ونحن ممتنون لمايكل فايس وجان سيبي لتوجيهات بشأن إنشاء بالعاثية وتنقيتها. نشكر مايكل Elowitz لتوفير برنامج التعرف على الخلية، Schnitzcell. ويدعم عمل في المختبر غولدنغ من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (R01GM082837)، المؤسسة الوطنية للعلوم (082265، PFC: مركز للفيزياء الخلايا الحية)، ومؤسسة ولش (المنح Q-1759) وعلوم الإنسان الحدودي برنامج (RGY 70/2008).

<ol>
	<li>Oppenheim, A. B., Kobiler, O., Stavans, J., Court, D. L., Adhya, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switches+in+bacteriophage+lambda+development.">Switches in bacteriophage lambda development.</a> Annu. Rev. Genet. 39, 409-429 (2005).</li><li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A genetic switch : phage lambda revisited. , (2004).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lambda II. , (1983).</li><li>Hershey, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Bacteriophage lambda. , (1971).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decision+making+at+a+subcellular+level+determines+the+outcome+of+bacteriophage+infection.">Decision making at a subcellular level determines the outcome of bacteriophage infection.</a> Cell. 141, 682-691 (2010).</li><li>Edgar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+infection+is+targeted+to+cellular+poles.">Bacteriophage infection is targeted to cellular poles.</a> Mol. Microbiol. , (2008).</li><li>Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current protocols in molecular biology. , (1994).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).</li><li>Fasman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical handbook of biochemistry and molecular biology. , (1989).</li><li>Kaiser, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+internal+structure+of+bacteriophage+lambda.">On the internal structure of bacteriophage lambda.</a> J. Gen. Physiol. 49, 171-178 (1966).</li><li>Kobiler, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+kinetic+analysis+of+the+bacteriophage+lambda+genetic+network.">Quantitative kinetic analysis of the bacteriophage lambda genetic network.</a> Proc Natl Acad Sci. 102, 4470-4475 (2005).</li><li>Shaner, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Zeng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Personal communication with M. Feiss. , .</li><li>Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adsorption+of+coliphage+lambda+to+its+host:+effect+of+variations+in+the+surface+density+of+receptor+and+in+phage-receptor+affinity.">The adsorption of coliphage lambda to its host: effect of variations in the surface density of receptor and in phage-receptor affinity.</a> J. Mol. Biol. 103, 521-536 (1976).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

سلالات بكتيرية، وبالعاثية البلازميدات: سلالة LE392 هو supF. تم اختيارها لقمع طفرة في الجينوم Sam7 بالعاثية (انظر الجدول 1 للاطلاع على التفاصيل). وهكذا، سوف يتسبب lysogens ليز والافراج عن الجسيمات في نهاية المطاف بالعاثية، وكذلك الخلايا المصابة التي اختارت المسار التحللي. تزرع الخلايا مستذيب في 30 ° C بسبب وجود درجة حرارة 857 CI الحساسة أليل في الجينوم بالعاثية. بعد تحريض الحرارة، وGPD-EYFP والبرية GPD نوع من شارك في أعربت جينوم LZ1 λ وpPlate البلازميد * D على التوالي. ونتيجة لذلك، قفيصة من LZ2 تم إنشاؤه حديثا λ بالعاثية يحتوي على خليط من GPD-EYFP والبروتينات GPD. هذه الفسيفساء بالعاثية مستقرة هيكليا والفلورسنت بما فيه الكفاية للسماح الكشف عن فاجات الفردية 5. RE PP - mCherry هو مراسل البلازميد المستخدمة للكشف عن اختيار pathwa مستذيبذ. يتم تنشيط RE P المروج من خلال CII إنشاء استذابة 1،11. وقد اشتق mCherry 5 من PE-GFP 11 من استبدال GFP مع mCherry 12 - PP RE. لمزيد من التفاصيل انظر عملنا في وقت سابق 5. معلمات نمو الحالة: خلال الحث مستذيب (القسم 1)، الهز الخفيف عند 180 دورة في الدقيقة يعطي غلة جيدة الفيروس 13. استخدام الجلوكوز في المتوسط ​​النمو كما يجب تجنب المنتجات يولد ايض الجلوكوز الأيض الحمضية، والجزيئات غير مستقرة ناضجة لامدا في الرقم الهيدروجيني الحمضية 13. وتهدف إضافة MgSO 4 في استقرار بالعاثية قفيصة 3. لفاجات تحمل البرية اخ نوع (بي بدلا من 857)، ويمكن أن يتسبب في مستذيب باستخدام C DNA المضرة ميتوميسين كيل 3. في الخطوة 1.3، والحضانة عند 37 ° C ينبغي عادة لا تتجاوز 90 دقيقة. فمن usef<html> UL للتحقق من كثافة الخلايا بواسطة OD 600 كل 30 دقيقة. لالمحللة جيدة، OD 600 ينخفض ​​إلى نحو 0.2 أو أقل، وOD المتبقية 600 هو نتيجة للحطام الخلايا. قد تفرخ طويل جدا يؤدي إلى انخفاض العائد بالعاثية منذ بالعاثية تم إنشاؤه حديثا قد تبدأ في ضخ عينات من الحمض النووي في الخلية الحطام. للحصول على الفرقة بالعاثية مرئية (على الأقل 1 × 10 الجسيمات بالعاثية 11) في خطوات 2.11 و 2.13، وتنمو على الأقل 500 مل الثقافة في الخطوة 1.2. وتهدف إضافة مالتوس 0.2٪ في المتوسط ​​في خطوات النمو 5.1 و 5.2 في التعبير حمل من لحم الضأن، ومستقبلات لامدا بالعاثية الامتزاز 3،14. ويهدف التخفيف 1000-أضعاف أضعاف بدلا من-100 في الخطوة 5.2 في خفض مستوى الخلفية mCherry من RE مراسل بي بي البلازميد - mCherry. في الخطوة 5.5 لحقن الحمض النووي مما اثار بالعاثية، 35 ° C يتم اختيار لتجنب تحريض على أليل حساسة للحرارة cI857. بالعاثية تنقية: jove_content &quot;&gt; يمكن استبدال الخطوات تنقية بالعاثية (2،1 خطوات من خلال 2.11) مع بروتوكولات أخرى تنقية 5، ولكن من خلال التدرج تنبيذ فائق النهائي التوازن CSCL (2.12 و خطوات 2.13) أمر لا مفر منه. دوارات الدلو المتأرجح هناك حاجة في خطوات 2.10 و 2.12 ل ضمان حادة العصابات بالعاثية مرئية. الحصول على الأسهم النقية بالعاثية يمكن أن تتخذ بسهولة تصل إلى أسبوع، ولذلك فمن الضروري التحقق من عيار بالعاثية على طول الطريق لتأكد من أي شيء يذهب على نحو خاطئ خلال خطوات وسيطة. بالعاثية يعالج: خلال جميع الإجراءات تنقية في القسم 2، من المهم جدا للتعامل مع بالعاثية حلالة بلطف لتجنب قص ذيول بالعاثية من رؤساء بالعاثية. خلال العدوى خلية في القسم 5 (على سبيل المثال، من خلال خطوات 5،5 5.7)، كما أنها ضرورية لتجنب القص من الجسيمات بالعاثية من الخلية المصابة. ملاحظة أنه إذا تم المنفصمة فإن الفيروس من الخلية المصابة بعد حقن الحمض النووي، والنتيجة هي &quot;الظلام&quot; عدوى، أي فيوسيراعى في نتائج التجربة في fection لكن بالعاثية اصابة لن. للحد من هذه المشاكل، ونحن نستخدم تلميح ماصة واسعة كلما التعامل مع فاجات أو الخليط بالعاثية / خلية. دابي الاختبار: تلطيخ السهم بالعاثية مع دابي (القسم 4) هو وسيلة سريعة وفعالة للتحقق من نقاء الأسهم بالعاثية. ويمكن أيضا أن تستخدم لاختبار إمكانية تدهور مخزون بالعاثية القائمة مع مرور الوقت. لسهم نقي، ينبغي أن يشترك في توطين إشارات YFP ودابي تحت المجهر مضان تكون قريبة من 100٪. نلاحظ عادة أن أقل من 1٪ من البقع YFP لا تحتوي على دابي (تمثل capsids دون الجينوم الفيروسي)، مما يدل على أن هذه الجسيمات لم حزم بنجاح الحمض النووي الفيروسي أو قد حقن الحمض النووي بالفعل في أماكن أخرى. أقل من 1٪ من البقع دابي لا تحتوي على YFP (الموافق غير الفلورسنت فاجات). إذا لم تكن هذه هي الحالة، من خلال خطوات 2،12 2،14 حاجة للتكرار في سrder لتنقية مرة أخرى. فيما يتعلق المعلمات والتصوير، والإعداد المجهر في الخطوة 4.3 ليست حرجة كما هو الحال في المادة 5 لأنه لا يلزم على المدى الطويل الخلية الحية التصوير هنا. ومع ذلك، والحفاظ على إعدادات الفحص المجهري نفسه كما في القسم 5 من المفيد إذا كان أحد يرغب لمعايرة كثافة مضان من الجسيمات بالعاثية واحد. إذا كان لوح PBS-الاغاروز ليست نظيفة جدا، أو الكثير من يستخدم صبغة دابي، قد يكون محاطا بعض المواقع دابي الموافق DNA بالعاثية مع &quot;هالة&quot;. إذا تم استخدام القليل جدا دابي صبغة، قد الإشارة من قناة دابي تكون ضعيفة جدا. المجهر النظام: للتصوير في القسم 6، ونحن نستخدم المجهر تجاري epifluorescence مقلوب (الكسوف TE2000-E، نيكون) مع هدف 100X (خطة فلوو، والفتحة العددية 1.40 في الغمر النفط) ومجموعات التصفية القياسية (نيكون). مصدر الضوء مضان هو مصباح القوس مع السيطرة على شدة الضوء. الميزات التالية يتم التحكم الكمبيوتر: X، Y Z وبوsition؛ حقل مشرق ومصاريع مضان، واختيار مرشح مضان. مطلوب ميزة التركيز التلقائي. وإلا، قد تنجرف بسهولة التركيز بعيدا خلال الوقت الفاصل بين الفيلم (عادة 4 ساعات طويلة). القدرة على الحصول على وظائف متعددة (س، ص) في كل نقطة زمنية مفيد، لأنه يتيح لمتابعة الأحداث العدوى متعددة في نفس الوقت. نكتسب عادة مناصب المرحلة 8 في كل فيلم، ومتابعة للأحداث العدوى 100. الكاميرا التي نستخدمها هي 512x512 تبريد CCD مع 16X16 بيكسل ميكرومتر مع مجموعة ديناميكية من 16 بت (Cascade512، Photometrics). يتم تنفيذ برامج اقتناء باستخدام MetaMorph (الأجهزة الجزيئية). يجب وضع المجهر في غرفة التحكم في درجة حرارته؛ بدلا من ذلك، ينبغي أن تكون محاطة المرحلة المجهر من قبل غرفة التحكم في درجة حرارته. الصورة اكتساب: لحية خلايا التصوير، فمن الأهمية بمكان لتجنب التعرض غير الضروري للعينة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تبيض وبوtotoxicity. ولذلك، فمن الأفضل لوصف أول نظام لإيجاد التعرض للضوء الأمثل الذي يسمح للكشف مضان في حين لا تؤدي إلى نمو الخلايا المفرط أو تبيض معرقلة. للحصول على صورة جيدة مضان، ولعب مع شدة الضوء مثيرة، وزيادة زمن التعرض الكاميرا. في خطوات 6،2-6،3، يتم اختيار الإطار الزمني 10 دقيقة لغرض التقليل من التعرض للضوء. في كل إطار، لا بد من واحد فقط في التركيز على عكس صورة المرحلة (للاعتراف الخلية) وقنوات الفلورسنت (لتحديد مصير الخلية). في نقطة أول مرة، يطلب ومع ذلك، متعددة Z-موقف الصور من خلال برنامج قناة YFP لالتقاط جميع فاجات اصابة على سطح الخلية. قد زمن التعرض YFP في الإطار الأولي بحاجة أيضا إلى أن تكون أعلى من تلك المستخدمة للفيلم في الوقت الفاصل بين الأطر وقت لاحق. تحليل الصور: بعناية شديدة الاعتماد الجسيمات بالعاثية حول سطح الخلية في الخطوة 7.1. كماالمشار إليها أعلاه، ونحن نأخذ سلسلة من المداخن Z-من خلال قناة YFP في الخطوة 6.2. ولكن هذا قد لا تزال تترك بعض الجزيئات بالعاثية الفلورسنت خارج التركيز، التي تتحدى العد. يتم قياس طول الخلية في الإطار الزمني الأولي باستخدام برنامج Metamorph. ويمكن أيضا طول الخلية تقاس يماغيج أو أدوات البرمجيات الأخرى. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للبرنامج الآلي المنزل مطلب بني أن تكون مفيدة جدا في الحصول على معلومات مثل تغير مضان مع مرور الوقت على طول الأنساب الخلية.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> الكلوروفورم </td><td> فيشر العلمية </td><td> C298-500 </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> فيشر العلمية </td><td> S271-3 </td></tr><tr><td> الدناز I </td><td> سيجما </td><td> D4527-10KU </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز </td><td> سيجما </td><td> R4642-10MG </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP233-1 </td></tr><tr><td> SM العازلة </td><td> Teknova </td><td> S0249 </td></tr><tr><td> NZYM </td><td> Teknova </td><td> N2062 </td></tr><tr><td> CSCL </td><td> سيجما </td><td> C3011-250G </td></tr><tr><td> محقنة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 309585 </td></tr><tr><td> إبرة </td><td> بيكتون ديكنسون </td><td> 305176 </td></tr><tr><td> غسيل الكلى كاسيت </td><td> الحرارية العلمية </td><td> 66333 </td></tr><tr><td> المجهر الشريحة </td><td> كورنينج </td><td> 2947-75x50 </td></tr><tr><td> الاغاروز </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP160-100 </td></tr><tr><td> SW40Ti فائقة الوضوح أنبوب </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 344060 </td></tr><tr><td> SW60Ti فائقة الوضوح أنبوب </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 344062 </td></tr><tr><td> SW40Ti الدوار </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 331302 </td></tr><tr><td> SW60Ti الدوار </td><td> بيكمان كولتر </td><td> 335649 </td></tr><tr><td> إنكسار </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-947 </td></tr><tr><td> Epifluorescence المجهر </td><td> نيكون </td><td> الكسوف TE2000-E </td></tr></tbody></table> الجدول 2. الكواشف والمعدات.

following cell-fate in e. coli after infection by phage lambda

نظام يتألف من الجراثيم (بالعاثية) امدا والبكتيريا E. وقد خدم القولونية طويلة كنموذج ل1،2 تقرير مصير الخلية. بعد العدوى المتزامنة للخلية بها عدد من فاجات، يتم اختيار واحد من مسارين: التحللي (ضراوة) أو مستذيب (نائمة) 3،4. ونحن وضعت مؤخرا طريقة لوصفها fluorescently فاجات الفردية، وكانوا قادرين على دراسة قرار ما بعد الإصابة في الوقت الحقيقي تحت المجهر، على مستوى الفرد وفاجات الخلايا 5. هنا، نحن تصف الإجراء الكامل لأداء التجارب العدوى الوارد وصفها في وقت سابق عملنا 5. وهذا يشمل إنشاء فاجات الفلورسنت، والعدوى من الخلايا، والتصوير تحت المجهر وتحليل البيانات. فإن الفيروس هو الفلورسنت قوة &quot;مختلطة&quot;، وشارك في التعبير عن الإصدارات من النوع البري وYFP الانصهار من البروتين قفيصة GPD. يتم الحصول أولا المحللة بالعاثية الخام عن طريق حفز على مستذيب من (GPD-EYFP ENHanced صفراء نيون البروتين) بالعاثية، معربا عن إيواء والبرية البلازميد نوع GPD. ثم يتم تنفيذ سلسلة من الخطوات لتنقية، تليها دابي وضع العلامات والتصوير تحت المجهر. يتم ذلك من أجل التحقق من التوحيد، DNA الكفاءة التعبئة والتغليف، إشارة مضان والاستقرار الهيكلي للسهم بالعاثية. يتم تنفيذ الأولي لامتصاص فاجات للبكتيريا على الجليد، ثم تليها على حضانة قصيرة في 35 ° C لتحريك الفيروسية حقن DNA 6. ثم يتم نقل فإن الفيروس / خليط البكتيريا على سطح لوح المغذيات آجار رقيقة، مع تغطية ساترة وتصوير تحت المجهر epifluorescence. ويتبع عملية ما بعد الإصابة لمدة 4 ساعة، 10 دقيقة على فترات. يتم تعقب مرحلة مواقف متعددة مثل التي يمكن أن تعزى ~ التهابات الخلايا 100 في تجربة واحدة. في كل نقطة موقف والوقت، يتم الحصول على الصور في المقابل مراحل وقنوات الفلورسنت الأحمر والأخضر. يتم استخدام الصور على النقيض من المرحلة في وقت لاحق لسل الآليالاعتراف لتر في حين يتم استخدام القنوات الفلورسنت لوصف نتائج العدوى: إنتاج فاجات الفلورسنت الجديدة (الخضراء)، يليه تحلل الخلايا، أو التعبير عن العوامل استذابة (أحمر)، يليه نمو الخلايا المستأنفة والانقسام. تتم معالجة المكتسبة الوقت الفاصل بين الأفلام باستخدام مزيج من الأساليب اليدوية والآلية. نتائج تحليل البيانات في تحديد مؤشرات الإصابة لكل حدث العدوى (مثل عدد ومواقف اصابة فاجات)، وكذلك نتيجة العدوى (تحلل / استذابة). ويمكن استخراج معلمات إضافية إذا لزم الأمر.

Watch this Scientific Journal Video about Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda at JoVE.com

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

توضح هذه المقالة الإجراء لإعداد الإصدار fluorescently التي تحمل علامات لامدا عاثية، والعدوى من<em&gt; E. القولونية</em&gt; البكتيريا والعدوى بعد ظهور نتائج تحت المجهر، وتحليل النتائج العدوى.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

following-cell-fate-in-e-coli-after-infection-by-phage-lambda

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

23.1K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign. توضح هذه المقالة الإجراء لإعداد الإصدار fluorescently التي تحمل علامات لامدا عاثية، والعدوى من E. القولونية البكتيريا والعدوى بعد ظهور نتائج تحت المجهر، وتحليل النتائج العدوى.

Video: Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such as Chronic Wasting Disease (CWD) of cervids and scrapie in sheep. The Prion hypothesis asserts that this abnormal conformer constitutes most or all of the infectious prion. The role of the immune system in early events in peripheral prion pathogenesis has been convincingly demonstrated for CWD and scrapie 1-3. Transgenic and pharmacologic studies in mice revealed an important role of the Complement system in retaining and replicating prions early after infection 4-6. In vitro and in vivo studies have also observed prion retention by dendritic cells 7-10, although their role in trafficking remains unclear 11-16. Macrophages have similarly been implicated in early prion pathogenesis, but these studies have focused on events occurring weeks after infection 3,11,17. These prior studies also suffer from the problem of differentiating between endogenous PrPC and infectious prions. Here we describe a semiquantitative, unbiased approach for assessing prion uptake and trafficking from the inoculation site by immune cells recruited there. Aggregated prion rods were purified from infected brain homogenate by detergent solubilization of non-aggregated proteins and ultracentrifugation through a sucrose cushion. Polyacrylamide gel electrophoresis, coomassie blue staining and western blotting confirmed recovery of highly enriched prion rods in the pelleted fraction. Prion rods were fluorochrome-labeled then injected intraperitoneally into mice. Two hours later immune cells from peritoneal lavage fluid, spleen and mediastinal and mesenteric lymph nodes were assayed for prion rod retention and cell subsets identified by multicolor flow cytometry using markers for monocytes, neutrophils, dendritic cells, macrophages and B and T cells. This assay allows for the first time direct monitoring of immune cells acquiring and trafficking prions in vivo within hours after infection. This assay also clearly differentiates infectious, aggregated prions from PrPC normally expressed on host cells, which can be difficult and lead to data interpretation problems in other assay systems. This protocol can be adapted to other inoculation routes (oral, intravenous, intranervous and subcutaneous, e.g.) and antigens (conjugated beads, bacterial, viral and parasitic pathogens and proteins, egg) as well.

Here we describe a novel assay for monitoring prion uptake and trafficking by immune cells immediately following intraperitoneal inoculation by purifying and fluorescently labeling aggregated prion rods from infected brain material then monitoring their uptake and movement from the injection site and characterizing the cells mediating these events.

رصد خلايا المناعة الاتجار نيون بريون قضبان وبعد ساعات من العدوى داخل الصفاق

Presence of an abnormal form a host-encoded prion protein (PrPC) that is protease resistant, pathologic and infectious characterizes prion diseases such ...

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

The investigation of the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to understanding the pathogenic mechanisms of diseases caused by these organisms. Here we describe a procedure for protein extraction from Burkholderia species based on mechanical lysis using glass beads in the presence of ethylenediamine tetraacetic acid and phenylmethylsulfonyl fluoride in phosphate buffered saline. This method can be used for different Burkholderia species, for different growth conditions, and it is likely suitable for the use in proteomic studies of other bacteria. Following protein extraction, a two-dimensional (2-D) gel electrophoresis proteomic technique is described to study global changes in the proteomes of these organisms. This method consists of the separation of proteins according to their isoelectric point by isoelectric focusing in the first dimension, followed by separation on the basis of molecular weight by acrylamide gel electrophoresis in the second dimension. Visualization of separated proteins is carried out by silver staining.

Total Protein Extraction and 2-D Gel Electrophoresis Methods for Burkholderia Species

Members of the Burkholderia genus are pathogens of clinical importance. We describe a method for total bacterial protein extraction, using mechanical disruption, and 2-D gel electrophoresis for subsequent proteomic analysis.

مجموع استخراج بروتين و 2-D طرق جل الكهربائي ل<em&gt; بيركولديريا</em&gt; الأنواع

The investigation of  the intracellular protein levels of bacterial species is of importance to  understanding the pathogenic mechanisms of diseases ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal features of the natural infection. This protocol describes procedures for the establishment and evaluation of systemic infection due to neuropathogenic Escherichia coli K1 in the neonatal rat. Colonization of the gastrointestinal tract leads to dissemination of the pathogen along the gut-lymph-blood-brain course of infection and the model displays strong age dependency. A strain of E. coli O18:K1 with enhanced virulence for the neonatal rat produces exceptionally high rates of colonization, translocation to the blood compartment and invasion of the meninges following transit through the choroid plexus. As in the human host, penetration of the central nervous system is accompanied by local inflammation and an invariably lethal outcome. The model is of proven utility for studies of the mechanism of pathogenesis, for evaluation of therapeutic interventions and for assessment of bacterial virulence.

Non-Invasive Model of Neuropathogenic Escherichia coli Infection in the Neonatal Rat

Here, a procedure is described for the establishment of systemic infection in the neonatal rat with cultures of Escherichia coli K1. This non-invasive procedure permits colonization of the gastrointestinal tract, translocation of the pathogen to the systemic circulation, and invasion of the central nervous system at the choroid plexus.

نموذج غير الغازية من ممرض للأعصاب<em&gt; الإشريكية القولونية</em&gt; العدوى في الأطفال حديثي الولادة الجرذ

Investigation of the interactions between animal host and bacterial pathogen is only meaningful if the infection model employed replicates the principal ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics فج: مقاربات الفسيولوجية لتوصيف رواية الفيروسية البروتينات

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Transformation of Probiotic Yeast and Their Recovery from Gastrointestinal Immune Tissues Following Oral Gavage in Mice

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat gastrointestinal disorders. Adapting probiotic yeast in particular for this approach carries several advantages. These strains have not only the potential to synthesize a wide variety of complex heterologous proteins but are also capable of surviving and protecting those proteins during transit through the intestine. Critically, however, this approach requires expertise in many diverse laboratory techniques not typically used in tandem. Furthermore, although individual protocols for yeast transformation are well characterized for commonly used laboratory strains, emphasis is placed here on alternative approaches and the importance of optimizing transformation for less well characterized probiotic strains. Detailing these methods will help facilitate discussion as to the best approaches for testing probiotic yeast as oral drug delivery vehicles and indeed serve to advance the development of this novel strategy for gastrointestinal therapy.

Presented here is a unified description of techniques that can be used to develop, transform, administer, and test heterologous protein expression of the probiotic yeast Saccharomyces boulardii.

التحول من الخميرة بروبيوتيك وشفائهم من الجهاز الهضمي المناعي الأنسجة بعد بالتزقيم عن طريق الفم في الفئران

Development of recombinant oral therapy would allow for more direct targeting of the mucosal immune system and improve the ability to combat ...

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and water-screening methods used currently. While conventional bacterial detection methods, such as polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) can specifically detect pathogenic contaminants, they require extensive sample preparation and lengthy waiting periods. In addition, these practices demand sophisticated laboratory instruments and settings, and must be executed by trained professionals. Herein, a protocol is proposed for a simpler diagnostic technique that features the unique combination of magnetic and fluorescent parameters in a nanoparticle-based platform. The proposed multiparametric magneto-fluorescent nanosensors (MFnS) can detect E. coli O157:H7 contamination with as little as 1 colony-forming unit present in solution within less than 1 h. Furthermore, the ability of MFnS to remain highly functional in complex media such as milk and lake water has been verified. Additional specificity assays were also used to demonstrate the ability of MFnS to only detect the specific target bacteria, even in the presence of similar bacterial species. The pairing of magnetic and fluorescent modalities allows for the detection and quantification of pathogen contamination in a wide range of concentrations, exhibiting its high performance in both early- and late-stage contamination detection. The effectiveness, affordability, and portability of the MFnS make them an ideal candidate for point-of-care screening for bacterial contaminants in a wide range of settings, from aquatic reservoirs to commercially packaged foods.

Foodborne Pathogen Screening Using Magneto-fluorescent Nanosensor: Rapid Detection of E. Coli O157:H7

The overall goal of this protocol is to synthesize functional nanosensors for the portable, cost-effective, and rapid detection of specifically targeted pathogenic bacteria through a combination of magnetic relaxation and fluorescence emission modalities.

مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية الفحص باستخدام المغناطيسية-فلوري نانوسينسور: الكشف السريع عن O157:H7 كولاي

Enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 has been linked to both waterborne and foodborne illnesses, and remains a threat despite the food- and ...

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome (HUS), colonize to the intestinal tract of humans. To study the detailed mechanism of EHEC colonization in vivo, it is essential to have animal models to monitor and quantify EHEC colonization. We demonstrate here a mouse-EHEC colonization model by transforming the bioluminescent expressing plasmid to EHEC to monitor and quantify EHEC colonization in living hosts. Animals inoculated with bioluminescence-labeled EHEC show intense bioluminescent signals in mice by detection with a non-invasive in vivo imaging system. After 1 and 2 days post infection, bioluminescent signals could still be detected in infected animals, which suggests that EHEC colonize in hosts for at least 2 days. We also demonstrate that these bioluminescent EHEC locate to mouse intestine, specifically in the cecum and colon, from ex vivo images. This mouse-EHEC colonization model may serve as a tool to advance the current knowledge of the EHEC colonization mechanism.

Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System

A detailed protocol of a mouse model for enterohemorrhagic E. coli (EHEC) colonization by using bioluminescence-labeled bacteria is presented. The detection of these bioluminescent bacteria by a non-invasive in vivo imaging system in live animals can advance our current understanding of EHEC colonization.

الكشف عن استعمار الإشريكيّة القولونية Enterohemorrhagic موريني واستضافة بنظام الإضاءة الحيوية غير الغازية في فيفو

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) O157:H7, which is a foodborne pathogen that causesdiarrhea, hemorrhagic colitis (HS), and hemolytic uremic syndrome ...

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below outlines a method for high efficiency transfer between bacterial strains of a plasmid harboring a transposon containing a kanamycin resistance marker. The plasmid-borne transposase is encoded by a variant tnp gene that inserts the transposon into the genome of the recipient strain with very low insertional bias. This method thus allows the creation of large mutant libraries in which transposons have been inserted into unique genomic positions in a recipient strain of either Escherichia coli or Shigella flexneri bacteria. By using bacterial conjugation, as opposed to other methods such as electroporation or chemical transformation, large libraries with hundreds of thousands of unique clones can be created. This yields high-density insertion libraries, with insertions occurring as frequently as every 4-6 base pairs in non-essential genes. This method is superior to other methods as it allows for an inexpensive, easy to use, and high efficiency method for the creation of a dense transposon insertion library. The transposon library can be used in downstream applications such as transposon sequencing (Tn-Seq), to infer genetic interaction networks, or more simply, in mutational (forward genetic) screens.

Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri

Presented here is a simple method for creating a high-density transposon insertion library in Escherichia coli or Shigella flexneri using bacterial conjugation. This protocol allows the creation of a collection of hundreds of thousands of unique mutants in bacteria by the random genomic insertion of a transposon.

إنشاء "الكثيفة ينقول الإدراج المكتبة استخدام البكتيرية التصريف" في "انتيروباكتيريال سلالات مثل" الإشريكيّة القولونية أو دوسنتاريا فليكسنيري

Transposon mutagenesis is a method that allows gene disruption via the random genomic insertion of a piece of DNA called a transposon. The protocol below ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...