<p class="jove_content"&gt; O trabalho do autor foi apoiado por bolsa de investigação-ID BOF 2006 da Universidade de Antuérpia (concedido a PPO e AVdL), pela bolsa de investigação G.0136.11 e G.0130.11 (concedido a AVdL, ZB e PPO) e 1.5.021.09. N.00 (concedido a PPO) do Fundo de Pesquisa Científica-Flanders (FWO-Vlaanderen, Bélgica), pela SBO bolsa de investigação IWT-60838: BRAINSTIM do Instituto Flamengo para a Ciência e Tecnologia (concedida a ZB e AVDL), em parte de uma pesquisa Methusalem concessão do governo flamengo (concedido a ZB), em parte, pela EC-FP6-NoE DIMI (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) , e pelo Inter Universidade atração poloneses IUAP-NIMI-P6/38 (concedido a AVDL). Nathalie De Vocht tem um PhD bolsa de estudo a partir do FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts é um pós-doutorado da FWO-Vlaanderen.</p

1. Preparação de células <ol><li> Experiências deve ser iniciada usando ex vivo populações de células-tronco cultivadas geneticamente modificadas para expressar as proteínas repórter da luciferase e EGFP. Aqui usamos luciferase / eGFP-expressam murinos derivadas da medula óssea (células estromais BMSC-Luc/eGFP) como anteriormente descrito por Bergwerf et al. 2, 5. </li><li> Dois dias antes de marcação celular, as células BMSC-Luc/eGFP em placas a uma densidade de 8 x 10 células por 5 T75 frasco de cultura em meio de expansão 15 ml completo (CEM) suplementado com 1 ug / ml Puromycine. </li><li> Permitir que as células a crescer durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Adicionar 5 x 10 6 Glacial azul micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (GB MPIO) por ml de meio de cultura para a cultura de células em crescimento (total: 75 x 10 6 partículas por meio de cultura 15 ml em um frasco de cultura T75). </li><li> Incubar durante 16 horas para permitir a captação de partículas através de endocitose. </li><li> Lavar as partículas restantese permitir que as células crescer durante uma hora adicional 24 para obter uma distribuição de células de confluência e homogénea da MPIO GB. </li><li> Validate captação de partículas visualmente usando microscopia de fluorescência através da contagem do rácio de EGFP + e MPIO GB + de células para a quantidade total de EGFP + de células. </li><li> Lavar as células GB MPIO-rotulados BMSC-Luc/eGFP duas vezes com 10 ml de PBS e as células de colheita sequência de tripsina-EDTA tratamento (5 ml por frasco de cultura T75, durante 5 minutos). </li><li> Lave as células colhidas e ressuspender em concentração final de 133 x 10 6 células / ml em PBS. </li><li> Manter as células em gelo até ao transplante. </li></ol> 2. Implantação de células no SNC de Ratos <ol><li> Anestesiar ratinhos por uma injecção intraperitoneal de uma cetamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) mistura. </li><li> Aguarde 5 minutos para permitir que os ratos para adormecer. </li><li> Raspar a cabeça de rato para permitir manipulações estéreis. </li><li> Posicione o mouse em um quadro estereotáxico. </li><li> Desinfectares aa pele e os olhos molhado dos ratinhos para evitar a desidratação. </li><li> Fazer uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio, e perfurar um orifício no crânio utilizando uma broca dental rebarba nas coordenadas dada: 2 mm posterior e 2 mm lateral à bregma. </li><li> Vórtice da suspensão de células de forma breve e aspirar a suspensão de células na seringa. </li><li> Coloque a agulha da seringa, a uma profundidade de 2,5 mm sob a dura-máter e permitir que o equilíbrio de pressão durante 1 minuto. </li><li> Injectar uma suspensão de células 3 ul (4 x 10 5 células) a uma profundidade de 2 mm sob a dura-máter e com uma velocidade de 0,70 ul / min utilizando uma bomba de injecção de micro-automatizado. </li><li> Esperar por um período adicional de 5 minutos, para evitar o refluxo da suspensão de células injectadas. </li><li> Lentamente, retirar a agulha e desinfectar as fronteiras da pele antes da sutura da pele. </li><li> Injectar 300 solução de NaCl a 0,9% uL por via subcutânea, a fim de evitar a desidratação, e colocar o rato sob uma lâmpada de aquecimento para recuperar da anestesia. Administrar post-operatório analgésico em conformidade com as normas institucionais. </li></ol> 3. Na bioluminescência in vivo <ol><li> Anestesiar os ratos por uma mistura de 3% de isoflurano e oxigénio. </li><li> Coloque os ratos no Imager Photon e reduzir o nível de anestesia para 1,5%, isoflurano e oxigênio. </li><li> Injectar 150 mg de D-luciferina por kg de peso corporal por via intravenosa. </li><li> Adquirir imagem por 5 minutos, utilizando o software Vision Photo. </li><li> Executar o processamento de imagem usando o software M3vision. Quantificar o sinal observado utilizando regiões de juro fixa. </li></ol> 4. Em Ressonância Magnética vivo <ol><li> Anestesiar os ratos com 3% de isoflurano em uma mistura de O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Colocar os ratinhos no limitador de um sistema horizontal MR 9.4T e reduzir a anestesia nível de 1% de isoflurano em uma mistura de O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Molhe os olhos dos camundongos para evitar desidrataçãoção, anexar uma sonda rectal de controlar a temperatura do corpo e monitorar a taxa de respiração pela colocação de um sensor de baixo da barriga do rato. </li><li> Manter a taxa de respiração em 110 ± 10 respirações por minuto e manter a temperatura corporal constante dentro de uma estreita faixa de 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Coloque a bobina RF superfície sobre a parte superior da cabeça do rato e da posição do rato no meio do magneto. </li><li> Adquirir um conjunto de 10 coronais ponderadas em T2 spin-eco (SE) imagens para obter informações anatômica específica e T2 * ponderadas gradiente eco (GE) imagens, a fim de estudar a migração de células-tronco com uma resolução no plano de 70 mM 2. Definir parâmetros de seqüência da seguinte forma: tempo de repetição (TR): 500 ms, tempo de eco (TE): 8 ms (seqüência GE) e tempo de repetição (TR): 4200 ms, tempo de eco (TE): 12,16 ms (SE seqüência); campo de visão (FOV): 18x18 mm 2, matriz: 256x256, 1 fatia de espessura mm e 1 fatia de separação mm (Paravision software 5.1). </li><li> Realizar o processamento de dadosusando software Amira 4,0. </li></ol> 5. Post Mortem Histologia <ol><li> Anestesiar os ratos muito profundamente por inalação de um oxigénio isofluorano (4%), (0,5 L / min) e azoto (1 l / min) a mistura durante 2 minutos. Sacrifício dos camundongos por deslocamento cervical. </li><li> Remover o cérebro do rato a partir do crânio e fixar o tecido cerebral em paraformaldeído a 4% em PBS durante 2 horas. </li><li> Desidratar o tecido do cérebro, colocando o cérebro, posteriormente, em diferentes gradientes de sacarose: 2 h em sacarose a 5% em PBS, 2 horas em 10% de sacarose em PBS, durante a noite em sacarose a 20% em PBS. </li><li> Congelar o tecido do cérebro utilizando azoto líquido e armazenar o tecido à temperatura de -80 ° C até seccionamento. </li><li> Seção tecido do cérebro em 10 mM de espessura, utilizando um criostato. </li><li> Tela unstained criossecções para a fluorescência azul a partir das partículas GB MPIO e fluorescência verde a partir das células que expressam EGFP usando um microscópio de fluorescência. </li><li> Tela imaculada criosecções paraverde / vermelho fluorescência de fundo a partir de células inflamatórias. </li><li> Realizar colorações mais imuno-histoquímica e imunofluorescência para identificar populações de células endógenas (por exemplo, a microglia, astrócitos, células T, ...) que interagem com enxertos celulares. </li></ol> 6. Os resultados representativos Nós aqui apresentadas visualmente uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal sucesso da luciferase / eGFP expressar-populações (caule) de células no sistema nervoso central de camundongos. Na primeira, os descritos GB MPIO resultados de rotulagem procedimento em rotulagem altamente eficiente de células BMSC-Luc/eGFP, que podem facilmente ser validados utilizando microscopia de fluorescência (Figura 2A). Em seguida, mediante enxerto de GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP no SNC de ratinhos, a sobrevivência do enxerto celular pode ser monitorizada por in vivo BLI com base na actividade da luciferase (Figura 2B). Além disso, a localização exacta das células enxertadas pode ser monitorizada por in vivo </em&gt; RM com base no teor de ferro do MPIO GB (Figura 2C). Finalmente, a análise histológica permite a validação dos resultados obtidos por BLI e RM. Sobrevivência estável foi confirmada por uma expressão eGFP estável no tempo (Figura 2D). Para isso, colocalização de EGFP-expressando células com azul fluorescente MPIO permite a determinação exacta da localização e sobrevivência das células transplantadas. Além disso, este rotulagem dupla fluorescente das células-tronco reduz a possibilidade de observar resultados falsos positivos baseados em fluorescência de fundo criado por células inflamatórias 5. <img alt="Figura 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> Figura 1. Visão geral da seqüência de manipulação <ol class="lroman"><li> Marcação celular: BMSC-Luc/eGFP são rotulados com 5 x 10 6 partículas GB MPIO por ml de meio de cultura. Após 16 hr de incubação e um período de repouso seguinte de 24 horas, as células são colhidas paraimplante intracerebral. </li><li> Implante de células: GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP são enxertados no cérebro do rato nas coordenadas seguinte: bregma -2 mm, 2 mm direita da linha média e 2 mm sob dura. </li><li> In vivo BLI: administração intravenosa de 150 mg D-luciferin/kg peso corporal, a luz gerada foi adquirida durante 5 minutos usando o Imager Photon. </li><li> In vivo RM: Um conjunto de 10 coronais ponderadas em T2 spin-eco (SE) imagens e T2 * ponderadas gradiente eco (GE) imagens com uma resolução no plano de 70 mM 2 foram adquiridos. Parâmetros de sequência foram as seguintes: tempo de repetição (TR): 500 ms, tempo de eco (TE): 8 ms (sequência GE) e tempo de repetição (TR): 4200 ms, tempo de eco (TE): 12,16 ms (sequência SE); campo de visão (FOV): 18x18 mm 2, matriz: 256x256, 1 fatia de espessura mm e 1 fatia de separação mm. </li><li> Post-mortem histologia: cryosection espessura 10μm foram selecionados para eGFP expressar e azul fluorescente etiquetado BMSC ucantar um microscópio de fluorescência. </li></ol><img alt="Figura 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> Figura 2. Imagem Multimodal de enxertos de células-tronco <ol class="ualpha"><li> Microscopia de imunofluorescência direta da Glacial azul (GB) MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP. </li><li> In vivo BLI de camundongos injetados com 4x10 5 GB MPIO rotulado células BMSC-Luc/eGFP na semana 1 e semana 2 após a implantação. A análise estatística dos sinais detectados BLI na semana 1 e semana 2 pós-implantação. Os dados são expressos como o número médio de fotões por segundo por esterradiano por centímetro quadrado (pH / s / SR / cm 2) a partir de um período de tempo 5 minutos + / - erro padrão calculados a partir de uma região de interesse fixa em ratinhos apresentando um sinal claro BLI no local da injecção. </li><li> Coronal bidimensional de ressonância magnética GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP (painel da esquerda: (i) ponderação T2 spin echo e (ii) T2 *-weighted imagem eco gradiente) e sem rótulo BMSC-LUC / eGFP (painel da direita: (iii) ponderação T2 spin echo e (vi) T2 *-weighted imagem eco gradiente) enxertos em cérebro de camundongo. </li><li> A análise histológica do MPIO GB rotulado implantes BMSC-Luc/eGFP na semana 2 pós-implantação. (I) a análise de imunofluorescência directa para a localização de EGFP-expressar e MPIO GB enxertos BMSC-Luc/eGFP rotulados. (Ii) detalhe ampliação elevada de (i). (Iii) coloração imunofluorescente para o antigénio GFAP, indicando o desenvolvimento de tecido cicatricial no astrocítica circundante de GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP. (Vi) coloração de imunofluorescência para Iba-1 antígeno, indicando a invasão e ao redor da GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP por microglia. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular imaging of stem cells. , (2008).</li><li>Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene-expressing+bone+marrow-derived+stromal+cells+are+immune-tolerated+following+implantation+in+the+central+nervous+system+of+syngeneic+immunocompetent+mice.">Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice.</a> BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).</li><li>Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+cellular+implants+by+the+brain's+innate+immune+system.">Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).</li><li>Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+bioluminescence+imaging+of+human+ES+cell+progeny+in+the+rodent+CNS.">Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS.</a> J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).</li><li>De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+Luciferase/eGFP-Expressing+Bone+Marrow-Derived+Stromal+Cells+with+Fluorescent+Micron-Sized+Iron+Oxide+Particles+Improves+Quantitative+and+Qualitative+Multimodal+Imaging+of+Cellular+Grafts+In+Vivo.">Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo.</a> Mol Imaging Biol. , (2011).</li><li>Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+for+the+Advancement+of+Neural+Stem+Cell+Biology+and+Transplantation+Research.">Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li><li>Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+potential+of+intravenous+neural+stem+cell+delivery+for+treatment+of+neuroinflammatory+disease+in+mice.">Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice.</a> Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging.">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+tracking+of+stem+cells+in+living+recipients.">MR tracking of stem cells in living recipients.</a> Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).</li><li>Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+magnetic+resonance+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cell+grafts+in+ischemic+rat.">Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat.</a> 17, 1282-1291 (2009).</li><li>Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+of+cancer+cell+fate+at+the+single-cell+level+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain.</a> Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).</li><li>Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).</li><li>Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+fate+of+implanted+bone+marrow+stromal+cells+labeled+with+superparamagnetic+nanoparticles.">Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).</li><li>Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transplanted+stem+cell+migration+after+a+stroke:+a+serial,+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+study.">Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study.</a> Neuroimage. 21, 311-317 (2004).</li><li>Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+labeling+of+non-phagocytic+adherent+cells+with+iron+oxide+nanoparticles:+a+comprehensive+study.">Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).</li><li>Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylated+superparamagnetic+iron+oxide+particles+label+cells+intracellularly+without+transfection+agents.">Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents.</a> Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).</li><li>Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+MR+imaging.">Cellular MR imaging.</a> Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).</li><li>Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endosomal+labeling+of+progenitor+and+stem+cells+with+large+magnetic+particles+allows+magnetic+resonance+imaging+of+single+cells.">Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells.</a> Blood. 102, 867-872 (2003).</li><li>Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+single+cells+by+MRI.">In vivo detection of single cells by MRI.</a> Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).</li><li>Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+single+particles+for+cellular+imaging.">MRI detection of single particles for cellular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).</li><li>Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+MRI+contrast+agents+on+the+stem+cell+phenotype.">Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype.</a> Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).</li><li>Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+firefly+luciferase+inhibition+by+general+anesthetics:+Gaussian+and+anisotropic+network+analyses.">Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses.</a> Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).</li><li>Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+protein+binding+of+luciferase+substrates+influences+sensitivity+and+accuracy+of+bioluminescence+imaging.">Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging.</a> Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).</li><li>Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+bioluminescence+imaging+for+quantitative+tumour+burden+assessment+using+IV+or+IP+administration+of+D:+-luciferin:+effect+on+intensity,+time+kinetics+and+repeatability+of+photon+emission.">Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).</li><li>Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2/BCRP+expression+modulates+D-Luciferin+based+bioluminescence+imaging.">ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging.</a> Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).</li><li>Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-dependent+and+cell+cycle-dependent+expression+from+a+cytomegalovirus-based+mammalian+expression+vector.">Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector.</a> Gene. 194, 115-123 (1997).</li><li>Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+DNA+methylation+and+histone+deacetylation+activate+cytomegalovirus+promoter-controlled+reporter+gene+expression+in+human+glioblastoma+cell+line+U87.">Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87.</a> Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).</li><li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression:+implications+for+stem+cell+imaging.">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li><li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter:+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy.">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li></ol>

Os autores declaram nenhum conflito de interesse.

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para a combinação de três modalidades de imagem complementares (BLI, ressonância magnética e histologia) para a caracterização detalhada dos implantes celulares no sistema nervoso central de camundongos imunes competentes. Uma combinação de rotulagem de gene repórter de células, com base na modificação genética com os genes repórter luciferase do pirilampo e EGFP, e uma célula de rotulagem directa com a GB MPIO, conduz a uma avaliação precisa de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> Componente do CEM meio de crescimento celular </td></tr><tr><td> Soro fetal de bovino </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> Componente do CEM meio de crescimento celular </td></tr><tr><td> De soro de cavalo </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> Componente do CEM meio de crescimento celular </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> Componente do CEM meio de crescimento celular </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> Componente do CEM meio de crescimento celular </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> formiga-pr-1 </td><td></td></tr><tr><td> tripsina </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> Bangs Laboratories </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferina </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> De cetamina (Ketalar) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xilazina (Rompun) </td><td> Bayer Os cuidados de saúde </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de solução de NaCl </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> paraformaldeído </td><td> Merck </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> sacarose </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-injecção de bomba </td><td> KD científica </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> Photon imager </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T scanner de MR </td><td> Bruker BioSpin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 microscópio </td><td> Olimpo </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HM criostato </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> seringa </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Agulha de calibre 30 </td><td> Hamilton </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Foto Visão software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision software 5,1 </td><td> Bruker BioSpin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amira 4,0 software </td><td> Imagem Visage </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal imaging of stem cell implantation in the central nervous system of mice

Durante a última década, o transplante de células estaminais ganhou interesse crescente como primário ou secundário modalidade terapêutica para uma variedade de doenças, tanto em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, até à data resultados referentes resultado funcional e / ou tecido regeneração transplante de células estaminais seguinte são bastante diversos. Geralmente, um benefício clínico é observado sem uma profunda compreensão do mecanismo subjacente (s) 1. Portanto, os esforços têm múltiplas levou ao desenvolvimento de diferentes modalidades de imagens moleculares para monitorar enxerto de células-tronco com o objectivo último para avaliar com precisão o destino, sobrevivência e fisiologia de células estaminais enxertados e / ou do seu ambiente de micro-. Alterações observadas em um ou mais parâmetros determinados por imagem molecular pode estar relacionado com o efeito observado clínica. Neste contexto, os nossos estudos focalizam o uso combinado de imagem de bioluminescência (BLI), ressonância magnética (MRI) e Analysi histológicas para avaliar células estaminais do miocárdio. BLI é normalmente usado para executar de forma não invasiva de rastreamento de células e monitorar a sobrevivência das células no tempo após o transplante de 2-7, com base numa reacção bioquímica onde as células expressando o gene repórter da luciferase-são capazes de emitir luz interacção seguinte com o seu substrato (por exemplo, D- luciferina) 8, 9. RM, por outro lado é uma técnica não-invasivo que é clinicamente aplicável 10 e pode ser usado para localizar precisamente os enxertos celulares com resolução muito elevada 11-15, embora a sua sensibilidade altamente depende do contraste gerado após marcação das células com um agente de contraste para IRM . Finalmente, post-mortem análise histológica é o método de escolha para validar os resultados de pesquisa obtidos com técnicas não-invasivas com maior resolução e sensibilidade. Além disso end-point análise histológica nos permite realizar uma análise detalhada fenotípica das células enxertadas e / ou tecido circundante, based sobre a utilização de proteínas repórter fluorescentes e / ou rotulagem célula directa com anticorpos específicos. Em resumo, estamos aqui visualmente demonstrar a complementaridade de BLI, ressonância magnética e histologia para desvendar células-tronco e diferente / ou meio ambiente associada seguintes características de células-tronco de enxerto no sistema nervoso central de camundongos. Como um exemplo, derivadas da medula óssea células estromais, geneticamente modificados para expressar o reforço de Proteína Fluorescente Verde (eGFP) e luciferase do pirilampo (FLUC), e marcadas com azul fluorescentes micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (MPIOs), vai ser enxertados na SNC de camundongos imuno-competentes e os resultados serão monitorados por BLI, ressonância magnética e histologia (Figura 1).

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice at JoVE.com

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K visualizações.  University of Antwerp. Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.