الكتاب أشكر لاند ولاية بادن فورتمبيرغ والاتحاد فندق Europäischer Europäische فون FÜR يموت ENTWICKLUNG regionale - للحصول على تمويل ZAFH الفوتون N، الفراء Bundesministerium Bildung اوند Forschung (BMBF) لتمويل منحة بحثية لا. 1792C08 وكذلك شركة محدودة ولاية بادن فورتمبيرغ، ستيفتونغ لتمويل مشروع &quot;Aurami&quot;.

1. البذر والحضانة من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخلايا الفردية البذور، مثل U373-MG أو خلايا ورم أرومي دبقي U-251-MG في مناطق ذات كثافة نموذجية من 100 خلية / مم 2 على شريحة زجاجية وزراعتها ل4872 ساعة في ثقافة المتوسط ​​(على سبيل المثال RPMI 1640 تستكمل مع مصل العجل 10٪ الجنين والمضادات الحيوية) باستخدام حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا الغشاء مع علامة، على سبيل المثال 6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) تطبق لمدة 60 دقيقة عند تركيز من 8 ميكرومتر (في ثقافة المتوسط) 4، أو علامة السيتوبلازم، على سبيل المثال calcein acetomethlyester بطلب للحصول على 40 دقيقة في تركيز من 5 ميكرومتر 3، أو غشاء المرتبطة الضيائي، على سبيل المثال بروتوبرفيرين التاسع الناجمة على حضانة ساعة 4 مع السلائف 5-أمينوليفولنيك حمض (5-ALA؛ 1 ملم) 4،5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع مستنبت أو الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) قبل المجهري مضان. &lt;/ لى&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر تستقيم، على سبيل المثال زايس Axioplan، واستبدال مكثف من قبل جهاز الإضاءة، كما هو موضح في المرجع. 3 مع نصفي كروية أو منشور زجاجي أسطواني نصفي بالإضافة إلى الشريحة بصريا كائن (انظر الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شعاع الليزر موازية موازى التي كتبها بعد التصوير منظور الزجاج والمكونات البصرية أخرى (مثل مرآة مقعرة) مرة أخرى في شعاع نتائج موازية على سطح العينة (telecentric راي التلميذ). الحرص على أن الناقل هو مجال كهربائي عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مرآة للتعديل الموجود داخل المكثف الذي التقط في الطائرة العينة وينير العينة تحت زاوية متغير من الإصابة (راي كائن). قد يكون الدافع وراء المرآة قابل للتعديل بواسطة محرك الخطوة، حيث كل موقف يتوافق مع زاوية محددة جيدا من الإصابة، على النحو الذي يحدده القياسات goniometric 3 </سوب&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة موقف الزاوي من المرآة للتعديل باستخدام الزاوية الحرجة = Θ ج 61،3 ° للانتقال الزجاج المياه كقيمة ثابتة. Θ يمكن ج يمكن تصور بناء على الاختلاف من Θ عندما يذوب صبغة الفلورسنت (على سبيل المثال 1 ملي النوكليوتيد فلافين، أحادي نوويد الفلافين) في الماء. موقف المرآة في Θ Θ = ج يتم تخزينها في المرآة برنامج تحديد المواقع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين المعلمات من الكاميرا (عودة مضيئة أندور Ixon EMCCD، DV887DC، ANDOR التكنولوجيا، بلفاست، المملكة المتحدة 6)، بما في ذلك درجة الحرارة زيادة وقت التسجيل، وسرعة التحول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام عدسة التكبير الهدف من الفتحة المناسبة والمعتدلة تفضيلي الرقمية (على سبيل المثال 40 × / 63 × 0،75 أو / 0،90 الغمر بالماء) وتوطين الشريحة الكائن في المجهر. استخدام زيت الغمر لضمان الاتصال البصري للعينة مع المنشور الزجاجي. تسجيل صور مضان من عينات متطابقة على الاختلاف منزاوية الإضاءة (Θ ≥ Θ Θ ج ج مع المقابلة إلى 64.5 ° للخلية واجهة من الزجاج). ويوصى مجموعة الزاوي من 66 ° -74 ° بخطوات من 0.5 ° ° 1 أو. استخدام تمريرة طويلة أو مناسبة الفرقة تمرير مرشح للكشف مضان. </li></ol> 3. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قراءة الصور (على سبيل المثال في شكل ASCII) سجلت في زوايا مختلفة Θ، فضلا عن إعدادات الكاميرا (على خلفية التمييز)، والطول الموجي الإثارة ومعاملات الانكسار للزجاج (ن 1 = 1.52) وخلايا (ن 2 = 1.37) في برنامج التقييم (ابفيف؛ NanoCell). لتحسب كل مجموعة من المعلمات اختراق عمق د (Θ) ونقل عامل T (Θ) تلقائيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الصور المستخدمة لتقييم الخلايا الركيزة المسافات وفقا لمعادلة Δ 5 (علامة الغشاء) أو المعادلة 4 (السيتوبلازم علامة) والصور فردية مع غير متجانسةويجوز منع الإضاءة (ه كاشفة، ز. المشارب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صور حساب الخلايا الركيزة طوبولوجيا وحدد رمز اللون المناسب للعرض. يمكن عرض ملامح خلال تقييم بكسل الفردية، كما هو مبين في الشكل 2. ويمكن استخدام هذه التشكيلات كمؤشر لجودة مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين بروتوكول التقييم. </li></ol> 4. ممثل النتائج وتجرى التجارب مع الممثلين إلى الخلايا المهندسة وراثيا ورم أرومي دبقي U251-MG المقدمة من السادة الأستاذ يناير Mollenhauer، قسم علم الأورام الجزيئي، جامعة جنوب الدنمارك، أودنسي. في اثنين من تلك الخلايا subclones U251 هي الجينات الكابتة للورم أو TP53 PTEN الإفراط في استخدام أعرب تيت على اساس نظام محرض التعبير، بحيث تظهر هذه الخلايا إلى احتمال انخفاض مكون للأورام ويمكن ان تعتبر أقل الخبيثة. وتستخدم الخبيثة للغاية U251-MG خلايا الجينات القامع ودون ضوابط، و-U251MG نوع الخلايا البرية عمل لمزيد من المقارنة. ويستخدم كمصدر للإثارة ليزر ديود التي ينبعث منها A سلسلة شبه مستمرة من البقول بيكو ثانية (40 ميغاهيرتز LDH400 مع سائق PDL 800-B، Picoquant، برلين، ألمانيا؛ الطول الموجي: 391 نانومتر؛:؛ نبض الطاقة معدل الرسوب 12 PJ). في الشكل 3 صور TIRFM من U251-MG الخلايا ورم أرومي دبقي مع الجين المنشط ورم القامع TP53 وحضنت مع laurdan (8 ميكرومتر، و 60 دقيقة) وصفت للزوايا الإصابة 66،0 °، 69.0 ° و 73.0 ° الموافق أعماق تغلغل زائل المجال الكهرومغناطيسي من حوالي 140 نانومتر و 75 نانومتر نانومتر و60، على التوالي. مع تناقص عمق الاختراق مضان يقلل كثافة في (انظر جداول)، وتنبع من مواقع أكثر سطحية من الخلايا (على سبيل المثال تنسيق الاتصالات على حوافها). خلية الركيزة مسافات (تصور في 3D الشكل من قبل رمز اللون تتراوح 0-600 نانومتر) تختلف بشدة على الخلايا بين علىلي بضعة نانوميتر (أبيض والأصفر) و250-300 نانومتر (الأحمر الداكن)، مثل الأسماء والتنسيق مسافات أكبر خلية الركيزة في منطقة قريبة. وينطبق ذلك على U251-MG ورم أرومي دبقي الخلايا مع الجينات القامع PTEN تنشيط (الشكل 4D)، في حين الخلايا الركيزة مسافات ثابتة بدلا عن U251-MG التحكم والخلايا النوع البري مع القيم النموذجية 80-100 نانومتر (أصفر؛ الشكل 4B ) و150-200 نانومتر (البرتقالي والاحمر، الشكل 4A). <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> الشكل 1. جهاز الإضاءة لVA-TIRFM في المجهر تستقيم. مرآة للتعديل يقودها محرك الخطوة يسمح قرار الزاوي ° ± 0.25. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> الملف الشخصي التقييم الرقم 2. لمدة PIX<html> ش (التخطيطي). عندما LN [I F / T (Θ)] يتم رسم بوصفها وظيفة من د / 1 (Θ)، المنحدر يمثل الركيزة الخلية Δ المسافة. عادة يتم تحديد هذا المنحدر مع دقة نحو ± 10٪. تم وضع علامة وتستبعد من التقييم - قيمة واحدة - الناتجة عن الإضاءة غير متجانسة. <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> الرقم 3 صور TIRFM من U251-MG ورم أرومي دبقي مع الخلايا الجينات TP53 تنشيط القامع على الحضانة مع laurdan (8 ميكرومتر، و 60 دقيقة). سجلت في زوايا مختلفة من الإضاءة (AC)؛ الخلية الركيزة مسافات تتراوح بين 0-600 نانومتر أظهرت من قبل رمز اللون (د)؛ الطول الموجي الإثارة: 391 نانومتر، وكشف: ≥ 420 نانومتر؛ حجم الصورة: 210 × 210 ميكرومتر ميكرومتر <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> . ogether.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الشكل 4" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig4.jpg" /> الشكل 4 الخلوي الركيزة مسافات U251-MG الخلايا glioblatoma في مجموعة من 0-600 نانومتر يتضح من رمز اللون؛ (أ) نوع البرية (ب) الضوابط، (ج) خلايا الجينات القامع مع المنشط TP53، (د) الخلايا مع المنشط PTEN الجينات القامع؛ الطول الموجي الإثارة: 391 نانومتر، وكشف: ≥ 420 نانومتر؛ حجم الصورة: 210 × 210 ميكرومتر ميكرومتر <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية</a> .

<ol>
	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

ووصف طريقة لقياس الخلايا بدقة الركيزة مسافات نانومتر. في الوقت الحاضر، وطرق فائقة القرار المجهر، مثلا على أساس منظم الإضاءة 7 أو على واحد 8-10 كشف جزيء وكذلك حفز استنفاد الانبعاثات (STED) المجهري 11 هي ذات أهمية كبيرة. أي من هذه التقنيات، ومع ذلك، يسم...

عندما شعاع ضوء نشر من خلال وسيط من ن معامل الانكسار 1 يلتقي واجهة لوسيلة الثاني من معامل الانكسار ن 2 &lt;ن 1، الانعكاس الداخلي الكامل يحدث في جميع زوايا Θ الإصابة، والتي هي أكبر من الزاوية الحرجة = Θ ج جيب الزاوية القوسي (ن 2 / ن 1). على الرغم من أن تنعكس تماما شعاع ضوء الحادث يثير حقل الكهرومغناطيسي التي تخترق زائل في المتوسطة الثانية ويضمحل بشكل كبير، مع عمودي المسافة Z من واجهة وفقا لI (ض) = I 0 EZ / د (Θ). I (ض) يتوافق مع شدة المجال الكهرومغناطيسي ود (Θ) إلى عمق الاختراق في الطول الموجي λ، كما تم تقديمها من قبل د (Θ) = (λ/4π) (ن 1 2 2 الخطيئة Θ - ن 2 2) -1 / 2 كما ورد في الأدب 1،2، I 0 </sيو بي&gt; يتوافق مع شدة الضوء الساقط مضروبا I ه مع ناقل حركة T عامل (Θ) ونسبة ن 2 / ن 1. إذا كان الحقل الكهربائي المتجه من هذا شعاع ضوء عمودي الاستقطاب لطائرة من الإصابة (أي طائرة امتدت من جراء الحادث وينعكس شعاع)، ويرد هذا العامل انتقال المرض من خلال T (Θ) = 4 جتا 2 Θ / [1 - (ن 2 / NL 1) 2] لكثافة مضان الكشف في القياسات TIRFM، امتصاص الضوء يجب أن تكون متكاملة على جميع طبقات من العينة وتضاعفت مع العائد مضان η الكم من الصبغة ذات الصلة وكذلك مع زاوية صلبة من Ω الكشف. وكما ذكر سابقا 3 يمكن أن توصف هذه الكثافة من قبل I F (Θ) = AT (Θ) شو (ض) E-Z / د (Θ) DZ إذا جميع العوامل التي هي مستقلة و<html> يمكن حلها المضغوط يتم تضمين زاوية السقوط Θ وZ تنسيق داخل المعادلة A. ثابت التجريبية 3 التحليلية، إذا تم اعتبار تركيز ج (ض) من fluorophores أن تكون ثابتة تقريبا - إما في جميع Δ ≥ Z إحداثيات، على سبيل المثال داخل السيتوبلازم من الخلايا وجود Δ المسافة من واجهة. في هذه الحالة، لابد من لا يتجزأ من حساب Δ = Z = ∞ إلى الياء مما أدى إلى I F = A ج T (Θ) د (Θ) E-Δ / د (Θ) - أو بين Z = Δ - T / 2 و z = Δ + T / 2، أي في غضون طبقة رقيقة من سمك ر، على سبيل المثال غشاء الخلية تقع على مسافة Δ من واجهة. في هذه الحالة، يمكن حساب كثافة مضان كما I F = A ج T (Θ) TE-Δ / د (Θ)، إذا ر صغير بالمقارنة مع Δ. يمكن الأنف والحنجرة &quot;&gt; من المعادلات (4) و (5) مسافات الخلايا الركيزة تحسب Δ، إذا سجلت صور كثافة مضان I F لمتغير الزوايا Θ، وإذا LN (I F / T د) (مكافئ 4) أو يتم تقييم LN (I F / T) (مكافئ 5) بوصفها وظيفة من 1 / د لهذه الزوايا. للغشاء laurdan علامة المستخدمة في هذه الورقة (س. أدناه) تم إجراء تقييم وفقا للمعادلة 5. وكما ذكر سابقا 3 الحصول على الصور، ويتطلب التقييم - توزيع متجانس للضوء أكثر إثارة العينة، - صلاحية نموذج 2-طبقة (مع مؤشرات الانكسار ن 1 ن 2 لوالركيزة والسيتوبلازم، على التوالي). هذا يحمل، إذا كان غشاء البلازما هي رقيقة جدا، وإذا كانت الطبقة المتوسطة من خارج الخلية (بين الخلية والركيزة) صغير مقارنة مع الطول الموجي للضوء الحادث. وبالإضافة إلى ذلك، فتحة معتدلة العددية(عادة A ≤ 0.90) من عدسة المجهر الهدف هو مفيد لتجنب الانحرافات من السطوع بسبب تباين الإشعاع في حقل بالقرب من واجهة عازلة.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم </td><td> شركة </td><td> نوع </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> حاضنة </td><td> نونك </td><td> نونك Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> الصفحي تدفق </td><td> HOLTEN الآمن </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10٪ + 1٪ FCS البنسلين / الستربتوميسين </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> زراعة المتوسطة </td></tr><tr><td> كائن الشرائح الزجاجية </td><td> مارينفيلد </td><td> بيضاء نقية الزجاج </td><td> إجراء التنظيف المستخدمة خاصة </td></tr><tr><td> 6 dodecanoyl-2-dimethylamino النفثالين (laurdan) </td><td> الجزيئية مجسات </td><td></td><td> الفلورسنت علامة (محلول المخزون: 2 مم في الإيثانول) </td></tr><tr><td> مجهر </td><td> كارل زايس </td><td> Axioplan 1 </tد&gt; <td></td></tr><tr><td> ليزر ديود </td><td> PicoQuant </td><td> LDH 400 مع السائق PDL 800-B </td><td> الطول الموجي: 391 نانومتر </td></tr><tr><td> واحد وضع نظام الألياف </td><td> نقطة المصدر </td><td> kineFlex </td><td> يستخدم مع عدسات الموازاة </td></tr><tr><td> EMCCD الكاميرا </td><td> ANDOR </td><td> DV887DC </td><td> الكاميرا الخلفية مضاءة </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

يتم تحديد سطح طوبولوجيا، على سبيل المثال من الخلايا المتزايد على ركيزة، بدقة نانومتر بواسطة متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM). تزرع الخلايا على شرائح شفافة وحضنت مع علامة نيون متجانس في توزيع غشاء البلازما الخاصة بهم. الإضاءة يحدث من قبل شعاع الليزر موازية تحت زوايا متغير من التأمل الداخلي الإجمالي (TIR) ​​مع اختراق أعماق مختلفة من المجال الكهرومغناطيسي زائل. تسجيل الصور مضان على التشعيع في حوالي 10 زوايا مختلفة يسمح لحساب الخلية الركيزة المسافات مع دقة بضعة نانوميتر. وبالتالي يتم تحديد الاختلافات في الالتصاق بين مختلف خطوط الخلايا، مثل الخلايا السرطانية والخلايا الخبيثة أقل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن فحص التغييرات المحتملة من التصاق الخلية عند الكيميائية أو العلاج الضوئي. بالمقارنة مع غيرها من أساليب فائقة القرار يتم الاحتفاظ المجهر التعرض للضوءومن المتوقع الضرر صغيرة جدا، وليس من الخلايا الحية أن تحدث.

Watch this Scientific Journal Video about Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM at JoVE.com

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

يتم قياس طوبولوجيا من التصاق الخلية على ركيزة بدقة نانومتر بواسطة متغير الزاوية الداخلية انعكاس مجموع المجهري مضان (VA-TIRFM).

Nanotopology من التصاق الخلايا على متغيرة الزوايا الداخلية انعكاس إجمالي مضان المجهري (VA-TIRFM)

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K Views.  Institut für Angewandte Forschung. يتم قياس طوبولوجيا من التصاق الخلية على ركيزة بدقة نانومتر بواسطة متغير الزاوية الداخلية انعكاس مجموع المجهري مضان (VA-TIRFM).

Video: Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

تصور منظمة اللحاء وحيوية في الكائنات الدقيقة، وذلك باستخدام المجموع الإسفار التأمل الداخلي المجهر

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

Bead Aggregation Assays for the Characterization of Putative Cell Adhesion Molecules

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions for many of these proteins are poorly understood. Here we present a simple, rapid method for characterizing the adhesive properties of putative homophilic cell adhesion molecules. Cultured HEK293 cells are transfected with DNA plasmid encoding a secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell surface protein. Using functionalized beads specific for the epitope tag, the soluble, secreted fusion protein is captured from the culture medium. The coated beads can then be used directly in bead aggregation assays or in fluorescent bead sorting assays to test for homophilic adhesion. If desired, mutagenesis can then be used to elucidate the specific amino acids or domains required for adhesion. This assay requires only small amounts of expressed protein, does not require the production of stable cell lines, and can be accomplished in 4 days.

Here we present a simple, rapid method for characterizing the intrinsic adhesive properties of putative cell adhesion molecules. The secreted, epitope-tagged ectodomain of a cell adhesion molecule is captured from the culture medium on small, uniform functionalized beads. These beads can then be used immediately in simple bead aggregation assays.

حبة تجميع فحوصات لتوصيف المزعومين خلية التصاق جزيئات

Cell-cell adhesion is fundamental to multicellular life and is mediated by a diverse array of cell surface proteins. However, the adhesive interactions ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

باستخدام الممانعة الخلوي الركيزة ويعيش التصوير خلية قياس التغييرات في الوقت الحقيقي في التصاق الخلوية ودي التصاق المستحث بواسطة مصفوفة تعديل

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Wet Chemistry and Peptide Immobilization on Polytetrafluoroethylene for Improved Cell-adhesion

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly interesting for already approved polymers that have a long standing use in medicine because these materials are well characterized and legal issues associated with the introduction of newly synthesized polymers may be avoided. Polytetrafluoroethylene (PTFE) is one of the most frequently employed materials for the manufacturing of vascular grafts but the polymer lacks cell adhesion promoting features. Endothelialization, i.e., complete coverage of the grafts inner surface with a confluent layer of endothelial cells is regarded key to optimal performance, mainly by reducing thrombogenicity of the artificial interface.
This study investigates the growth of endothelial cells on peptide-modified PTFE and compares these results to those obtained on unmodified substrate. Coupling with the endothelial cell adhesive peptide Arg-Glu-Asp-Val (REDV) is performed via activation of the fluorin-containing polymer using the reagent sodium naphthalenide, followed by subsequent conjugation steps. Cell culture is accomplished using Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and excellent cellular growth on peptide-immobilized material is demonstrated over a two-week period.

Cell-adhesiveness is key to many approaches in biomaterial research and tissue engineering. A step-by-step technique is presented using wet-chemistry for the surface modification of the important polymer PTFE with peptides.

الرطب الكيمياء والببتيد الشلل على تترافلوروإيثيلين لتحسين خلية التصاق

Endowing materials surface with cell-adhesive properties is a common strategy in biomaterial research and tissue engineering. This is particularly ...

Mammalian Cell Division in 3D Matrices via Quantitative Confocal Reflection Microscopy

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic significance. Possible reasons for the lack of exploration are the experimental limitations and technical challenges that render the study of cell division in 3D culture inefficient. Here, we describe an imaging-based method to efficiently study mammalian cell division and cell-matrix interactions in 3D collagen matrices. Cells labeled with fluorescent H2B are synchronized using the combination of thymidine blocking and nocodazole treatment, followed by a mechanical shake-off technique. Synchronized cells are then embedded into a 3D collagen matrix. Cell division is monitored using live-cell microscopy. The deformation of collagen fibers during and after cell division, which is an indicator of cell-matrix interaction, can be monitored and quantified using quantitative confocal reflection microscopy. The method provides an efficient and general approach to study mammalian cell division and cell-matrix interactions in a physiologically relevant 3D environment. This approach not only provides novel insights into the molecular basis of the development of normal tissue and diseases, but also allows for the design of novel diagnostic and therapeutic approaches.

This protocol efficiently studies mammalian cell division in 3D collagen matrices by integrating synchronization of cell division, monitoring of division events in 3D matrices using live-cell imaging technique, time-resolved confocal reflection microscopy and quantitative imaging analysis.

انقسام الخلية الثديية في مصفوفات ثلاثية الأبعاد عن طريق الفحص المجهري انعكاس [كنفوكل] الكمية

The study of how mammalian cell division is regulated in a 3D environment remains largely unexplored despite its physiological relevance and therapeutic ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...