<p class="jove_content"&gt; وأيد هذا العمل من الكتاب من قبل منحة بحثية ID-BOF لعام 2006 من جامعة أنتويرب (الممنوحة لPPO وAVdL)، عن طريق منح البحوث G.0136.11 وG.0130.11 (الممنوحة لAVdL، ZB وPPO)، و1.5.021.09. N.00 (الممنوحة لPPO) من صندوق للأبحاث العلمية، فلاندرز (FWO-Vlaanderen، وبلجيكا)، عن طريق منحة بحثية IWT SBO-60838: BRAINSTIM المعهد الفلمنكي للعلوم والتكنولوجيا (الممنوحة لZB وAVDL)، في جزء من منحة بحث Methusalem من الحكومة الفلمنكية (الممنوحة لZB)، في جزء منه من قبل المفوضية الأوروبية وFP6-نوي DiMI (LSHB-CT-2005-512146)، EC-FP6-نوي EMIL (LSHC-CT-2004-503569) ، وأقطاب الجذب بين جامعة IUAP-NIMI-P6/38 (الممنوحة لAVDL). دي ناتالي Vocht حاصل على درجة الدكتوراه، منحة دراسية من FWO-Vlaanderen. بيتر Ponsaerts زميل ما بعد الدكتوراه من FWO-Vlaanderen.</p

1. خلية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي البدء في التجارب باستخدام الخلايا الجذعية خارج الحي مثقف السكان وراثيا للتعبير عن البروتينات مراسل luciferase وeGFP. هنا نستخدم luciferase المراسل / eGFP في التعبير عن الفئران نخاع العظام المستمدة من الخلايا اللحمية (BMSC-Luc/eGFP) سابقا كما وصفها Bergwerf وآخرون. 2 و 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يومين من وضع العلامات الخلية، وخلايا BMSC-Luc/eGFP لوحة في كثافة 8 × 5 10 خلايا لكل قارورة ثقافة T75 في 15 مل المتوسطة توسيع كاملة (CEM) تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل Puromycine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا أن تنمو لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 × 10 6 الجليدية الزرقاء أكسيد الحديد ميكرون الحجم الجسيمات (GB MPIO) في ثقافة المتوسط ​​مل للثقافة الخلية متزايد (المجموع: 75 × 10 6 جزيئات لكل 15 مل الثقافة المتوسطة في قارورة ثقافة T75). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 16 ساعة للسماح امتصاص الجسيمات عن طريق الإلتقام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الجسيمات المتبقيةوالسماح للخلايا أن تنمو لمدار 24 ساعة إضافية للحصول على توزيع الخلية confluency ومتجانسة من MPIO غيغابايت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من صحة امتصاص الجسيمات بصريا باستخدام المجهر مضان من قبل احتساب نسبة من + eGFP وGB الخلايا MPIO + إلى المبلغ الإجمالي للخلايا + eGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا GB BMSC-Luc/eGFP MPIO المسمى مرتين مع برنامج تلفزيوني مل (10) والخلايا بعد الحصاد التربسين-EDTA علاج (5 مل لكل قارورة ثقافة T75 لمدة 5 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل خلايا المقطوع وresuspend في تركيز النهائي من 133 × 10 6 خلية / مل في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفاظ على الخلايا على الجليد حتى الزرع. </li></ol> 2. زرع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران عن طريق حقن داخل الصفاق من الكيتامين (80 ملغ / كلغ) + زيلازين (16 ملغ / كلغ) خليط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للفئران لتغفو. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حلق الرأس الماوس للسماح للتلاعب العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الماوس في إطار المجسم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desinfect للالجلد ورطب أعين الفئران لمنع الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل فروة الرأس شق خط الوسط لفضح الجمجمة، وحفر حفرة في الجمجمة باستخدام الأسنان لدغ الحفر في الإحداثيات الممنوحة: 2 مم و 2 مم الخلفي الجانبي لBregma. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة تعليق خلية لفترة وجيزة، ونضح على تعليق خلية في المحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إبرة الحقنة على عمق 2.5 ملم تحت الجافية والسماح للموازنة الضغط لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن لمدة 3 تعليق خلية ميكروليتر (4 × 10 5 خلايا) على عمق 2 ملم تحت الجافية وبسرعة 0.70 ميكروليتر / دقيقة باستخدام الآلية الدقيقة مضخة حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الانتظار للحصول على 5 دقائق إضافية لمنع ارتجاعي لتعليق الخلية حقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع ببطء الإبرة وتطهير الحدود الجلد قبل خياطة الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 300 ميكروليتر حل كلوريد الصوديوم 0.9٪ تحت الجلد لمنع جفاف، ووضع الماوس تحت مصباح التدفئة للتعافي من التخدير. إدارة عمعاهدة الفضاء الخارجي للعمليات الجراحية مسكن وفقا للمعايير المؤسسية. </li></ol> 3. في ضوء بارد فيفو <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران من خلال مزيج من 3٪ isoflurane والأوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران في تصوير فوتون وخفض مستوى التخدير إلى 1.5٪ isoflurane والأوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن 150 ملغ D-luciferin لكل كيلوغرام من وزن الجسم عن طريق الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة لمدة 5 دقائق باستخدام برنامج رؤية الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء معالجة الصور باستخدام برنامج M3vision. قياس إشارة المرصودة باستخدام مناطق محددة من الفائدة. </li></ol> 4. في فيفو التصوير بالرنين المغناطيسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع 3٪ isoflurane في خليط من O 2: N 2 O (3:7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الفئران في restrainer نظام أفقي MR 9.4T وخفض مستوى التخدير إلى 1٪ isoflurane في خليط من O 2: N 2 O (3:7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب أعين الفئران لمنع dehydraنشوئها، ونعلق تحقيقا المستقيم لمراقبة درجة حرارة الجسم ورصد معدل التنفس عن طريق وضع جهاز استشعار تحت بطن الفأرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على معدل التنفس عند 110 ± 10 نفسا في الدقيقة والحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة ضمن نطاق ضيق من 37 ± 0.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لفائف الترددات اللاسلكية على سطح قمة الرأس الماوس وموقف الماوس في منتصف المغناطيس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مجموعة من 10 الاكليلية الصور تدور T2 المرجحة (جنوب شرق) صدى للحصول على معلومات تشريحية محددة وT2 * المرجحة الانحدار الصور الصدى (GE)، من أجل دراسة الخلية الجذعية الهجرة مع قرار في الطائرة من 70 ميكرون 2. تعيين المعلمات تسلسل على النحو التالي: وقت تكرار (TR): 500 مللي، صدى الوقت (TE): 8 مللي ثانية (GE تسلسل) ومرة ​​تكرار (TR): 4200 مللي، صدى الوقت (TE): 12،16 مللي (SE تسلسل)؛ مجال الرؤية (FOV): 18x18 مم 2، مصفوفة: 256x256، شريحة سمك 1 مم و 1 فصل شريحة ملم (5.1 Paravision البرمجيات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء معالجة البياناتباستخدام أميرة 4.0 البرمجيات. </li></ol> 5. علم الأنسجة بعد الوفاة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران عميقا جدا عن طريق الاستنشاق من الأوكسجين isofluorane (4٪)، (0.5 لتر / دقيقة) والنيتروجين (1 لتر / دقيقة) الخليط لمدة 2 دقيقة. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة دماغ الفأر من الجمجمة ويحملق في أنسجة المخ في بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى أنسجة المخ من خلال وضع الدماغ في وقت لاحق في تدرجات مختلفة من السكروز: 2 ساعة في السكروز بنسبة 5٪ في برنامج تلفزيوني، 2 ساعة في السكروز 10٪ في برنامج تلفزيوني، بين عشية وضحاها في السكروز 20٪ في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميد أنسجة المخ باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه في الأنسجة في -80 درجة مئوية حتى باجتزاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسم نسيج الدماغ في المادتين 10 ميكرون سميكة باستخدام ناظم البرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير ملوثين شاشة cryosections لمضان الزرقاء من الجزيئات MPIO غيغابايت ومضان أخضر من الخلايا eGFP تعبير باستخدام مجهر مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير ملوثين شاشة cryosections للأخضر / أحمر مضان الخلفية من الخلايا الالتهابية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء مزيد من stainings المناعى ومناعي لتحديد السكان الخلية الذاتية (على سبيل المثال الخلايا الدبقية الصغيرة، النجمية، خلايا تي، ...) التي تتفاعل مع الطعوم الخلوية. </li></ol> 6. ممثل النتائج نحن هنا قدم بصريا تسلسل الأحداث الأمثل للتصوير المتعدد الوسائط بنجاح luciferase المراسل / eGFP في التعبير عن السكان الخلية (الجذعية) في الجهاز العصبي المركزي من الفئران. في البداية، ووصف وضع العلامات النتائج MPIO إجراء جيجابايت في وضع العلامات ذات كفاءة عالية من الخلايا BMSC-Luc/eGFP، والتي يمكن بسهولة يمكن التحقق من صحة باستخدام المجهر مضان (الشكل 2A). المقبل، على تطعيم MPIO GB المسمى BMSC-Luc/eGFP في الجهاز العصبي المركزي من الفئران، ويمكن رصدها من البقاء على قيد الحياة والكسب غير المشروع من قبل الخلوية في الجسم الحي BLI استنادا luciferase النشاط (2B الشكل). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن رصد التعريب الدقيق للخلايا في الجسم الحي من قبل المطعمة </EM&gt; التصوير بالرنين المغناطيسي على أساس محتوى الحديد من MPIO غيغابايت (الشكل 2C). أخيرا، التحليل النسيجي يسمح المصادقة على النتائج التي حصل عليها BLI والتصوير بالرنين المغناطيسي. وأكد بقاء مستقر من خلال التعبير eGFP مستقر في الوقت المناسب (الشكل 2D). لهذا، colocalization من eGFP في التعبير عن الخلايا مع MPIO فلوري أزرق يسمح لتحديد الدقيق للتوطين، والبقاء على قيد الحياة من الخلايا المطعمة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الوسم المزدوج فلوري من الخلايا الجذعية يقلل من احتمال لمراقبة نتائج إيجابية كاذبة على أساس مضان الخلفية التي أنشأتها الخلايا الالتهابية 5. <img alt="الشكل 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> الشكل 1. نظرة عامة على التعامل مع تسلسل <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وسم الخلية: وصفت BMSC-Luc/eGFP مع 5 × 10 6 جزيئات MPIO غيغابايت في وسط ثقافة مل. بعد 16 ساعة من الحضانة وفترة راحة التالية من 24 ساعة، ويتم حصاد الخلايا لغرس داخل المخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> زرع الخلية: GB MPIO المسمى والمطعمة BMSC-Luc/eGFP في مخ الفأر في الإحداثيات التالية: bregma -2 مم، 2 مم حق من خط الوسط و2 مم تحت الجافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في BLI فيفو: الوريد وعقب 150 ملغ D-luciferin/kg وزن الجسم، وكانت الشركة قد ولدت على ضوء خلال 5 دقائق باستخدام جهاز التصوير فوتون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي: تم الحصول على مجموعة من 10 الاكليلية الصور تدور T2 المرجحة (جنوب شرق) الصدى وT2 * المرجحة صدى الانحدار الصور (GE) مع قرار في الطائرة من 70 ميكرون 2. تسلسل المعلمات على النحو التالي: وقت تكرار (TR): 500 مللي، صدى الوقت (TE): 8 مللي ثانية (GE تسلسل) ومرة ​​تكرار (TR): 4200 مللي، صدى الوقت (TE): 12،16 مللي (SE تسلسل)؛ مجال الرؤية (FOV): 18x18 مم 2، مصفوفة: 256x256، شريحة سمك 1 مم و 1 مم فصل شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كما تم عرض cryosection سميك 10μm لeGFP التعبير عن والأزرق fluorescently المسمى يو BMSC: بعد الوفاة الأنسجةالغناء المجهر مضان. </li></ol><img alt="الشكل 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> التصوير المتعدد الوسائط الرقم 2. من ترقيع الخلايا الجذعية <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المجهري المناعي المباشر من الجليدية MPIO (GB) الأزرق المسمى BMSC-Luc/eGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في BLI المجراة من حقن الفئران مع 4x10 5 غيغابايت المسمى MPIO الخلايا BMSC-Luc/eGFP في الاسبوع 1 و 2 بعد أسبوع التوطين. التحليل الإحصائي للإشارات BLI الكشف في الاسبوع 1 و 2 أسبوع بعد الزرع. يتم التعبير عن البيانات كما بلغ متوسط ​​عدد الفوتونات في الثانية لكل ستيراديان لكل سنتيمتر مربع (الرقم الهيدروجيني / S / ريال / سم 2) من فترة زمنية 5 دقائق + / - خطأ معيار محسوب من منطقة محددة من الاهتمام لدى الفئران مما يدل على إشارة واضحة BLI في موقع الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاكليلية ثنائية الأبعاد التصوير بالرنين المغناطيسي من MPIO GB المسمى BMSC-Luc/eGFP (اللوحة اليسرى: (ط) T2 المرجحة صورة صدى تدور و (ب) T2 صدى الانحدار صورة * المرجحة) والخالي من الملصقات BMSC L-جامعة كاليفورنيا / eGFP (لوحة الحق في: (الثالث) صدى تدور T2 المرجحة صورة و (السادس) T2 صدى الانحدار صورة * المرجحة) الطعوم في مخ الفأر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصفت تحليل النسيجي للMPIO GB يزرع BMSC-Luc/eGFP في أسبوع 2 في مرحلة ما بعد الزرع. (ط) تحليل المناعي المباشر للتوطين eGFP في التعبير عن وGB ترقيع MPIO BMSC-Luc/eGFP المسمى. (ثانيا) من التفصيل التكبير العليا (ط). وصفت (ثالثا) تلطيخ مناعي للمستضد GFAP، مما يدل على تطور ندبا نجمي في المناطق المحيطة من MPIO GB BMSC-Luc/eGFP. وصفت (السادس) تلطيخ مناعي للمستضد-1 ايبا، مما يدل على الغزو والمناطق المحيطة من MPIO GB BMSC-Luc/eGFP بواسطة الخلايا الدبقية الصغيرة. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular imaging of stem cells. , (2008).</li><li>Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene-expressing+bone+marrow-derived+stromal+cells+are+immune-tolerated+following+implantation+in+the+central+nervous+system+of+syngeneic+immunocompetent+mice.">Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice.</a> BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).</li><li>Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+cellular+implants+by+the+brain's+innate+immune+system.">Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).</li><li>Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+bioluminescence+imaging+of+human+ES+cell+progeny+in+the+rodent+CNS.">Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS.</a> J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).</li><li>De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+Luciferase/eGFP-Expressing+Bone+Marrow-Derived+Stromal+Cells+with+Fluorescent+Micron-Sized+Iron+Oxide+Particles+Improves+Quantitative+and+Qualitative+Multimodal+Imaging+of+Cellular+Grafts+In+Vivo.">Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo.</a> Mol Imaging Biol. , (2011).</li><li>Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+for+the+Advancement+of+Neural+Stem+Cell+Biology+and+Transplantation+Research.">Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li><li>Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+potential+of+intravenous+neural+stem+cell+delivery+for+treatment+of+neuroinflammatory+disease+in+mice.">Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice.</a> Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging.">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+tracking+of+stem+cells+in+living+recipients.">MR tracking of stem cells in living recipients.</a> Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).</li><li>Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+magnetic+resonance+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cell+grafts+in+ischemic+rat.">Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat.</a> 17, 1282-1291 (2009).</li><li>Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+of+cancer+cell+fate+at+the+single-cell+level+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain.</a> Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).</li><li>Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).</li><li>Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+fate+of+implanted+bone+marrow+stromal+cells+labeled+with+superparamagnetic+nanoparticles.">Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).</li><li>Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transplanted+stem+cell+migration+after+a+stroke:+a+serial,+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+study.">Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study.</a> Neuroimage. 21, 311-317 (2004).</li><li>Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+labeling+of+non-phagocytic+adherent+cells+with+iron+oxide+nanoparticles:+a+comprehensive+study.">Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).</li><li>Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylated+superparamagnetic+iron+oxide+particles+label+cells+intracellularly+without+transfection+agents.">Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents.</a> Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).</li><li>Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+MR+imaging.">Cellular MR imaging.</a> Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).</li><li>Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endosomal+labeling+of+progenitor+and+stem+cells+with+large+magnetic+particles+allows+magnetic+resonance+imaging+of+single+cells.">Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells.</a> Blood. 102, 867-872 (2003).</li><li>Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+single+cells+by+MRI.">In vivo detection of single cells by MRI.</a> Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).</li><li>Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+single+particles+for+cellular+imaging.">MRI detection of single particles for cellular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).</li><li>Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+MRI+contrast+agents+on+the+stem+cell+phenotype.">Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype.</a> Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).</li><li>Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+firefly+luciferase+inhibition+by+general+anesthetics:+Gaussian+and+anisotropic+network+analyses.">Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses.</a> Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).</li><li>Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+protein+binding+of+luciferase+substrates+influences+sensitivity+and+accuracy+of+bioluminescence+imaging.">Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging.</a> Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).</li><li>Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+bioluminescence+imaging+for+quantitative+tumour+burden+assessment+using+IV+or+IP+administration+of+D:+-luciferin:+effect+on+intensity,+time+kinetics+and+repeatability+of+photon+emission.">Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).</li><li>Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2/BCRP+expression+modulates+D-Luciferin+based+bioluminescence+imaging.">ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging.</a> Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).</li><li>Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-dependent+and+cell+cycle-dependent+expression+from+a+cytomegalovirus-based+mammalian+expression+vector.">Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector.</a> Gene. 194, 115-123 (1997).</li><li>Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+DNA+methylation+and+histone+deacetylation+activate+cytomegalovirus+promoter-controlled+reporter+gene+expression+in+human+glioblastoma+cell+line+U87.">Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87.</a> Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).</li><li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression:+implications+for+stem+cell+imaging.">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li><li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter:+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy.">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li></ol>

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الأمثل لمزيج من ثلاثة طرائق التصوير التكميلية (BLI، التصوير بالرنين المغناطيسي وعلم الأنسجة) لوصف مفصل لعملية زرع الخلايا في الجهاز العصبي المركزي من الفئران المختصة المناعي. مزيج من العلامات الجينية مراسل من الخلايا، على أساس التعديل ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> فهرس العدد </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> مكون من متوسط ​​نمو الخلية CEM </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> مكون من متوسط ​​نمو الخلية CEM </td></tr><tr><td> حصان المصل </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> مكون من متوسط ​​نمو الخلية CEM </td></tr><tr><td> البنسلين، الستربتومايسين </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> مكون من متوسط ​​نمو الخلية CEM </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> مكون من متوسط ​​نمو الخلية CEM </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> نملة-PR-1 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين </tد&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> الانفجارات مختبرات </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferin </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> الكيتامين (Ketalar) </td><td> فايزر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> زيلازين (Rompun) </td><td> باير الرعاية الصحية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9٪ كلوريد الصوديوم الحل </td><td> باكستر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> ميرك </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> الدقيقة مضخة حقن </td><td> دك العلمية </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> الفوتون تصوير </td><td> Biospace مختبر </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T MR الماسح الضوئي </td><td> بروكر Biospin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 مجهر </td><td> أوليمبوس </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom جلالة ناظم البرد </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> محقنة </td><td> هاميلتون </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> 30 مقياس إبرة </td><td> هاميلتون </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> الصورة الرؤية البرمجيات </td><td> Biospace مختبر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision البرمجيات </td><td> Biospace مختبر </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5،1 البرمجيات </td><td> بروكر Biospin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> أميرة 4،0 البرمجيات </td><td> محيا التصوير </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal imaging of stem cell implantation in the central nervous system of mice

خلال العقد الماضي، وقد اكتسب زرع الخلايا الجذعية اهتماما متزايدا كما علاجيا الابتدائية أو الثانوية لمجموعة متنوعة من الأمراض، سواء في الدراسات قبل السريرية والسريرية. لكن، حتى الآن نتائج بشأن نتائج وظيفية و / أو تجديد أنسجة الخلايا الجذعية زرع التالية هي متنوعة جدا. عموما، يلاحظ وجود فائدة سريرية من دون فهم عميق لآلية الكامنة (ق) 1. ولذلك، أدت جهود متعددة لتطوير مختلف طرائق التصوير الجزيئي لرصد الخلايا الجذعية ترقيع مع الهدف النهائي لتقييم بدقة البقاء على قيد الحياة، ومصيرها وعلم وظائف الأعضاء من الخلايا الجذعية المطعمة و / أو البيئة الصغيرة الخاصة بهم. قد تكون متعلقة التغييرات الملحوظة في واحد أو أكثر من المعلمات التي تحددها التصوير الجزيئي للتأثير على سريري المرصودة. في هذا السياق، لدينا دراسات تركز على الجمع بين استخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتحليل النسيجيق لتقييم الخلايا الجذعية التطعيم. ويشيع استخدام BLI إلى غير جراحية تنفيذ تتبع ورصد خلية خلية بقاء على قيد الحياة في الوقت المناسب بعد زرع 2-7، على أساس رد الفعل البيوكيميائية حيث الخلايا التعبير عن الجينات luciferase المراسل الصحفي، هي قادرة على التفاعل ينبعث ضوء التالية مع ركيزة لها (مثل D- luciferin) 8 و 9. التصوير بالرنين المغناطيسي من ناحية أخرى هو أسلوب غير الغازية التي تنطبق سريريا (10) ويمكن استخدامها لتحديد بدقة ترقيع الخلوية مع دقة عالية جدا 11-15، على الرغم من حساسيتها يعتمد بشكل كبير على النقيض من ولدت بعد وضع العلامات الخلية مع وكيل النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي . أخيرا، بعد الوفاة تحليل النسيجي هو الأسلوب المفضل للتحقق من صحة نتائج البحوث التي تم الحصول عليها مع المنظمات غير الغازية التقنيات مع أعلى دقة وحساسية. وعلاوة على ذلك نقطة النهاية تحليل النسيجي يسمح لنا لإجراء تحليل مفصل المظهري من الخلايا المطعمة و / أو الأنسجة المحيطة بها، على درجة البكالوريوسالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على استخدام البروتينات مراسل فلوري و / أو وضع العلامات الخلية مباشرة مع أجسام مضادة محددة. وباختصار، نحن هنا شرح بصريا التكامل بين BLI، التصوير بالرنين المغناطيسي والأنسجة لكشف مختلف الخلايا الجذعية و / أو البيئة، المرتبطة بالخصائص التالية الخلايا الجذعية التطعيم في الجهاز العصبي المركزي من الفئران. كمثال على ذلك، نخاع العظام المستمدة من الخلايا اللحمية، المهندسة وراثيا للتعبير عن الأخضر نيون تعزيز البروتين (eGFP) ويراعة luciferase المراسل (fLuc)، وصفت مع الأزرق فلوري ميكرون الحجم جسيمات أكسيد الحديد (MPIOs)، سيتم زرعها في وسيتم رصد الجهاز العصبي المركزي من المناعة المختصة الفئران والنتيجة بواسطة BLI، التصوير بالرنين المغناطيسي وعلم الأنسجة (الشكل 1).

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice at JoVE.com

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

توضح هذه المقالة تسلسل الأحداث الأمثل للتصوير المتعدد الوسائط من الطعوم الخلوية في الدماغ القوارض باستخدام: (ط) في التألق الحيوي المجراة والتصوير بالرنين المغناطيسي، و (ب) تحليل التشريح النسيجي. الجمع بين هذه الطرائق التصوير على حيوان وحيد يسمح تقييم الكسب غير المشروع الخليوي مع حساسية عالية، وخصوصية القرار.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  University of Antwerp. توضح هذه المقالة تسلسل الأحداث الأمثل للتصوير المتعدد الوسائط من الطعوم الخلوية في الدماغ القوارض باستخدام: (ط) في التألق الحيوي المجراة والتصوير بالرنين المغناطيسي، و (ب) تحليل التشريح النسيجي. الجمع بين هذه الطرائق التصوير على حيوان وحيد يسمح تقييم الكسب غير ?...

Video: Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

العصب البصري Transection : نموذج من موت الخلايا المبرمج الخلية العصبية الكبار في الجهاز العصبي المركزي

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

في الموقع الكالسيوم 2+ التصوير من الجهاز العصبي المعوي

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...