המכונים הלאומיים לבריאות, NHLBI (RD, PY, PS). איגוד הלב האמריקני (JL). סטנפורד, VPUE גרנט (JL).

מעובד מתוך מחקר לפני 1. 1. נטיה של Annexin V כדי SPIO <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמצן חלקיקים SPIO (האוקיינוס ​​ננוטק Inc, 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עבור 1 שעה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס בחושך בתמיסה עם 0.15 מ &#39;נתרן periodate (NaIO 4) (4:01 משקל: יחס משקל) 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה SPIO חמצון במשך שעה עם 12 מטוהרים חלבון ANX (1:1 יחס, משקל: משקל) ב borate M 0.15 נתרן (Na 2 B 4 O 7 10 שעות 2 O) בשעה 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את תערובת נוספת שעה 1 עם borohydride נתרן (NaBH 4) מתחת למכסה המנוע קטר ואז להרוות עם 0.15 מ &#39;טריס-HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד ANX ללא ANX-SPIO ידי צנטריפוגה ב XG 14,000 (75 נקבוביות מיקרומטר Microcon מסנן, Millipore, Billerica, MA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדד עוד יותר את המתחם על ידי הסרת זיהומים מאוגד באמצעות מכשיר מפריד מגנטי (האוקיינוס ​​ננוטק, Inc). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את retentate מסנן (ANX-SPIO) רמות החלבוןעל ידי assay חלבון ברדפורד וחנות ב -80 ° C ב 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​0.1 M Tris-HCl עם 1% מעכבי פרוטאז אלבומין בסרום (פרוטאז האלט מעכב, Thermo Scientific, 1-50 מ&quot;ג / ANX מ&quot;ג). </li></ol> 2. פיזור אור דינאמי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד לדלל את SPIO ANX ו-SPIO ב PBS צפיפות אופטית של 0.1 ולנתח ידי פיזור אור דינאמי על מכונת ננו DLS Zetasizer (Malvern בע&quot;מ, ווסטרשייר, בריטניה) 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג פסגות monomodal (באופן אידיאלי) עבור המתחם, בגודל Z-הממוצע החלקיקים ואת ראשי polydispersity (PDI). תשוו את זה גודל לגודל DLS-מדודה של nanoparticle תחמוצת ברזל בלבד. ANX-SPIO תוצאות DLS הראה חלקיק המצומד הידרודינמית בקוטר של 78 ננומטר עם פ&quot;ד של 0.13 1, המשקף הומוגניות ANX-SPIO המינים 3. </li></ol> 3. תרבית תאים, אינדוקציה של אפופטוזיס בתרבות, ו-MRI של תאים בתרבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למבוגרים תרבות העכבר מח עצם של mesenchymalתאים TEM (mMSCs) ב DMEM השלימו עם 10% ו 1% FBS פניצילין, סטרפטומיצין (Invitrogen, Inc), רצוי במעבר 20-30 אפריל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום אפופטוזיס בתאי תרבית ידי טיפול עבור משתנה פעמים ב 37 ° C עם DOX (Sigma, 1 מ&quot;מ מלוחים 0.9%, ריכוז 1 מיקרומטר בתקשורת) 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את כמות אפופטוזיס בתרבות או באמצעות MRI עם ANX-SPIO (המתואר 3.4 להלן) או באמצעות מיקרוסקופ לאחר TUNEL כתם (APO-BrdUTM TUNEL Assay קיט, בדיקות מולקולריות / Invitrogen, יוג&#39;ין, OR) או אחריו כתם עם ANX-FITC (Roche, שוויץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג את התאים עם ANX-SPIO (10 חלבון / mL מ&quot;ג בינוני למעט כאמור), או עם משקל שווה ערך חינם SPIO (5 מ&quot;ג), במשך 15 דקות ב 37 ° C. לשטוף 4 פעמים עם PBS, וכן כיסוי עם 1 מ&quot;ל של agarose 1% כדי למנוע דיפוזיה של חלקיקים SPIO. לבצע בדיקת MRI של המנות (כמתואר בהמשך). לחלופין, לשטוף את התאים לאחר trypsinize DOX ANX ו-SPIO תיוג, ואז לאפשר לתאיםיוצרים כדורי ב Eppendorf צינורות. </li></ol> 4. במבחנה MRI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 1.5 או 3 טסלה GE Signa סורק Excite עם סליל המקלט תקן הברך בניתוח MRI חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים תרבות או צינורות לתוך רפאים אגר, ואת התמונה, תוך שימוש ברצף הדרגתי, הד שיפוע מפונק: זמן החזרה (TR) 550 מילישניות, זמן אקו (TE) 10 ms, זווית להעיף 15 °, מטריקס 256 x 256, שדה של נוף 3 ס&quot;מ X 3 ס&quot;מ, עובי פרוסת 1.3 מ&quot;מ, מספר ממוצעים (NEX) 2, 0 המרווח 5 מ&quot;מ. תמונה axially דרך שכבת תאים בצלחת על אובדן האות * T2, תוך שימוש באזורים של ריבית (ROIs) של אזור קבוע (למשל, 0.8 מ&quot;מ 2). להתאים את הרקע באמצעות אותות בקרה ROI מ רפאים אגר. למדוד את רעשי הרקע של האות האוויר המקיף את הפנטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחס ניגודיות MRI לרעש (CNR: [SI SI-ROI מדגם השליטה ROI] / [SD של SI של רעשי רקע], שם SI היא עוצמת האות,SD הוא סטיית התקן) חושב על כל מאכל התרבות. </li></ol> 5. נציג תוצאות מדידה של אובדן * האות T2 במבחנה דורש פנטום אגר הומוגנית וחוסר בועות אוויר, אשר תיצור חלל חפץ האות. ממצא זה קשה להבחין בין אובדן אמיתי * T2 האות של SPIO, הוא קריטי לתוצאות לפירוש. אנא ראה איור 1 למשל של חפץ האוויר כמו גם תחמוצת ברזל אמיתי T2 * אובדן האות. עבור הדמיה מנה חוץ גופית התרבות, החל נפח מתאים של ג&#39;ל אגר לצלחת בכל תרבות, כך מספיקות פרוסות ה-MRI צירית, שהם כ 1 מ&quot;מ עובי, ניתן לבצע את התמונה כראוי את המנה כולה. איור 2 ממחיש את האות הצפוי MRI מצלחות תרבות בודדים אגר. יש בדרך כלל איזו וריאציה האות בשולי הצלחת, לכן ניתוח של אזורים של interest יש להימנע באזורים אלה לא אחידים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3775/3775fig1.jpg" /> באיור 1. ANX-SPIO מזהה אפופטוזיס בתרבית cardiomyocytes חולדה היילודים. איור 1 א מציג תמונה של cardiomyocytes היילודים pelleted שטופלו פתרון שליטה (צינור משמאל), ANX-SPIO (צינור באמצע), ו-DOX + ANX SPIO (צינורית מימין) . הערה צבע חום של DOX + ANX-SPIO תאים שטופלו, המשקף שמירה מוגברת של המתחם ANX-SPIO בתאים אפופטוטיים. 1B איור בתמונות חוץ גופית ה-MRI הראו אינטנסיבי T2 * אובדן האות של + DOX ANX-SPIO תאים. כמו כן, בועת אוויר נתפס בין ה 4 ו 5 th Eppendorf צינורות (אות קטנה חלל שחור), אשר דומה הריק את האות של ANX-SPIO, ואשר יכול להשפיע על ניתוח של CNR. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3775/3775fig2.jpg" /> איור 2. ANX-SPIOמחייב הוא ספציפי של תאים אפופטוטיים בתרבות. 2A איור מדגים cardiomyocytes חולדה אפופטוטיים היילודים על הכלים תרבות, נתון מכתים ANX-FLUOS או ANX-SPIO מכתים, עם ריכוז נמוך וגבוה (ימינה ושמאלה, בהתאמה) של ANX-SPIO. הערה אחרת T2 * אובדן האות (סיגנל שחור) של תאים אפופטוטיים כי טופלו ANX ניאון (ANX-FLUOS) ורמות נמוכות לעומת רמות גבוהות של ANX-SPIO. יותר T2 * אובדן האות בצד ימין קשורה האות ANX-FLUOS מופחת במידה ניכרת, אשר התחרו את ידי ASX-SPIO ריכוזים גבוהים יותר. איור 2B מדגים מחייב התחרותי של ANX-SPIO לעומת ANX-FLUOS האות דיסוציאציה קבוע, K i. ציר ה-X מציין את ריכוז החלבון Annexin בהיקף יומן. סרט 1. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3775/3775movie1.mov" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג משלימה</a>הסרט.

<ol>
	<li>Dash, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+molecular+MRI+probe+to+detect+treatment+of+cardiac+apoptosis+in+vivo.">A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo.</a> Magn. Reson. Med. , (2011).</li><li>Khym, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+of+methylamine+with+periodate-oxidized+adenosine+5'-phosphate.">The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5'-phosphate.</a> Biochemistry. 2, 344-350 (1963).</li><li>Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+characterization,+and+controlled+release+of+novel+nanoparticles+based+on+MMA/beta-CD+copolymers.">Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers.</a> Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).</li><li>Seo, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FeCo/graphitic-shell+nanocrystals+as+advanced+magnetic-resonance-imaging+and+near-infrared+agents.">FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents.</a> Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).</li><li>Hsiao, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+nanoparticle+labeling+of+mesenchymal+stem+cells+without+transfection+agent:+cellular+behavior+and+capability+of+detection+with+clinical+1.5+T+magnetic+resonance+at+the+single+cell+level.">Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level.</a> Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).</li><li>Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+detection+of+apoptosis+using+magnetic+resonance+imaging+and+a+targeted+contrast+agent.">Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent.</a> Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).</li><li>van Tilborg, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internalization+of+annexin+A5-functionalized+iron+oxide+particles+by+apoptotic+Jurkat+cells.">Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).</li><li>Sosnovik, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+imaging+of+cardiomyocyte+apoptosis+with+a+novel+magneto-optical+nanoparticle.">Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle.</a> Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).</li><li>Sosnovik, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+MRI+detects+low+levels+of+cardiomyocyte+apoptosis+in+a+transgenic+model+of+chronic+heart+failure.">Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure.</a> Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).</li><li>Dumont, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+death+induced+by+myocardial+ischemia+and+reperfusion:+measurement+with+recombinant+human+annexin-V+in+a+mouse+model.">Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model.</a> Circulation. 102, 1564-1568 (2000).</li><li>Blankenberg, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+and+imaging+of+phosphatidylserine+expression+during+programmed+cell+death.">In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).</li><li>Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magneto/optical+annexin+V,+a+multimodal+protein.">Magneto/optical annexin V, a multimodal protein.</a> Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

שיטת הצמידה תיאר לקישור SPIO כדי Annexin V מנצל את שרשרת לוואי אמין קבוצות Annexin ואת moieties carboxyl של nanoparticle SPIO. דרך הפחתת חמצון צעדים ספציפיים, הצמדה קוולנטי של תרכובות אלה ניתן להשיג, ואת nanoparticle פונקציונליות וכתוצאה מכך יכול להיות מבודד. שיטה זו עשויה להכליל את חלבונים אחרים חל...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> קטלוג # </td></tr><tr><td> ברזל פאראמגנטי תחמוצת </td><td> האוקיינוס ​​ננוטק, Inc </td><td> איכס-40-005 </td></tr><tr><td> דוקסורוביצין </td><td> סיגמא </td><td> D1515-10 מ&quot;ג </td></tr><tr><td> SuperMag מפריד </td><td> האוקיינוס ​​ננוטק, Inc </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Zetasizer ננו מכונת DLS </td><td> Malvern, Inc </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

synthesis of an in vivo mri-detectable apoptosis probe

אפופטוזיס נייד הוא מאפיין בולט של מחלות רבות, וזה מוות תאים מתוכנת מתרחשת בדרך כלל לפני הביטויים הקליניים של המחלה ניכרות. אמצעי לזהות אפופטוזיס הראשונים שלה, בשלבים הפיך היה להרשות לעצמו קדם קליניים &quot;חלון&quot; שבמהלכו אמצעי מניעה או טיפול שניתן לנקוט כדי להגן על הלב מפני נזק בלתי הפיך. אנו מציגים כאן שיטה פשוטה חזקים כדי להטות האדם Annexin V (ANX), אשר נקשר לתאי בשקיקה אותם בשלבים הראשונים הפיך של אפופטוזיס, לגהץ פאראמגנטי תחמוצת (SPIO) חלקיקים, המשמשים כסוכן-MRI לגילוי ניגוד. שיטת הצמידה מתחיל חמצון של חלקיקים SPIO, אשר מתחמצנים קבוצות carboxyl על הקליפה פוליסכריד של SPIO. מטוהרים חלבון ANX נוסף ואז במסגרת של פתרון נתרן borate כדי להקל על האינטראקציה קוולנטי של ANX עם SPIO במאגר צמצום. השלב האחרון עם ירידה borohydrid נתרןהדואר מתבצעת על מנת להשלים את הירידה, ואז התגובה היא הרווה. ANX Unconjugated יוסר תערובת ידי סינון microcentrifuge. גודל והטוהר של המוצר ANX-SPIO מאומת על ידי פיזור אור דינאמי (DLS). שיטה זו אינה דורשת בנוסף, או שינוי, פוליסכריד SPIO פגז, בניגוד צולבים תחמוצת ברזל החלקיקים שיטות לצמידה או ביוטין, שכותרתו חלקיקים. כתוצאה מכך, שיטה זו מייצגת גישה פשוטה, חזקה כי ניתן להאריך את הצמידה של חלבונים אחרים בעלי עניין.

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe at JoVE.com

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

גילוי מוקדם של אפופטוזיס עשוי לזהות אוכלוסיות בסיכון סלולריים במגוון רחב של מחלות. כאן אנו מראים שיטה לקשר חלבון מוקדם אפופטוזיס איתור (Annexin V) כדי nanoparticle-MRI לגילוי תחמוצת ברזל (SPIO). שיטה זו עשויה להתארך עד חלבונים אחרים בעלי עניין לייצר-MRI לגילוי בדיקות הדמיה מולקולרית.

סינתזה של<em&gt; ב-vivo</em&gt;-MRI לגילוי אפופטוזיס בדיקה

Cellular apoptosis is a prominent feature of many diseases, and this programmed cell death typically occurs before clinical manifestations of disease are ...

synthesis-of-an-in-vivo-mri-detectable-apoptosis-probe

Research

JoVE Journal

Biology

Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

9.1K Views.  Stanford University Medical Center. גילוי מוקדם של אפופטוזיס עשוי לזהות אוכלוסיות בסיכון סלולריים במגוון רחב של מחלות. כאן אנו מראים שיטה לקשר חלבון מוקדם אפופטוזיס איתור (Annexin V) כדי nanoparticle-MRI לגילוי תחמוצת ברזל (SPIO). שיטה זו עשויה להתארך עד חלבונים אחרים בעלי עניין לייצר-MRI לגילוי בדיקות הדמיה מולק?...

Video: Synthesis of an In vivo MRI-detectable Apoptosis Probe

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Mutagenesis האתר ביתי בימוי של פלסמידים שלמים

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of 'ratiometric-pericam' which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 &mu;M4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.

This protocol describes a method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes by fluorescent imaging. The method takes advantage of a circularly permutated YFP-based dual-excitation ratiometric calcium sensor (ratiometric pericam-mt) selectively expressed in mitochondria.

ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית

Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis in zebrafish embryos. The whole-mount analysis provides spatial information in regard to tissue specificity of apoptosing cells, although sectioning and/or colabeling is ultimately required to pinpoint the exact cell types undergoing apoptosis. The whole-mount Casp3 assay is optimized for analysis of fixed embryos between the 4-cell stage and 32 hr-post-fertilization and is useful for a number of applications, including analysis of zebrafish mutants and morphants, overexpression of mutant and wild-type mRNAs, and exposure to chemicals. Compared to acridine orange staining, which can identify apoptotic cells in live embryos in a matter of hours, Casp3 and TUNEL assays take considerably longer to complete (2-4 days). However, because of the dynamic nature of apoptotic cell formation and clearance, analysis of fixed embryos ensures accurate comparison of apoptotic cells across multiple samples at specific time points. We have also found the Casp3 assay to be superior to analysis of apoptotic cells by the whole-mount TUNEL assay in regard to cost and reliability. Overall, the Casp3 assay represents a robust, highly reproducible assay in which to analyze apoptotic cells in early zebrafish embryos.

Certain genetic perturbations or exposure to toxins can disrupt normal developmental processes leading to death of specific cell types. The analysis of activated Caspase 3 by whole-mount immunofluorescence in zebrafish embryos reveals stage- and tissue-specific localization of cells specifically undergoing apoptosis.

ניתוח של אפופטוזיס בעוברי דג הזברה על ידי כל הר Immunofluorescence לזיהוי caspase הופעל 3

Whole-mount immunofluorescence to detect activated Caspase 3 (Casp3 assay) is useful to identify cells undergoing either intrinsic or extrinsic apoptosis ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown to allow to selective translation of specific mRNAs, which typically encode for proteins required for a particular stress response. Identification of these mRNAs, as well as the characterization of regulatory mechanisms responsible for selective translation has been at the forefront of molecular biology for some time. Polysome profiling is a cornerstone method in these studies. The goal of polysome profiling is to capture mRNA translation by immobilizing actively translating ribosomes on different transcripts and separate the resulting polyribosomes by ultracentrifugation on a sucrose gradient, thus allowing for a distinction between highly translated transcripts and poorly translated ones. These can then be further characterized by traditional biochemical and molecular biology methods. Importantly, combining polysome profiling with high throughput genomic approaches allows for a large scale analysis of translational regulation.

The ability of cells to adapt to stress is crucial for their survival. Regulation of mRNA translation is one such adaptation strategy, providing for rapid regulation of the proteome. Here, we provide a standardized polysome profiling protocol to identify specific mRNAs that are selectively translated under stress conditions.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...