Forschung in unserem Labor wurde von der Max von Pettenkofer-Institut, Ludwig-Maximilians-Universität München, der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG, HALLO 1511/3-1) und dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Medical Infektion Genomics&quot;-Initiative unterstützt ( 0315834C).

1. Die Vorbereitungen für LCV Isolation <ol><li> Streak aus Legionella pneumophila Herstellung DsRed-Express 13,14 Aktien aus Glycerin auf CYE-Agar-Platten mit 5 ug / ml Chloramphenicol (Cam) vier Tage vor LCV Isolation. Inkubieren der Bakterien bei 37 ° C </li><li> Seed aus 1 x 10 7 D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin oder RAW264.7 murinen Makrophagen in 75 cm 2 Zellkulturflaschen einen Tag vor Infektion. Verwenden Sie 10 ml HL5 Medium mit 20 ug / mL G418 für D. discoideum und inkubieren Sie die Amöben bei 23 ° C. Für RAW264.7 Makrophagen verwendet 10 ml RPMI 1640 Medium mit 10% FCS (hitze-inaktiviert) und 1% Glutamin, und wachsen die Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2. Verwenden Sie mindestens drei 75 cm 2 Flaschen pro Probe und Infektion (mindestens 6 x 10 7 Zellen). </li><li> Impfen eine Übernacht-Kultur mit L. pneumophila aus dem CYE Platte. Werfen Sie einen 15-ml-Reagenzglas mit 3 ml Medium AYEund 5 pg / ml Cam. Impfen mit 100 ul einer Bakteriensuspension eine OD 600nm von 0,1 ergeben. Inkubieren der Kultur über Nacht auf einem Overhead-Rotationsrad bei 37 ° C für 21-22 Stunden. </li></ol> 2. LCV Isolation <ol><li> Ändern Sie das Medium der D. discoideum Zellen zu entfernen, die Antibiotika, die mit der nach der Infektion beeinträchtigen würde. </li><li> Messen Sie die OD der Übernacht-Kultur. Bakterien sollten ihren Höhepunkt Infektiosität bei einer OD 600nm von ≥ 3, die 2 x 10 9 Bakterien / ml entspricht erreicht. </li><li> Infizieren die Zellen durch Zugabe von ca. 500 ul des L. pneumophila-Nacht-Kultur zu den wachsenden Zellen in 10 ml Medium HL5 (D. discoideum) oder 10 ml RPMI 1640 (Makrophagen). Dies entspricht einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 50. Anschließend wird die Infektion durch Zentrifugation der Bakterien auf die Zellen bei 500 × g für 10 min synchronisiert. Die Zentrifugation wird gefolgtgefolgt von einer Inkubation des D. discoideum Zellen bei 25 ° C und die RAW264.7 Makrophagen bei 37 ° C und 5% CO 2 sind. Die Infektion der Zeit von 1 Stunde beinhaltet die Zentrifugationsschritt. </li><li> Nach der Infektion entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal an extrazelluläre Bakterien zu entfernen. Verwenden Sie eiskalten Zauberin Puffer für D. discoideum und eiskaltem PBS für RAW264.7 Makrophagen. In 3 ml HS-Puffer mit Protease-Inhibitoren (Roche) ergänzt zu jedem Kolben und sammeln Sie die Zellen mit einem Zellschaber. Pool die entsprechenden Proben in einem 15 ml Teströhrchen. </li><li> Zur Homogenisierung der Probe Gebrauch 3 ml Kunststoff-Luer-Lock-Spritzen und die Kugel aus Edelstahl Homogenisator. Stellen Sie sicher, dass Sie auf dem Eis zu arbeiten. Bevor Sie beginnen, waschen Sie den Ball Homogenisator mit destilliertem Wasser, um jede Verunreinigung zu vermeiden Waschmittel und spülen Sie es mit eiskaltem Puffer HS loszuwerden Luftblasen. Verwenden Sie das 8-Clearance um Kugel. </li><li> Füllen Sie die ersten 3 ml in die Spritze auf und montieren Sie ihn auf the Homogenisator. Drücken Sie auf die Probe hin und her, neun Mal durch den Homogenisator. Tauschen Sie die Spritzen danach um eine Kontamination mit nicht-homogenisierte Material zu vermeiden. Sammeln und bündeln die homogenisierte Probe in einem 15 ml Reagenzglas und werfen Sie einen 150 ul Probe für die mikroskopische Analyse. Bevor Sie mit einer anderen Probe zerlegen und waschen den Ball Homogenisator. </li><li> Sperren des Homogenats mit 2% FCS CS oder für 30 min auf einem Schüttler auf Eis oder auf einem Overhead-Spinnrad (10-20 min) bei 4 ° C </li><li> Nach der Blockierung verwenden Sie einen affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC (Verdünnung 1:3000) oder gegen jeden anderen bakteriellen Marker ausschließlich die Bindung an die LCV-Membran. Vortex der Antikörper-Lösung, bevor Sie es zum Homogenat. Inkubieren Sie die Probe für 1 Stunde auf einem Schüttler auf Eis oder auf einem Overhead-Spinnrad (10-20 min) bei 4 ° C </li><li> In der Zwischenzeit bereiten die Histodenz Gradienten. Verwenden Sie eine 15-ml-Reagenzglas pro Steigung und drei 75 cm 2-Kolben von einer Probe. TanneSt, 5,75 ml 35% Histodenz an das Rohr, und zweitens, vorsichtig 5,75 ml 10% Histodenz Lösung an der Spitze. Danach legen Sie es vorsichtig nach unten die Rohre horizontal für 1 Stunde. </li><li> Nach der Inkubation des Homogenats mit dem Blockierungsreagenz und dem primären Antikörper, Zentrifuge bei 600 × g für 15 min bei 4 ° C bis Pellet die Probe. Überstand verwerfen und das Pellet in 1,5 ml HS-Puffer. Übertragen Sie die Proben in ein frisches 15 ml Reagenzglas und werfen Sie einen 40 ul Probe für die mikroskopische Analyse später auf. </li><li> Inkubieren Sie die Pellets mit dem sekundären Antikörper - MACS Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Mikro-Perlen (Verdünnung 1:25) - für 30 min auf einem Schüttler bei 4 ° C In der Zwischenzeit setzen die Spalten auf der MACS-Magnethalter und äquilibrieren sie mit 0,5 ml HS-Puffer. </li><li> Anschließend gelten die Proben auf die Säule. Sammeln Sie 150 ul des Flow-Through für die anschließende mikroskopische Analyse. Die Säule wird dreimal mit 0,5 ml HS-Puffer. </li><li> Entfernen Sie die Spalten aus ter Magnet und Eluat die leichte Nutzfahrzeuge mit 0,5 ml HS-Puffer durch unmittelbare spritzen. Werfen Sie einen 20 ul Probe für die mikroskopische Analyse. Der Reinigungsschritt mittels Immuno-magnetische Trennung wird erwartet, dass pro 1 × 10 7 zu ergeben infiziert D. discoideum Zellen etwa 1 × 10 6 intakte leichte Nutzfahrzeuge, die etwa das Siebenfache werden im Eluat gegenüber dem Durchfluss-13 angereichert. </li><li> Setzen Sie die Histodenz Gradienten Rohre zurück in eine vertikale Position und laden Sie das Eluat vorsichtig an der Spitze. Zentrifugieren bei 3350 × g für 1 Stunde bei 4 ° C </li><li> Nach der Zentrifugation nehmen 1,5 ml Fraktionen von unten beginnend von dem Reagenzglas mit Hilfe eines langen Pasteurpipette aus Glas. Insgesamt acht Fraktionen zu sammeln, die jeweils von der Unterseite des Rohres. Keine sichtbaren Schichten werden in der kontinuierlichen Histodenz Gefälle beobachtet. Die höchste Ausbeute von leichten Nutzfahrzeugen wird typischerweise in der Fraktion 4 in einem Verhältnis von ~ 2 × 10 5 erwarten intakte leichte Nutzfahrzeuge pro 1 x 10 7betroffen Amöben 13. Kleinere Mengen von leichten Nutzfahrzeugen sind auch in den Fraktionen 3 und 5 vorhanden ist, beziehungsweise. Somit ist die Gesamtausbeute des gereinigten leichten Nutzfahrzeugen ~ 1 × 10 6 intakte leichte Nutzfahrzeuge pro 6 × 10 7 infiziert D. discoideum Zellen 13. Die Rückgewinnung von leichten Nutzfahrzeugen kann bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden, und die leichten Nutzfahrzeugen angezeigt mehrere Stunden lang stabil. </li></ol> 3. Mikroskopische Analysen der gesammelten Proben <ol><li> Bereiten Sie eine 24-Loch-Flachboden-Gewebekulturplatten mit Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser. </li><li> Pipettieren Sie jede Probe während des LCV Reinigung plus 150 ul jeder Dichtegradienten Fraktion in die 24-Well-Platte aufgenommen. Fügen Sie 0,5 ml HS-Puffer in jede Vertiefung, um die hohe Histodenz Konzentration zu verdünnen. Anschließend zentrifugieren Sie die Platte bei 600 × g für 10 min bei 4 ° C Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und fixieren Sie die Proben mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT. Nach der Fixierung waschen die Proben zweimal. Unse Zauberin für D. discoideum und PBS für RAW264.7 Makrophagen. </li><li><ol class="lalpha"><li> Montieren Sie die Proben von GFP-Expression Calnexin D. discoideum, auf verschiedenen Stufen während LCV Isolation, direkt auf Glas-Folien mit zB Vectashield genommen. </li><li> Inkubieren der Proben von RAW264.7 Makrophagen, auf verschiedenen Stufen während der Transporter genommen, mit Blocking-Lösung (1% BSA in PBS) für 10 min bei RT. Verwenden Sie ein Anti-SidC primären Antikörpers an das leichte Nutzfahrzeuge Fleck und inkubieren für 1h in einer feuchten Kammer bei RT (affinitätsgereinigt Kaninchen-Anti-SidC; 1:1000 in Blocking-Puffer). Anschließend waschen Sie die Proben dreimal mit PBS. Inkubation mit einem sekundären Antikörper (zB Anti-Kaninchen-Cy5; 1:200 in Blocking-Lösung) für 30 min in einer feuchten und dunklen Kammer bei RT. Schließlich, waschen Sie die Proben dreimal mit PBS und montieren sie auf Glas-Folien mit zB Vectashield. </li></ol></li><li> Morphologie, Integrität und die Menge der leichten Nutzfahrzeugen von GFP-Expression isoliert Calnexin D. discoideum oder RAW264.7 Makrophagen werden durch ein Fluoreszenzmikroskop mit den angemessenen Filtern ausgestattet analysiert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Qualität und die Ausbeute an dem LCV Reinigung durch Immunaffinitätschromatographie Trennung und Dichtegradientenzentrifugation kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abb. 1) befolgt werden. Eine Übersicht der Proben während des LCV isoliert von D. gesammelt discoideu m oder Makrophagen gezeigt (Abb. 2). Das Homogenat von L. pneumophila-infizierten Fresszellen zeigt intakte leichte Nutzfahrzeuge, sondern auch eine Menge von Zelltrümmern und extrazellulären Bakterien. Nach dem Pelletieren der Probe, ist das Bild ähnlich dem Homogenat, manchmal ein wenig dichter. Da intakte leichte Nutzfahrzeuge auf die Säule haften bleiben sollte, enthält die Durchströmung meist extrazellulären Bakterien und Zelltrümmer. Nach der Elution der Probe aus der Säule enthält das Eluat intakte leichte Nutzfahrzeuge in großen Mengen. In unseren Händen, das LCV purificati<html> auf scheint wirksamer D. discoideum als für Makrophagen. In D. discoideum die Erreger Vakuolen erscheinen runder und die Ausbeute an isoliertem leichten Nutzfahrzeugen um mehr als 10 mal höher im Vergleich zu Makrophagen (Abb. 3). In intakten Makrophagen LVCs mit verschiedenen Antikörpern gefärbt erscheinen auch mehr unregelmäßig geformt. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der LCV Isolation. A) Isolierung von leichten Nutzfahrzeugen durch Immuno-magnetische Trennung mit Hilfe eines affinitätsgereinigten Antikörper gegen das bakterielle Protein-Effektor SidC, lokalisieren sich ausschließlich auf die LCV-Membran. Eine sekundäre MACS Mikro bead-gekoppelter Antikörper und einen Magneten verwendet, um leichten Nutzfahrzeugen von Zelltrümmern zu isolieren. B) Nach Immuno-magnetische Trennung leichten Nutzfahrzeugen werden durch Histodenz Dichtegradientenzentrifugation gereinigt. Leichte Nutzfahrzeuge werden in Fraktion 4 angereichert. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Proben, die während LCV Reinigung gesammelt. Bilder aus Homogenat, Pellet-, Durchfluss-und Eluat aus D. discoideum oder Makrophagen dargestellt sind. Die Proben zeigen, L. pneumophila Herstellung DsRed-Express (rot) in D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin-Signal (grün, oben) oder in Makrophagen mit einem Anti-SidC Antikörper (Cyan, unteres Bild) gefärbt. Bars, 10 um. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> Abbildung 3. Gereinigtes leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum oder Makrophagen. Die Proben zeigen Fraktion 4 nach Histodenz Dichtegradientenzentrifugation von L. pneumophila Herstellung DsRed-Express (rot) in (a) D. discoideum Herstellung GFP-Calnexin (grün) oder (B) in Makrophagen mit einem Anti-Antikörper SidC (Cyan) gefärbt. Bars, 10 um.

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Chapter 3, Unit 3 (2010).</li><li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases.">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li><li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions.">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Im Gegensatz zu früher veröffentlichten Verfahren wird dieses Protokoll auf zwei Schritten, zuerst die Trennung von leichten Nutzfahrzeugen mit einem Immuno-magnetische Ansatz und zweiten, die Reinigung von leichten Nutzfahrzeugen durch Dichtegradientenzentrifugation bezogen. Die LCV Trennung kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie, wenn entweder fluoreszenzmarkierten Bakterien und GFP-produzierenden Zellen oder Antikörper-Färbung verwendet wird, gefolgt werden. Das hier beschriebene Protokoll ist eine einfache, unkompli...

purification of pathogen vacuoles from legionella-infected phagocytes

Die opportunistischen Erreger Legionella pneumophila ist eine Amöbe-resistentes Bakterium, das auch den Wiederholungen in Alveolarmakrophagen wodurch die schweren Lungenentzündung &quot;Legionärskrankheit&quot; ein. In Protozoen-und Säugetier-Phagozyten, L. pneumophila beschäftigt konservierten Mechanismus, um eine bestimmte, Replikations-permissive Fach, die &quot;Legionellen-enthaltenden Vakuolen&quot; (LCV) zu bilden. LCV Bildung erfordert die bakterielle Icm / Dot-Typ IV-Sekretionssystem (T4SS), was so viel wie 275 &quot;Effektor&quot; transloziert Proteine ​​in Wirtszellen. Die Effektoren manipulieren Host-Proteinen sowie Lipide und kommunizieren mit sekretorischen, endosomalen Organellen und Mitochondrien-04.02. Die Bildung von leichten Nutzfahrzeugen stellt eine komplexe, robuste und redundante Prozess, der nur schwer in einer reduktionistischen Weise zu erfassen ist. Ein integrativer Ansatz ist erforderlich, um umfassend zu verstehen LCV Bildung, einschließlich einer globalen Analyse Wegogen-Host-Faktor-Wechselwirkungen und ihre zeitliche und räumliche Dynamik. Als ein erster Schritt zu diesem Ziel werden intakte leichte Nutzfahrzeuge gereinigt und analysiert durch Proteomik und Lipidomik. Die Zusammensetzung und die Bildung von Erreger-enthaltenden Vakuolen durch Proteom-Analyse durch Flüssigkeitschromatographie oder 2-D Gelelektrophorese gekoppelt Massenspektrometrie untersucht. Vakuolen entweder von der sozialen Amöbe Dictyostelium discoideum Boden oder Säugetier-Phagozyten isoliert hegte Leishmania 5, Listeria 6, 7 Mycobacterium, Rhodococcus 8, 9 oder Salmonella Legionella spp. 10. Allerdings sind die Aufreinigungsprotokolle in diesen Studien beschäftigt zeitraubend und langweilig, wie sie z. B. Elektronenmikroskopie zu LCV Morphologie, Integrität und Reinheit zu analysieren erfordern. Darüber hinaus müssen diese Protokolle nicht ausnutzen Besonderheiten des Erregers Vakuole für dereicherung. Die hier vorgestellte Methode überwindet diese Einschränkungen durch den Einsatz von D. discoideum Herstellung eines fluoreszierenden Marker und LCV durch Targeting des bakteriellen Effektorprotein SidC, die selektiv Anker auf die LCV Membran durch Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat (PtdIns (4) P) 3,11. LCV in einem ersten Schritt mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines affinitätsgereinigten primären Antikörper gegen SidC und einen sekundären Antikörper an magnetische Beads gekoppelt ist, in einem zweiten Schritt durch eine klassische Histodenz Dichtegradientenzentrifugation 12,13 (Abb. 1), gefolgt angereichert . Ein Proteom-Studie von isolierten leichte Nutzfahrzeuge aus D. discoideum ergab mehr als 560 Wirtszellproteinen, einschließlich Proteine ​​mit phagozytischen Vesikel, Mitochondrien, ER und Golgi, sowie mehrere GTPasen, die nicht in LCV Bildung wurden vor dem 13. beteiligt zugeordnet. LCV angereichert und gereinigt mit derProtokoll hier skizzierten kann durch Mikroskopie (Immunfluoreszenz, Elektronenmikroskopie), biochemischen Methoden (Western Blot) und Proteomik oder der Lipid Ansätze analysiert werden.

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Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten<em&gt; Legionellen</em&gt;-Haltigen Vakuolen (leichte Nutzfahrzeuge) von Amöben und Makrophagen. Das Zwei-Schritt-Protokoll umfasst LCV Anreicherung mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bakterielles LCV-Marker und weitere Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation.

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

12.4K Aufrufe.  Ludwig-Maximilians-Universität. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von intakten Legionellen-Haltigen Vakuolen (leichte Nutzfahrzeuge) von Amöben und Makrophagen. Das Zwei-Schritt-Protokoll umfasst LCV Anreicherung mittels Immuno-magnetische Trennung unter Verwendung eines Antikörpers gegen ein bakterielles LCV-Marker und weitere Reinigung durch Dichtegradientenzentrifugation.

Serie: Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Forschung

Immunologie und Infektion

One-day Workflow Scheme for Bacterial Pathogen Detection and Antimicrobial Resistance Testing from Blood Cultures

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. Therefore, rapid administration of adequate antibiotic therapy is of foremost importance in the treatment of bloodstream infections. The critical element in this process is timing, heavily dependent on the results of bacterial identification and antibiotic susceptibility testing. Both of these parameters are routinely obtained by culture-based testing, which is time-consuming and takes on average 24-48 hours2, 4. The aim of the study was to develop DNA-based assays for rapid identification of bloodstream infections, as well as rapid antimicrobial susceptibility testing. The first assay is a eubacterial 16S rDNA-based real-time PCR assay complemented with species- or genus-specific probes5. Using these probes, Gram-negative bacteria including Pseudomonas spp., Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli as well as Gram-positive bacteria including Staphylococcus spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Streptococcus spp., and Streptococcus pneumoniae could be distinguished. Using this multiprobe assay, a first identification of the causative micro-organism was given after 2 h.
Secondly, we developed a semi-molecular assay for antibiotic susceptibility testing of S. aureus, Enterococcus spp. and (facultative) aerobe Gram-negative rods6. This assay was based on a study in which PCR was used to measure the growth of bacteria7. Bacteria harvested directly from blood cultures are incubated for 6 h with a selection of antibiotics, and following a Sybr Green-based real-time PCR assay determines inhibition of growth. The combination of these two methods could direct the choice of a suitable antibiotic therapy on the same day (Figure 1). In conclusion, molecular analysis of both identification and antibiotic susceptibility offers a faster alternative for pathogen detection and could improve the diagnosis of bloodstream infections.

The design of a straightforward one-day workflow scheme for bacterial pathogen diagnostics enables the rapid recognition of bloodstream infections. The inclusion of eight clinically relevant bacterial targets and their antibiotic resistance profiles offers the clinician an initial insight on the same day, which can lead to more adequate therapy.

Ein-Tages-Workflow-Schema für bakterielles Pathogen-Erkennung und Resistenz gegen antimikrobielle Tests aus Blutkulturen

Bloodstream infections are associated with high mortality rates because of the probable manifestation of sepsis, severe sepsis and septic shock1. ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

Reinigung und Visualisierung von Lipopolysaccharid aus Gram-negativen Bakterien durch heiße wäßrige-Phenol-Extraktion

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Loop-vermittelte isothermen Amplifikation (LAMP) Assays für die artspezifischen Nachweis von<em&gt; Eimeria</em&gt;, Die Hühner infizieren

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. However, isolating bacterial RNA from infected cells or tissues is a challenging task, since mammalian RNA mostly dominates the lysates of infected cells. Here we describe an optimized method for RNA isolation of Listeria monocytogenes bacteria growing within bone marrow derived macrophage cells. Upon infection, cells are mildly lysed and rapidly filtered to discard most of the host proteins and RNA, while retaining intact bacteria. Next, bacterial RNA is isolated using hot phenol-SDS extraction followed by DNase treatment. The extracted RNA is suitable for gene transcription analysis by multiple techniques. This method is successfully employed in our studies of Listeria monocytogenes gene regulation during infection of macrophage cells 1-4. The protocol can be easily modified to study other bacterial pathogens and cell types.

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

Here we describe a method for bacterial RNA isolation from Listeria monocytogenes bacteria growing inside murine macrophages. This technique can be used with other intracellular pathogens and mammalian host cells.

RNA-Reinigung aus intrazellulär Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; In Makrophagenzellen

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. Diet-induced obesity (DIO) is a valuable model in studying the role of macrophage heterogeneity; however, adequate macrophage isolations are difficult to acquire from inflamed tissues. In this protocol, we outline the isolation steps and necessary troubleshooting guidelines derived from our studies for obtaining a suitable population of tissue-resident macrophages from mice following 18 weeks of high-fat (HFD) or high-fat/high-cholesterol (HFHCD) diet intervention. This protocol focuses on three hallmark tissues studied in obesity and atherosclerosis including the liver, white adipose tissues (WAT), and the aorta. We highlight how dualistic usage of flow cytometry can achieve a new dimension of isolation and characterization of tissue-resident macrophages. A fundamental section of this protocol addresses the intricacies underlying tissue-specific enzymatic digestions and macrophage isolation, and subsequent cell-surface antibody staining for flow cytometric analysis. This protocol addresses existing complexities underlying fluorescent-activated cell sorting (FACS) and presents clarifications to these complexities so as to obtain broad range characterization from adequately sorted cell populations. Alternate enrichment methods are included for sorting cells, such as the dense liver, allowing for flexibility and time management when working with FACS. In brief, this protocol aids the researcher to evaluate macrophage heterogeneity from a multitude of inflamed tissues in a given study and provides insightful troubleshooting tips that have been successful for favorable cellular isolation and characterization of immune cells in DIO-mediated inflammation.

This protocol allows a researcher to isolate and characterize tissue-resident macrophages in various hallmark inflamed tissues extracted from diet-induced models of metabolic disorders.