمكن تمديدها إلى اقتران من البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe at JoVE.com

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

قد كشف في وقت مبكر من موت الخلايا المبرمج الخلية تحديد السكان المعرضين للخطر في مجموعة متنوعة من الأمراض. هنا نحن يبرهن على وجود طريقة لربط موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر للكشف عن البروتين (Annexin V) على جزيئات النانو أكسيد الحديد المغناطيسي للكشف (SPIO). ويجوز تمديد هذه الطريقة إلى البروتينات الأخرى ذات الاهتمام لتوليد التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف تحقيقات التصوير الجزيئي.

توليف لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; دقق في موت الخلايا المبرمج التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

synthesis-of-an-in-vivo-mri-detectable-apoptosis-probe

Research

JoVE Journal

Biology

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

9.1K Views.  Stanford University Medical Center. قد كشف في وقت مبكر من موت الخلايا المبرمج الخلية تحديد السكان المعرضين للخطر في مجموعة متنوعة من الأمراض. هنا نحن يبرهن على وجود طريقة لربط موت الخلايا المبرمج في وقت مبكر للكشف عن البروتين (Annexin V) على جزيئات النانو أكسيد الحديد المغناطيسي للكشف (SPIO). ويجوز تمديد ?...

Video: Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

الموقع محلية الصنع تطفير موجه من البلازميدات الجامعة

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely used in conjunction with Annexin V to determine if cells are viable, apoptotic, or necrotic through differences in plasma membrane integrity and permeability1,2. The Annexin V/ PI protocol is a commonly used approach for studying apoptotic cells3. PI is used more often than other nuclear stains because it is economical, stable and a good indicator of cell viability, based on its capacity to exclude dye in living cells 4,5. The ability of PI to enter a cell is dependent upon the permeability of the membrane; PI does not stain live or early apoptotic cells due to the presence of an intact plasma membrane 1,2,6. In late apoptotic and necrotic cells, the integrity of the plasma and nuclear membranes decreases7,8, allowing PI to pass through the membranes, intercalate into nucleic acids, and display red fluorescence 1,2,9. Unfortunately, we find that conventional Annexin V/ PI protocols lead to a significant number of false positive events (up to 40%), which are associated with PI staining of RNA within the cytoplasmic compartment10. Primary cells and cell lines in a broad range of animal models are affected, with large cells (nuclear: cytoplasmic ratios &lt;0.5) showing the highest occurrence10. Herein, we demonstrate a modified Annexin V/ PI method that provides a significant improvement for assessment of cell death compared to conventional methods. This protocol takes advantage of changes in cellular permeability during cell fixing to promote entry of RNase A into cells following staining. Both the timing and concentration of RNase A have been optimized for removal of cytoplasmic RNA. The result is a significant improvement over conventional Annexin V/ PI protocols (&lt; 5% events with cytoplasmic PI staining).

An accurate method for the assessment of cell death is described. The protocol improves upon conventional Annexin V/ propidium iodide (PI) protocols, which display up to 40% false- positive events in cell lines and primary cells from a broad range of animal models.

تعديل Annexin الأبوطوزيس التأيد V / Propidium الفحص للحصول على تقييم دقيق للموت الخلية

Studies of cellular apoptosis have been significantly impacted since the introduction of flow cytometry-based methods. Propidium iodide (PI) is widely ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

والطماطم / GFP-FLP / FRT الطريقة للتصوير لايف من الفسيفساء الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; خلايا مستقبلة للضوء

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

و في الجسم الحي يشابك النهج لعزل البروتين المجمعات من ذبابة الفاكهة الأجنة

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

و<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Strategies for Tracking Anastasis, A Cell Survival Phenomenon that Reverses Apoptosis

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important checkpoints of apoptosis, including mitochondrial fragmentation, release of mitochondrial cytochrome c into the cytosol, activation of caspases, chromatin condensation, DNA damage, nuclear fragmentation, plasma membrane blebbing, cell shrinkage, cell surface exposure of phosphatidylserine, and formation of apoptotic bodies. Anastasis can occur when apoptotic stimuli are removed prior to death, thereby allowing dying cells to reverse apoptosis and potentially other death mechanisms. Therefore, anastasis appears to involve physiological healing processes that could also sustain damaged cells inappropriately. The functions and mechanisms of anastasis are still unclear, hampered in part by the limited tools for detecting past events after the recovery of apparently healthy cells. Strategies to detect anastasis will enable studies of the physiological mechanisms, the hazards of undead cells in disease pathology, and potential therapeutics to modulate anastasis. Here, we describe effective strategies using live cell microscopy and a mammalian caspase biosensor&#160;for identifying and tracking anastasis in mammalian cells.

The term anastasis refers to the phenomenon in which dying cells reverse a cell suicide process at a late stage, repair themselves, and ultimately survive. Here we demonstrate protocols for detecting and tracking cells that undergo anastasis.

استراتيجيات لتتبع القيامة، خلية بقاء ظاهرة التي عكس موت الخلايا المبرمج

Anastasis (Greek for &#8220;rising to life&#8221;) refers to the recovery of dying cells. Before these cells recover, they have passed through important ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

تقييم الانتقائية مرنا الترجمة في خلايا الثدييات من قبل Polysome التنميط

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...