저자는 나라 바덴 - 뷔 르템 베르크와 Europäische 연합 (EU) - Europäischer Fonds 모피 다이 regionale Entwicklung 감사합니다 - 자금 ZAFH - 광자 N, 아니 기금 연구 기금에 대한 Bundesministerium 털 Bildung 숙녀 Forschung (BMBF)에. 1792C08뿐만 아니라 프로젝트 &quot;Aurami&quot;을 융자의 바덴 - 뷔 르템 베르크 - Stiftung GmbH가.

1. 셀 심는과 부화 <ol><li> 시드 개별 세포, 예를 들어 U373-MG 나 U-251-MG의 glioblastoma 세포 유리 슬라이드에 100 세포 / mm 2의 전형적인 밀도와 (예 : RPMI 1640 10% 태아 송아지 혈청 보충 문화 매체에서 4,872 시간을 위해 성장 37에서 보육을 사용하여 항생제) ° C 5 % CO 2. </li><li> 막 마커, 예를 들어 6 dodecanoyl-2-디메틸 아미노 8 μM (문화 매체)를 4 또는 세포질 표시의 농도에서 60 분 신청 나프탈렌 (laurdan)는, 예를 들어 calcein acetomethlyester은 40 분 신청과 함께 세포를 배양 4,5, 5 μM 3 또는 photosensitizer 관련된 멤브레인의 농도는, 예를 들어 protoporphyrin IX는 전구체 5 aminolevulinic 산 (1 MM 5 알라)는 4 시간의 부화에 유도. </li><li> 문화 중간이나 인산염으로 세포를 씻어 염분 (PBS)는 형광 현미경하기 전에 버퍼. &lt;이/ 리&gt; </ol> 2. VA-TIRFM <ol><li> 수직 현미경, 예를 Zeiss Axioplan를 사용하여 참조에 설명 된대로, 조명 장치에 의해 그것의 콘덴서를 교체하십시오. 헤미 - 구형 또는 광학 (그림 1 참조) 객체 슬라이드에 커플 링 된 헤미 - 원통형 유리 프리즘과 3. </li><li> 병렬 평형 레이저 빔을 사용하는 유리 프리즘 다시 추가로 광학 부품 (예 : 오목 거울) 샘플의 표면 (텔레 센 트릭 학생 선)에 평행 빔의 결과로 이미징 후. 전기장 벡터가 입사 평면에 수직 편광 것을 조심하고. </li><li> 샘플면에서 이미징 및 발생의 변수 각도 (개체 레이)에서 샘플을 조명하는 콘덴서 내부에 위치한 조절 미러를 사용합니다. 각 위치 입사 잘 정의 된 각도에 해당하는 곳 goniometric 측정 3 결정으로 조절 거울은, 단계 모터에 의해 구동 될 수있다 </&gt;를 논의하게 될 것입니다. </li><li> 중요한 각도를 사용하여 조절 미러의 각도 위치를 보정 Θ C = 61.3 ° 고정 값으로 유리 물 전환을위한. Θ C는 형광 염료 (예 : 1 ㎜ 플라 빈의 mononucleotide, FMN)가 물에 용해되어 Θ의 변화에 따라 시각화 할 수 있습니다. 에서 거울의 위치 Θ = Θ C 미러 위치 프로그램에 저장됩니다. </li><li> 온도, 이득, 녹화 시간과 이동 속도를 포함하여 카메라의 매개 변수를 (다시 조명 ANDOR Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR 기술, 벨파스트, UK 6)으로 설정합니다. </li><li> 적절한 배율과 우선적으로 적당한 숫자 개구 (예 : 40 × / 0.75 또는 63 × / 0.90 물 침적)의 목적 렌즈를 사용하고 현미경의 객체 슬라이드를 현지화. 유리 프리즘과 샘플의 광학 접촉을 보장하기 위해 집중 오일을 사용합니다. 의 변화에​​ 따라 동일한 샘플의 형광 이미지를 기록조명의 각도 (Θ ≥ Θ C Θ와 C 셀 유리 인터페이스 64.5 °에 해당). 0.5 ° 또는 1 °의 단계를 66 ° -74 °의 각도 범위를 권장합니다. 형광 검출에 적합한 긴 패스 또는 밴드 패스 필터를 사용합니다. </li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 다양한 각도 Θ뿐만 아니라 카메라 설정 (배경 차별에 대한), 여기 파장과 유리의 굴절 지수 (= 1.52 N 1) 셀에 기록 된 이미지를 (ASCII 형식으로 예를 들어) (N 2 = 1.37) 읽기 평가 프로그램에 (LabView, NanoCell). 에 대한 매개 변수 침투 깊이 D (Θ)와 전송 계수 T (Θ)의 각 집합이 자동으로 계산됩니다. </li><li> 수식 5 (막 마커) 또는 수식 4 (세포질 마커), inhomogeneous있는 개별 이미지에 따라 Δ 셀 기판 거리의 평가에 사용되는 이미지를 선택조명 (누설 E, G. 줄무늬)이 제외 될 수 있습니다. </li><li> 셀 기판 토폴로지의 이미지를 계산 및 디스플레이에 적합한 색상 코드를 선택합니다. 도 2에 도시로 개별 픽셀의 평가 프로파일 동안은 표시 할 수 있습니다. 이 프로필은 피팅의 품질에 대한 지표로 사용할 수 있습니다. </li><li> 평가 프로토콜을 저장합니다. </li></ol> 4. 대표 결과 대표 실험은 친절 교수 월 Mollenhauer, 분자 종양학학과, 남부 덴마크 대학, 오덴세 (Odense)가 제공하는 유전 공학 U251-MG의 glioblastoma 세포를 수행하고 있습니다. 그 U251 세포의 두 subclones에서 종양 억제 유전자 TP53 또는 PTEN이 사용하는 오버 표현됩니다 Tet-에 inducible 표현 시스템이 세포가 감소 tumorigenic 잠재력을 전시하고 더 악성으로 간주 될 수 있다는 등.주세요 억제 유전자가없는 높은 악성 U251-MG 세포는 컨트롤로 사용하고, U251-아르MG 야생 형 세포는 더 비교 제공합니다. picosecond 펄스의 준 연속 시리즈 (; 391 나노 미터, 펄스 에너지 : 12 PJ, 반복 속도 : 파장 드라이버 PDL 800-B, Picoquant, 베를린, 독일과 LDH400 40 MHz의) 배출 레이저 다이오드는 여기 소스로 사용됩니다. 그림에서 활성 TP53 종양 억제 유전자로하고 laurdan (8 μM, 60 분)와 incubated U251-MG의 glioblastoma 세포의 3 TIRFM 이미지는 66.0 °의 입사 각도 69.0 °와 73.0 °의 침투 깊이에 해당하는에 그려져있다 약 140 nm의 사라져가는 전자기 분야, 75 nm의 60 nm의, 각각. 침투 깊이 형광을 감소와 함께 강도 감소 (비늘 참조) 세포의 더 많은 외면 사이트 (자신의 가장자리에 예를 들면 초점 연락처)에서 유래 된 것입니다. 셀 - 기판 거리가 (0-600 나노 미터 사이 인 색상 코드로 그림 3D로 시각화) 강력에 간 세포를 통해 다양통증이 몇 나노 미터 (흰색 - 노란색)과 250-300 nm의 (어두운 빨강), 즉 초점 연락처 및 큰 셀 기판 거리가 가까운 근처에 있습니다. 그림 4B, 셀 기판 거리가 U251-MG 제어 및 80-100 nm의 전형적인 값으로 야생 형 세포 (노란색에 오히려 상수를하는 동안 동일한 활성 억제 유전자 PTEN (그림 4D)와 U251-MG의 glioblastoma 세포에 대한 보유 )과 150-200 nm의 (오렌지 레드,도 4a). <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> 그림 1. 직립 현미경의 VA-TIRFM을위한 조명 장치. 단계 모터에 의해 구동 조절 거울은 ± 0.25 °의 각도 해상도를 할 수 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> 한 PIX에 대한 그림 2. 평가의 프로필엘 (설계도). 언제 에선 [I F / T (Θ)]는 1 / D (Θ)의 함수로 도시된다, 경사가 셀 - 기판 거리 Δ를 나타냅니다. 이 경사는 일반적으로 약 정밀 ± 10 %로 결정된다. 한 값은 - inhomogeneous 조명으로 인한 - 표시 및 평가에서 제외되었습니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> 그림 3 laurdan (8 μM, 60 분)와 부화시 활성 TP53 억제 유전자와 U251-MG의 glioblastoma 세포의 TIRFM 이미지를 표시합니다. 조명의 다양한 각도 (AC)로 기록, 0-600 nm의 범위에서 셀 기판 거리가 게재 391 나노 미터, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 : 여기 파장, 색상 코드 (D)에 의해. 210 μm × 210 μm은 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . 그림 4 색 코드에 의해 표시 0-600 nm의 범위에서 U251-MG의 glioblatoma 전지의 셀 - 기판 거리,. () 야생 유형 (B) 컨트롤, 활성 억제 유전자 TP53와 (C) 전지, (D) 활성 억제 유전자 PTEN과 세포, 여기 파장 : 391 nm의, 감지 : ≥ 420 nm의, 이미지 크기 :. 210 μm × 210 μm은 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> .

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관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

방법은 나노 미터 정밀도와 셀 기판 거리를 측정하기위한 설명되어 있습니다. 현재, 슈퍼 해상도 현미경의 방법은, 예를 들어 구조화 된 조명 7 일 또는 단일 분자 검출 8-10뿐만 아니라 자극 방출 고갈 (전혀 두려움을 모르는 강인한) 현미경 11 상당한 관심을 끌 수있는을 기반으로합니다. 이러한 기술 중 어느 것도 그러나, 50 nm의 아래 축 해상도를 허용하지 않습니다...

굴절률 N (1)의 중간을 통해 확산 광 빔이 굴절률 N 2의 두 번째 중간에 인터페이스를 만났을 때 &lt;N 1, 총 내부 반사가 중요한 각도보다 큰 발생 Θ의 모든 각도에서 발생 Θ C = arcsin (N 2 / N 1). 완전히 반영되지에도 불구하고 입사 광 빔은 I에 따라 두 번째 매체와 인터페이스에서 수직 거리를 Z로 기하 급수적으로 쇠퇴에 침투 사라져가는 전자기 필드를 세상의 시작과 끝 (Z) = I 0 EZ / D (Θ). I (z는) 등으로 주어진 파장 λ의 침투 깊이로 전자 분야와 D (Θ)의 강도에 해당 D (Θ) = (λ/4π) (N 1 2 죄가 두 Θ - N 2 2) -1 / 2 문학 1,2에보고로서, 0 </sUB&gt;는 I 이메일이 전송 요소 T (Θ) 및 비율 N 2 / N 1 곱한 입사광의 강도에 해당합니다. 이 광 빔의 전기장 벡터가 입사 평면 (사건과 반사 빔이 사라지는 비행기 IE)에 편광 수직 인 경우,이 전송 요소가 주어집니다 T (Θ) = 4 왜냐하면이 Θ / [1 - (N 2 / NL 1) 2] TIRFM 측정에서 검출 된 형광 강도를 들어, 광 흡수는 시료의 모든 레이어를 통해 통합과 관련 염료의 형광 양자 수율 η로뿐만 아니라 감지 Ω의 고체 각도 곱해야합니다. 이전에 3보고,이 강도는에 의해 설명 될 수있다 I F (Θ) = (Θ) OC (Z) AT 전자 Z / D (Θ) dz 경우 독립적 인 F있는 모든 요소<html> fluorophores의 농도 C (Z)이 거의 일정으로 간주되는 경우 ROM이 입사 각도 Θ과 좌표 Z는 실험 상수 A. 방정식 3에서 포함되어 있습니다이 analytically 해결 될 수 - 중 모든 좌표 Z ≥ Δ에서 인터페이스에서 거리 Δ을 갖는 세포의 세포질 내에서 지정할 수있다. 이 경우 적분은 Z = Δ부터 Z = ∞ 결과 계산해야합니다 I F = C T (Θ) D (Θ) E-Δ / D (Θ) - 또는 Z 사이 = Δ - t / 2, Z = Δ + t / 2, 두께 t의 얇은 층 내에서 즉, 예를 들어 인터페이스에서 거리 Δ에있는 세포막. 이 경우 형광 강도는 다음과 같이 계산 될 수있다 I F = C T (Θ) 테-Δ / D (Θ), t는 Δ에 비해 작은 경우. 형광 강도 I F의 이미지가 변수 각도에 기록하는 경우 방정식 (4)와 (5) 셀 기판 거리에서 다닐 &quot;&gt;는 Δ는 계산 될 수있다 Θ 있으며, 경우 후면 (I F / T D) (Eq. 4) 또는 후면 (I F / T) (Eq. 5) 이러한 각도 1 / D의 함수로 계산됩니다.이 문서에 사용 된 막 마커 laurdan (S. 아래)에 대한 평가가 EQ 5.에 따라 수행되었다. 이전 3, 이미지 수집보고 및 평가가 필요로 - 샘플을 여기 빛의 균일 한 분배, - 2 층 모델 (기판과 세포질의 굴절 지수 N 1과 N 2, 각각)의 타당성. 플라즈마 막가 매우 얇은 경우이 보유하고 있으며, 세포 매체 (셀과 기판 사이)의 층은 입사광의 파장에 비해 작은 경우. 또한, 중간 수치 개구(일반적으로 ≤ 0.90) 현미경 대물 렌즈의는 유전체 인터페이스의 가까운 분야에서 방사선의 이방성에 의한 밝기의 편차를 방지하기 위해 바람직하다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 이름 </td><td> 회사 </td><td> 유형 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> 보육기 </td><td> Nunc </td><td> Nunc Cellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td> 층류 </td><td> 안전 Holten </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM + 10% FCS + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> BIOCHROM </td><td></td><td> 재배 매체 </td></tr><tr><td> 유리 객체 슬라이드 </td><td> Marienfeld </td><td> 순수 흰색 유리 </td><td> 사용되는 특별한 청소 절차 </td></tr><tr><td> 6 - dodecanoyl-2-디메틸 아미노 나프탈렌 (laurdan) </td><td> 분자 프로브 </td><td></td><td> 형광 마커 (증권 솔루션 : 에탄올 2 ㎜) </td></tr><tr><td> 현미경 </td><td> 칼 Zeiss </td><td> Axioplan 1 </tD&gt; <td></td></tr><tr><td> 레이저 다이오드 </td><td> PicoQuant </td><td> 드라이버 PDL 800-B와 LDH 400 </td><td> 파장 : 391 nm의 </td></tr><tr><td> 단일 모드 광섬유 시스템 </td><td> 포인트 소스 </td><td> kineFlex </td><td> collimating 광학와 함께 사용 </td></tr><tr><td> EMCCD 카메라 </td><td> ANDOR </td><td> DV887DC </td><td> 다시 조명 카메라 </td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

표면 토폴로지, 기판에 성장 세포의 예는 가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터 정밀도로 결정됩니다. 전지는 투명 슬라이드에 재배하고 homogeneously의 플라즈마 막에 배포 형광 마커와 incubated 수 있습니다. 조명이 사라져가는 전자기 필드의 다른 침투 깊이있는 총 내부 반사 (티르)의 변수 각도에 따라 병렬 레이저 빔에 의해 발생합니다. 10 다른 각도에서 조사시 형광 이미지의 기록은 몇 나노 미터의 정밀도로 셀 기판 거리를 계산 할 수 있습니다. 다양한 세포 라인, 예를 들어 암 세포의 정확성과 악성 세포 사이 접착력의 차이 따라서 결정됩니다. 또한, 화학 또는 photodynamic 치료시 세포 접착의 가능한 변경 사항은 검사를 할 수 있습니다. 슈퍼 해상도의 다른 방법에 비해 현미경 조명에 노출이 유지된다살아있는 세포의 아주 작은, 알 수없는 피해가 발생할 것으로 예상된다.

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.

가변 각도 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)시 세포 접착의 Nanotopology

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K 조회수.  Institut für Angewandte Forschung. 기판 상에 세포 접착의 토폴로지는 가변 앵글 총 내부 반사 형광 현미경 (VA-TIRFM)에 의해 나노 미터의 정밀도로 측정됩니다.