<p class="jove_content"&gt; פעילות מחברים נתמך על ידי מענק מחקר ID-BOF 2006 של אוניברסיטת אנטוורפן (שניתן PPO ו AVdL), על ידי מענק מחקר G.0136.11 ו G.0130.11 (שניתן AVdL, צ&quot;ב ו - PPO) ו 1.5.021.09. N.00 (שניתן PPO) של הקרן למטרות מחקר מדעי, פלנדריה (FWO-פלנדריה, בלגיה), על ידי SBO מענק מחקר IWT-60838: BRAINSTIM של המכון הפלמי מדע וטכנולוגיה (שניתן צ&quot;ב ו AVDL), ב בחלקו על ידי מענק מחקר Methusalem מהממשלה הפלמית (שניתן צ&quot;ב), בין השאר על ידי EC-FP6-נואי דימי (LSHB-CT-2005-512146), EC-FP6-נואי אמיל (LSHC-CT-2004-503569) , ועל ידי אינטר אוניברסיטת המשיכה פולנים IUAP-NIMI-P6/38 (שניתן AVDL). נטלי דה Vocht בעל תואר דוקטור מ-studentship FWO-פלנדריה. פיטר Ponsaerts הוא עמית פוסט דוקטורט של FWO-פלנדריה.</p

1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים יש ליזום שימוש בתרבית לשעבר ב vivo לתאי גזע אוכלוסיות מהונדסים גנטית כדי לבטא את החלבונים הכתב בלוציפראז ו eGFP. כאן אנו משתמשים בלוציפראז / eGFP-לבטא Murine מח עצם שמקורם בתאי סטרומה (BMSC-Luc/eGFP) כפי שתואר קודם לכן על ידי Bergwerf et al. 2, 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומיים לפני סימון התא, BMSC-Luc/eGFP תאים צלחת בצפיפות של 8 x 10 5 תאים לכל בקבוק T75 התרבות ב 15 מ&quot;ל בינוני שלם הרחבה (CEM) בתוספת 1 ​​מיקרוגרם / מ&quot;ל Puromycine. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לתאים לגדול במשך שעה 48 על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 x 10 6 קרחוני כחול מיקרון בגודל תחמוצת ברזל חלקיקים (GB MPIO) לכל מ&quot;ל בינוני מתרבות לתרבות התא גדל (סה&quot;כ: 75 x 10 6 בינוני 15 חלקיקים לכל תרבות מ&quot;ל בבקבוק T75 התרבות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 16 שעות על מנת לאפשר ספיגת החלקיקים באמצעות אנדוציטוזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את החלקיקים שנותרוולאפשר לתאים לגדול במשך שעה 24 נוסף כדי להשיג חלוקת התא confluency והומוגני של MPIO GB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמת את ספיגת החלקיקים ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי ספירת היחס בין eGFP + ו GB MPIO + תאים לסכום כולל של eGFP + תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי גיגבייט MPIO, שכותרתו תאים BMSC-Luc/eGFP פעמיים עם 10 מ&quot;ל PBS ותאי הקציר לאחר טריפסין-EDTA טיפול (5 מ&quot;ל לכל בקבוק T75 התרבות במשך 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים נקצרו resuspend בריכוז הסופי של 133 x 10 6 תאים למ&quot;ל ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים על הקרח עד להשתלה. </li></ol> 2. תא השרשה של מערכת העצבים המרכזית של עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכברים בזריקה intraperitoneal של קטמין (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) + xylazine (16 מ&quot;ג / ק&quot;ג) תערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן 5 דקות כדי לאפשר עכברים להירדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הראש העכבר כדי לאפשר מניפולציות סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר בתוך מסגרת stereotactic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desinfectהעור רטוב בעיני העכברים כדי למנוע התייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בקרקפת קו האמצע לחשוף את הגולגולת, לקדוח חור בגולגולת באמצעות תרגיל בר שיניים על קואורדינטות נתון: 2 מ&quot;מ אחורי ו 2 מ&quot;מ לרוחב גבחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערבולת ההשעיה התא קצרות לשאוב ההשעיה תא המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את המחט במזרק בעומק של 2.5 מ&quot;מ מתחת דורה ולאפשר איזון הלחץ במשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק תרחיף תאים μl 3 (4 x 10 5 תאים) בעומק של 2 מ&quot;מ מתחת דורא במהירות של μl 0.70 / min באמצעות משאבה אוטומטית הזרקת מיקרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמתין כ 5 דקות נוספות כדי למנוע backflow ההשעיה התא שהוחדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט חוזר בי את המחט ולחטא את גבולות העור לפני תפירת העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 300 μl פתרון NaCl 0.9% מתחת לעור על מנת למנוע התייבשות, ומניחים את העכבר תחת מנורת חימום להתאושש מן ההרדמה. ניהול עמ &#39;ost הניתוח כאבים בהתאם לתקני מוסדיים. </li></ol> 3. ב ביולומינציה vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכברים על ידי תערובת של 3% isoflurane וחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכברים Imager פוטון ולהפחית את רמת ההרדמה ל -1.5% isoflurane וחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 150 מ&quot;ג D-luciferin לכל ק&quot;ג ממשקל הגוף דרך הווריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכישת התמונה במשך 5 דקות באמצעות תוכנת Vision התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עיבוד תמונה באמצעות תוכנת M3vision. לכמת את האות הנצפית באמצעות אזורים קבועים של עניין. </li></ol> 4. בתחום ההדמיה vivo תהודה מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכברים עם 3% isoflurane בתערובת של O 2: N 2 O (03:07). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עכברים עוצר של מערכת אופקית MR 9.4T ולהפחית את רמת הרדמה% 1 isoflurane בתערובת של O 2: N 2 O (03:07). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב את העיניים של העכברים כדי למנוע dehydration, חבר בדיקה רקטלית כדי לפקח על טמפרטורת הגוף ולעקוב אחר קצב הנשימה על ידי הצבת חיישן מתחת לבטן העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על קצב הנשימה של 110 ± 10 נשימות בדקה ולשמור על חום גוף קבוע בטווח צר של 37 ± 0.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את משטח RF סליל על הראש העכבר ומיקום העכבר במרכז המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש סט של 10 העטרה T2 משוקלל הד ספין (SE) תמונות כדי לקבל מידע אנטומי ספציפי ו-T2 * משוקלל הדרגתיים הד (GE) תמונות כדי ללמוד התא הגירה גזע עם רזולוציה ב-מטוס של 70 מיקרומטר 2. הגדרת פרמטרים רצף כדלקמן: זמן החזרה (TR): 500 MS זמן, הד (TE): 8 MS (רצף GE) וזמן החזרה (TR): 4200 שניה, הפעם הד (TE): 12.16 ms (SE ברצף); שדה הראייה (FOV): 18x18 מ&quot;מ 2, מטריקס: 256x256, 1 פרוסת מ&quot;מ עובי 1 מ&quot;מ ההפרדה פרוסה (פאראוויזיון 5.1 תוכנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע עיבוד נתוניםבאמצעות תוכנה עמירה 4.0. </li></ol> 5. פוסט מורטם היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטשטש את העכברים מאוד עמוקות שאיפה של חמצן isofluorane (4%), (0.5 ליטר / דקה) וחנקן (1 L / min) התערובת במשך 2 דקות. להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המוח העכבר מן הגולגולת לקבע את רקמת המוח paraformaldehyde 4% ב PBS במשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את רקמת המוח על ידי הנחת המוח לאחר מכן הדרגתיים שונים של סוכרוז: 2 שעות של סוכרוז 5% ב PBS, 2 שעות של סוכרוז 10% PBS, לילה סוכרוז 20% ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת רקמת המוח באמצעות חנקן נוזלי ולאחסן את הרקמה ב -80 ° C עד אחד בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיף המוח רקמת ב 10 חלקים עבים מיקרומטר באמצעות cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך cryosections בלא כתם כחול על הקרינה מן חלקיקים MPIO GB ו פלואורסצנטי ירוק את התאים המבטאים eGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך בלא כתם cryosections עבורירוק / אדום רקע הקרינה של תאים דלקתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע stainings immunohistochemical נוסף immunofluorescent לזהות אוכלוסיות תאים פנימיים (למשל microglia, האסטרוציטים, התאים T, ...) אינטראקציה עם שתלי סלולריים. </li></ol> 6. נציג תוצאות אנחנו כאן הציג ראייה רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal מוצלח של בלוציפראז / eGFP-לבטא (גזע) אוכלוסיות תאים של מערכת העצבים המרכזית של עכברים. בתחילה, תיאר את הליך גיגבייט MPIO תיוג תוצאות תיוג היעילה ביותר של תאים BMSC-Luc/eGFP, אשר יכול בקלות להיות מאומת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2 א). לאחר מכן, על השתלת של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP את מערכת העצבים המרכזית של עכברים, ההישרדות של השתל הסלולר יכול להיות פיקוח על ידי in vivo BLI מבוסס על פעילות בלוציפראז (2B איור). בנוסף, איתור מדויק של תאים מורכבים יכול להיות פיקוח על ידי in vivo </em&gt; MRI מבוסס על תוכן הברזל של MPIO GB (איור 2 ג). לבסוף, ניתוח היסטולוגית מאפשר אימות של התוצאות שהושגו על ידי BLI ו-MRI. הישרדות יציבה אושרה על ידי ביטוי eGFP יציבה בזמן (איור 2 ד). לשם כך, colocalization של eGFP-להביע תאים עם כחול ניאון MPIO מאפשר להגדרה המדויקת של לוקליזציה ההישרדות של תאים מורכבים. בנוסף, זה תיוג ניאון כפולה של בתאי גזע מקטין את האפשרות לצפות לתוצאות חיוביות שגויות המבוססות על הקרינה רקע נוצר על ידי תאים דלקתיים 5. <img alt="באיור 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> באיור 1. סקירת רצף הטיפול <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נייד: BMSC-Luc/eGFP מסומנים עם 5 x 10 6 חלקיקים גיגבייט MPIO בכל מדיום תרבות מ&quot;ל. אחרי 16 שעות של דגירה ועל תקופת מנוחה הבאה של 24 שעות, התאים נקצרים עבורintracerebral ההשתלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתלת תאים: GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP הם מורכבים במוח העכבר על נקודות הציון הבאות: גבחת -2 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ ימינה של קו האמצע ו - 2 מ&quot;מ מתחת דורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> In vivo BLI: עירוי לוריד להלן של 150 מ&quot;ג D-luciferin/kg משקל הגוף, האור שנוצר נרכשה במהלך 5 דקות באמצעות Imager פוטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> In vivo MRI: סט של 10 העטרה T2 משוקלל הד ספין (SE) תמונות ו-T2 * משוקלל הד שיפוע (GE) תמונות ברזולוציה של מטוס של 70 מיקרומטר 2 נרכשו. פרמטרים רצף היו: זמן החזרה (TR): 500 MS זמן, הד (TE): 8 MS (רצף GE) וזמן החזרה (TR): 4200 שניה, הפעם הד (TE): 12.16 ms (רצף SE); שדה הראייה (FOV): 18x18 מ&quot;מ 2, מטריקס: 256x256, 1 פרוסת מ&quot;מ עובי 1 מ&quot;מ ההפרדה פרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט מורטם היסטולוגיה: cryosection עבה 10μm הוקרנו eGFP להביע וכחול שכותרתו fluorescently BMSC uלשיר מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li></ol><img alt="איור 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> 2. איור multimodal הדמיה של שתלי בתאי גזע <ol class="ualpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופיה immunofluorescence ישירה של קרחוני כחול (GB) MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> In vivo BLI של עכברים שהוזרק עם 4x10 5 GB MPIO שכותרתו תאים BMSC-Luc/eGFP בשבוע 1 ו 2 שבוע לאחר ההשתלה. ניתוח סטטיסטי של אותות BLI שהתגלו בשבוע 1 ו - 2 בשבוע שלאחר ההשתלה. הנתונים באים לידי ביטוי כמספר הממוצע של פוטונים לשנייה לכל steradian לסנטימטר מרובע (pH / S / SR / cm 2) מהתקופה זמן 5 דקות + / - סטיית התקן המחושבת מאזור קבוע עניין בעכברים מראה איתות ברור BLI במקום ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העטרה דו מימדי MRI של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP (לוח לשמאל: (i) T2 משוקלל הד ספין התמונה (ב) T2 * משוקלל הד תמונת צבע) ו-L ללא תווית BMSCמאוניברסיטת קליפורניה / eGFP (הפאנל הימני: (ג) T2 משוקלל הד ספין התמונה (ו &#39;) T2 * משוקלל הד דימוי שיפוע) שתלי במוח העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח היסטולוגית של GB MPIO שכותרתו שתלים BMSC-Luc/eGFP 2 בשבוע שלאחר ההשתלה. (א) ניתוח immunofluorescence ישיר לוקליזציה של eGFP-לבטא ו GB שתלי MPIO BMSC-Luc/eGFP שכותרתו. (ב) הגדלה פירוט גבוהה של (אני). (Iii) מכתים Immunofluorescent עבור אנטיגן GFAP, המציין את התפתחותה astrocytic ב המקיף של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP. (Vi) מכתים Immunofluorescent עבור אנטיגן-1 איבא, המציין את הפלישה והסביבה של GB MPIO שכותרתו BMSC-Luc/eGFP ידי microglia. </li></ol>

<ol>
	<li>Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular imaging of stem cells. , (2008).</li><li>Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene-expressing+bone+marrow-derived+stromal+cells+are+immune-tolerated+following+implantation+in+the+central+nervous+system+of+syngeneic+immunocompetent+mice.">Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice.</a> BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).</li><li>Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+cellular+implants+by+the+brain's+innate+immune+system.">Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).</li><li>Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+bioluminescence+imaging+of+human+ES+cell+progeny+in+the+rodent+CNS.">Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS.</a> J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).</li><li>De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+Luciferase/eGFP-Expressing+Bone+Marrow-Derived+Stromal+Cells+with+Fluorescent+Micron-Sized+Iron+Oxide+Particles+Improves+Quantitative+and+Qualitative+Multimodal+Imaging+of+Cellular+Grafts+In+Vivo.">Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo.</a> Mol Imaging Biol. , (2011).</li><li>Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+for+the+Advancement+of+Neural+Stem+Cell+Biology+and+Transplantation+Research.">Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li><li>Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+potential+of+intravenous+neural+stem+cell+delivery+for+treatment+of+neuroinflammatory+disease+in+mice.">Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice.</a> Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging.">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+tracking+of+stem+cells+in+living+recipients.">MR tracking of stem cells in living recipients.</a> Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).</li><li>Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+magnetic+resonance+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cell+grafts+in+ischemic+rat.">Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat.</a> 17, 1282-1291 (2009).</li><li>Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+of+cancer+cell+fate+at+the+single-cell+level+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain.</a> Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).</li><li>Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).</li><li>Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+fate+of+implanted+bone+marrow+stromal+cells+labeled+with+superparamagnetic+nanoparticles.">Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).</li><li>Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transplanted+stem+cell+migration+after+a+stroke:+a+serial,+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+study.">Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study.</a> Neuroimage. 21, 311-317 (2004).</li><li>Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+labeling+of+non-phagocytic+adherent+cells+with+iron+oxide+nanoparticles:+a+comprehensive+study.">Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).</li><li>Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylated+superparamagnetic+iron+oxide+particles+label+cells+intracellularly+without+transfection+agents.">Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents.</a> Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).</li><li>Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+MR+imaging.">Cellular MR imaging.</a> Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).</li><li>Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endosomal+labeling+of+progenitor+and+stem+cells+with+large+magnetic+particles+allows+magnetic+resonance+imaging+of+single+cells.">Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells.</a> Blood. 102, 867-872 (2003).</li><li>Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+single+cells+by+MRI.">In vivo detection of single cells by MRI.</a> Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).</li><li>Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+single+particles+for+cellular+imaging.">MRI detection of single particles for cellular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).</li><li>Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+MRI+contrast+agents+on+the+stem+cell+phenotype.">Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype.</a> Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).</li><li>Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+firefly+luciferase+inhibition+by+general+anesthetics:+Gaussian+and+anisotropic+network+analyses.">Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses.</a> Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).</li><li>Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+protein+binding+of+luciferase+substrates+influences+sensitivity+and+accuracy+of+bioluminescence+imaging.">Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging.</a> Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).</li><li>Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+bioluminescence+imaging+for+quantitative+tumour+burden+assessment+using+IV+or+IP+administration+of+D:+-luciferin:+effect+on+intensity,+time+kinetics+and+repeatability+of+photon+emission.">Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).</li><li>Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2/BCRP+expression+modulates+D-Luciferin+based+bioluminescence+imaging.">ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging.</a> Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).</li><li>Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-dependent+and+cell+cycle-dependent+expression+from+a+cytomegalovirus-based+mammalian+expression+vector.">Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector.</a> Gene. 194, 115-123 (1997).</li><li>Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+DNA+methylation+and+histone+deacetylation+activate+cytomegalovirus+promoter-controlled+reporter+gene+expression+in+human+glioblastoma+cell+line+U87.">Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87.</a> Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).</li><li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression:+implications+for+stem+cell+imaging.">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li><li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter:+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy.">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li></ol>

החוקרים מצהירים שום ניגוד עניינים.

בדו&quot;ח זה, אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור שילוב של שלוש שיטות הדמיה משלימים (BLI, MRI ו היסטולוגיה) לאפיון מפורט של שתלים הסלולר את מערכת העצבים המרכזית של עכברים המוסמכות החיסונית. שילוב של תיוג כתב הגן של תאים, המבוססת על הנדסה גנטית עם גנים הכתב גחלילית בלוציפר...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> רכיב של CEM צמיחת תאים בינוני </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברית </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> רכיב של CEM צמיחת תאים בינוני </td></tr><tr><td> סוס סרום </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> רכיב של CEM צמיחת תאים בינוני </td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> רכיב של CEM צמיחת תאים בינוני </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> רכיב של CEM צמיחת תאים בינוני </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> הנמלה-PR-1 </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </tד&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> פוני מעבדות </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferin </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> קטמין (Ketalar) </td><td> פייזר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (Rompun) </td><td> באייר שירותי הבריאות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isoflurane </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0.9% NaCl פתרון </td><td> בקסטר </td><td></td><td></td></tr><tr><td> paraformaldehyde </td><td> מרק </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרו הזרקה המשאבה </td><td> KD מדעית </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> פוטון imager </td><td> Biospace מעבדה </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T MR סורק </td><td> Bruker Biospin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 מיקרוסקופ </td><td> אולימפוס </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HM cryostat </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> מזרק </td><td> המילטון </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> 30 מחט מד </td><td> המילטון </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> תמונה חזון תוכנה </td><td> Biospace מעבדה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision תוכנה </td><td> Biospace מעבדה </td><td></td><td></td></tr><tr><td> פאראוויזיון 5.1 התוכנה </td><td> Bruker Biospin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> עמירה 4.0 התוכנה </td><td> פניו הדמיה </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal imaging of stem cell implantation in the central nervous system of mice

במהלך העשור האחרון, השתלת צברה עניין גובר כמו מודאליות טיפולית ראשונית או משנית עבור מגוון רחב של מחלות, הן במחקרים פרה קליניים. עם זאת, עד כה התוצאות לגבי תוצאה תפקודית ו / או התחדשות רקמות להשתלה הבאה לתאי גזע הם מגוונים למדי. באופן כללי, היתרון הקליני הוא ציין, ללא הבנה מעמיקה של המנגנון הבסיסי (ים) 1. לכן, מאמצים רבים הובילו לפיתוח שיטות שונות הדמיה מולקולרית כדי לפקח על תא גזע השתלת במטרה הסופית כדי להעריך באופן מדויק, הישרדות הגורל ופיזיולוגיה של בתאי גזע מורכבים ו / או סביבת המיקרו שלהם. השינויים שנצפו אחד או יותר פרמטרים שנקבעו על ידי הדמיה מולקולרית עשוי להיות קשור לאפקט קליני הנצפה. בהקשר זה, מחקרים שלנו להתמקד שימוש בשילוב של הדמיה ביולומינציה (BLI), הדמיית תהודה מגנטית (MRI) ואת analysi היסטולוגיתזה להעריך השתלת תא גזע. BLI נפוץ הלא פולשני לבצע מעקב תא ולפקח הישרדות התא בזמן בעקבות השתלת 2-7, בהתבסס על התגובה הביוכימית שבה תאים לבטא את הגן כתב בלוציפראז, מסוגלים לפלוט אינטראקציה הבאה אור עם המצע שלה (למשל D- luciferin) 8, 9. MRI לעומת זאת היא טכניקה לא פולשנית אשר ישים מבחינה קלינית 10 והוא יכול לשמש כדי לאתר במדויק שתלי סלולריים עם רזולוציה גבוהה מאוד 11-15, אם כי הרגישות שלה מאוד תלוי בניגוד שנוצר לאחר סימון התא עם חומר ניגוד MRI . לבסוף, ניתוח שלאחר המוות היסטולוגית היא השיטה של ​​בחירה כדי לאמת את תוצאות המחקר שהתקבלו עם פולשנית טכניקות עם הרזולוציה הגבוהה ביותר וברגישות. יתר על כן הקצה נקודת ניתוח היסטולוגית מאפשר לנו לבצע ניתוח מפורט פנוטיפי של תאים מורכבים ו / או הרקמה שמסביב, תואר ראשוןsed על השימוש של חלבונים הכתב ניאון ו / או תיוג התא ישיר עם נוגדנים ספציפיים. לסיכום, אנחנו כאן חזותית להדגים את complementarities של BLI, MRI ו היסטולוגיה לפענח תא גזע שונה ו / או בסביבה הקשורים המאפיינים הבאים השתלת תא גזע של מערכת העצבים המרכזית של עכברים. כך, למשל, מח עצם שמקורם בתאי סטרומה, מהונדסים גנטית כדי לבטא משופרת גרין פלורסנט חלבון (eGFP) ו גחלילית בלוציפראז (fLuc), ומסומן בכחול ניאון מיקרון בגודל חלקיקי תחמוצת ברזל (MPIOs), יהיו מורכבים ב מערכת העצבים המרכזית של המערכת החיסונית המוסמכות עכברים והתוצאות יהיה פיקוח על ידי BLI, MRI ו היסטולוגיה (איור 1).

Watch this Scientific Journal Video about Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice at JoVE.com

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Views.  University of Antwerp. מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפי...

Video: Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

בהדמיה 2 + Ca Situ של מערכת העצבים המעיים

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...