وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الطيار والجدوى منحة دراسة من جامعة كاليفورنيا-CURE سنتر، والتهاب القولون كرون ومؤسسة جائزة الوظيفي أمريكا التنمية (# 2691) والمعهد الوطني للصحة NIDDK K01 (DK084256) لتمويل هون واي KOON. وساعد عملية التشعيع نخاع العظام من ليفين وبرنار سكوت مطبخ مركز UCLA للبحوث الإيدز ماوس / مرفق الإنسان الأساسية الوهم. وساعد تدفق الخلوي بواسطة عملية منشأة UCLA الأساسية المتجهات.

1. قبل بدء أنت بين الاعتبارات الفنية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوصي باستخدام كل C57/BL6 البرية من نوع الفئران والفئران خروج المغلوب للتجربة لأنه يمكن شراؤها الفئران مع جزيئات CD المقابلة من الباعة الماوس كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأنه من الصعب تتبع الفئران البرية من نوع الفئران خروج المغلوب وتستمد الخلايا المانحة بعد زرع نخاع العظام، فمن الضروري استخدام CD45.1 الفئران لتمثيل البرية من نوع الفئران. (WT CD45.1 الفئران C57/SJL الأسهم المختبرات جاكسون # 002014). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معظم المستعمرات الماوس هي CD45.2. الفئران خروج المغلوب لدينا تنتمي إلى التركيب الوراثي CD45.2 (بدلا من ذلك CD45.2 الفئران WT المصدر: جاكسون المختبرات الأسهم # 000664). لا يمكن أن يؤديها تحديد النمط الجيني CD45.1 أو CD45.2 باستخدام التدفق الخلوي من نخاع العظم والدم المحيطي على النحو المذكور في المادة 7 في هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقد خطر الفئران بعد التشعيع الحصانة. الحفاظ على الفئران في منشأة خالية من مسببات الأمراض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتطلب تشغيل irradiator الأمن الخاصة clearancه والتدريب. لتوفير الوقت في عمليات التدريب والموافقة، فمن الأفضل أن يتعاون مع مختبر مع فني مؤهل قادر على تشغيل irradiator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العديد من المؤسسات لديها مختبرات قياس التدفق الخلوي مع الفنيين من ذوي الخبرة. للحد من مشاكل مع عملية التدفق الخلوي، فمن الأفضل لمناقشة تجربة الخلوي الخاص بك خطة التدفق مع فني من ذوي الخبرة قبل البدء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم تعيين الفئران بهذه الطريقة (10 الفئران في كل مجموعة): </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مجموعة </td><td></td><td> متبرع بنخاع العظام إلى المتلقي </td><td> علاج </td></tr><tr><td> A </td><td> BM تبادل </td><td> CD45.1 WT CD45.2 إلى KO </td><td> DSS التهاب القولون </td></tr><tr><td> B </td><td></td><td></td><td> التحكم في المياه العادية </td></tr><tr><td> C </td><td> BM تبادل </td><td> CD45.2 KO لWT CD45.1 </td><td> DSS التهاب القولون </td></tr><tr><td> D </td><td></td><td></td><td> التحكم في المياه العادية </td></tr><tr><td> E </td><td> زيف </td><td> CD45.1 WT CD45.1 إلى WT </td><td> DSS التهاب القولون </td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td> التحكم في المياه العادية </td></tr><tr><td> G </td><td> زيف </td><td> KO KO CD45.2 لCD45.2 </td><td> DSS التهاب القولون </td></tr><tr><td> H </td><td></td><td></td><td> التحكم في المياه العادية </td></tr></tbody></table> يظهر الرسم التوضيحي A * موجز لبروتوكول تجريبي في الشكل 1. 2. المتلقي الفئران تشعيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هي ولدت الفئران ويحتفظ بها في الممرض خالية المرفق. مكان الفئران في فطيرة تشعيع تعقيمها مع فلتر. مكان واحد الماوس في كل فتحة من فطيرة التشعيع. وضع الكعكة في irradiator وتأكد من أن القرص الدوار وفطيرة يتجهون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة الهواءللتهوية. إغلاق باب irradiator وقفله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرق على الفئران مع 1،000 راد (أي ما يعادل 10 غراي) حوالي 10 دقيقة (اعتمادا على مصدر الإشعاع ونصف الحياة). من هذه النقطة الزمنية، هي الفئران المشععة المناعية للخطر ويكون ضعف جهازهم المناعي ضد العدوى. بعد التشعيع، واتخاذ فطيرة من معلومات ووضعه في وعاء معقم لنقل إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية في منشأة للحيوانات. تجنب تعريض الفئران لبيئة خارجية لتقليل فرصة الإصابة بالمرض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، نقل الفئران في أقفاص الماوس تعقيمها مع الفراش تعقيمها (4 الفئران في قفص إضافة الماء المعقم جديدة مع التعليق sulfatrim - 3،12 مل لكل 100 مل من الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف زجاجة مياه مع رقائق الألومنيوم والمضادات الحيوية هي الحساسة للضوء. يهز لخلط الزجاجة جيدا قبل حل sulfatrim التحميل إلى القفص. </li></ol> 3. استخراج المانحة نقي العظم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران مع ثاني أكسيد الكربون أو isoflurتعصب وتزج في حل ثم اللايسول 1:200. رش الفئران مع الايثانول 70٪ إلى الجلد الرطب وتشريح العظام مفتوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع في الصكوك تشريح الايثانول 70٪ للتعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تشريح في خزانة السلامة الأحيائية. استخدام أدوات معقمة لفضح تشريح العضد، عظم الفخذ، الساق وعظام الشظية، وخالية من ربط العضلات والأربطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض فتح طرفي العظام لإظهار نخاع العظام الأحمر. عقد العظام مع ملقط. مسح نخاع العظام الأحمر خارجا مع PBS الباردة مع حقنة مل 3 و الإبر 25G إلى طبق بيتري. طرد من كلا طرفي العظام لانتاج خلايا نخاع العظام أكثر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 6 مل المحاقن والإبر 18G1 / 2 لكسر الأحمر المقابس نخاع العظام بواسطة طموح المتكررة وطرد. نقل نخاع العظام مع 50 مل أنابيب الصقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور نخاع العظم عليها في 1،800 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف، إعادة تعليق بيليه من قبل vortexing لثانية 5-10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 10X العازلة تحلل RBC مع الماء المعقم. إعلاند تحلل RBC 1X العازلة (5 مل لكل الماوس المانحة)، ومرة ​​أخرى لمدة 5 دوامة ثانية والحفاظ 3 دقائق بالضبط في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 3 دقائق، وملء الأنابيب مع 20 مل PBS الباردة لوقف تحلل والمزيج. صب المحتوى من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرون مباشرة إلى 50 عضوا جديدا أنبوب فالكون مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شطف الأنابيب الأصلي مع 5 مل من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى مصفاة الخلية أيضا. أعلى ما يصل الى 50 مل PBS مع والمزيج. </li></ol> 4. عد خلايا العظام متبرع بنخاع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان إلى أنبوب إيبندورف و 100 ميكرولتر من التعليق نخاع العظم لأنبوب إيبندورف والمزيج. ماصة الخليط الملون الخلية إلى عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم احتساب مبلغ إجمالي عدد الخلايا عن طريق خلايا نخاع العظام الذين يعيشون في أنابيب فالكون = عدد الخلايا غير ملوثين في 16 المربعات X 2 (بسبب تخفيف الأزرق التريبان) × 10000 × 50 مل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل خلايا نخاع العظام في 50 مل أنابيب الصقر في 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف. تستندعلى إجمالي عدد الخلايا، وإعادة تعليق بيليه مع PBS ل1 × 8 10 خلايا لكل مل </li></ol> 5. التسريب على الفئران المتلقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفئة الفئران المتلقية على وسادة الحرارة وتحت مصباح الاحترار. وضع المتلقي في الفئران restrainer. حقن 1 × 10 7 خلية لكل ميكرولتر 100-200 الماوس في الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويجب أن يتم حقن نخاع العظام بين 4-24 ساعة المانحة بعد التشعيع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على ما يصل إلى 4 حقن الفئران في قفص. الحفاظ على الفئران المتلقية حقن في أقفاص تعقيمها بالماء المضادات الحيوية لمعاملة لأول 4 أسابيع في منشأة الممرض الحيوانية مجانا والسماح للفئران استعادة الحصانة. أقفاص التغيير، والمضادات الحيوية المعاملة الماء والغذاء كل 4 أيام للحفاظ على النظافة. </li></ol> 6. تحريض التهاب القولون التهاب القولون وتقييم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 أسابيع بعد زرع نخاع العظام وأشعة، والتحول إلى المياه العادية دون المضادات الحيوية والحفاظ على الفئران لمدة 2 أسابيع أخرى لاستعادة وضعها الطبيعيالقناة الهضمية الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 أسابيع بعد الحقن نخاع العظم، وقياس وزن الجسم الأولي. يتم إعطاء بعض الفئران 5٪ كبريتات ديكستران في مياه الشرب libitum الإعلانية للحث على التهاب القولون. يتم إعطاء بعض الفئران العادية مياه الشرب فقط مجموعات المراقبة العادية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 أيام في وقت لاحق، سحب الدم المحيطي، ونقل إلى أنابيب مغلفة الهيبارين (Vacutainer) ونضع في الجليد. تجمع الدم في الفترة من 4 إلى 1 أنبوب الفئران. الجمع بين 300 ميكرولتر من الدم مع 300 ميكرولتر من العازلة تلطيخ الخلايا = 600 ميكرولتر. تقسيم الدم إلى أنابيب إيبندورف 5، مع 100 ميكرولتر لكل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران مع ثاني أكسيد الكربون أو isoflurane. تقييم الضرر عشرات العيانية (يرجى الرجوع إلى منشور آخر للحصول على تفاصيل الفيديو [جوف] 1). قياس الجسم تغير الوزن. قياس طول الأمعاء وسمك مع الفرجار الرقمية. مراقبة الملمس البراز (من الصعب، لينة أو دموية). تحديد الدم في البراز غامض مع Hemooccult. تشريح الأنسجة القولون وإصلاح في الفورمالين لH &amp; E تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح عظم الفخذ 1 بوشمال شرق في الماوس، استخراج نخاع العظام ونخاع العظام مسح مع PBS الباردة عن طريق إبرة 25G و 1 مل حقنة. نخاع العظام سباحة 4 إلى 1 المقابس أنبوب ونضع في الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب نخاع العظم لطبق بتري، والقص المكونات نخاع العظم إبرة 18G مع و5 مرات عدة حقنة مل المكونات حتى لا نخاع العظم موجودا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور إلى أسفل مع 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في C. ° 4 إزالة طاف و resuspend مع 600 ميكرولتر العازلة الخلية تلطيخ. تقسيم نخاع العظم معلق لأنابيب إيبندورف 5، مع 100 ميكرولتر لكل. </li></ol> 7. فحص الجودة من زرع نخاع العظام بواسطة قياس التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية كل أنابيب عينة من الدم أو نخاع العظم # 1-5: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خليط الأجسام المضادة لكل منهما أنبوب في الظلام. </li></ol> رقم 1 لم الأجسام المضادة # 2 30 ميكرولتر نمط إسوي FITC السيطرة + 30 ميكرولتر PE نمط إسوي السيطرة + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر # 3 30 ميكرولتر FITC CD45.1 أب + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر # 4 30 ميكرولتر PECD45.2 أب + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر # 5 30 ميكرولتر FITC CD45.1 أب + 30 ميكرولتر PE CD45.2 أب + 15 ميكرولتر CD16/32 حظر <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> تضيف شيئا إلى الدم أو عينة نخاع العظم # 1 </td></tr><tr><td> إضافة 5 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 2 لكل الدم أو عينة نخاع العظم # 2 </td></tr><tr><td> إضافة 3 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 3 لكل الدم أو عينة نخاع العظم # 3 </td></tr><tr><td> إضافة 3 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 4 إلى كل دم أو عينة نخاع العظام # 4 </td></tr><tr><td> إضافة 5 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة رقم 5 لكل الدم أو عينة نخاع العظم # 5 </td></tr></tbody></table><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضع في الظلام في الثلج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل العازلة تحلل RBC 1X إلى كل أنبوب. نضع في الظلام على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور أسفل الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة، 5 دقائق في 4 درجات مئوية. (GH 3.8 الدوار، 1،500 دورة في الدقيقة = 350 XG) إزالة طاف. إعادة تعليق بيليه مع 500 ميكرولتر العازلة الخلية تلطيخ في فترة وجيزة، ثم دوامة مظلمة. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من CD45.1 (تمثل WT) وCD45.2 (تمثل KO) في الدم وعينات immunostained نخاع العظام بواسطة التدفق الخلوي. حدد FITC لتمثيل WT CD45.1 وPE لتمثيل KO CD45.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل نتائج التدفق الخلوي بواسطة برنامج FlowJo. حساب نسبة FITC: PE PE أو نسبة: نسبة FITC لتحديد ما إذا الوراثي هو التركيب الوراثي السائد المانحة في الدم ونخاع العظام. </li></ol>

<ol>
	<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis.">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li><li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice:+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li><li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice.">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li><li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+cells+in+murine+colitis:+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement.">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11 (2011).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells/endothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis.">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li><li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa.">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li><li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow-derived+monocytes/macrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and/or+anticancer+drugs+in+colitis+model.">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).</li><li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+.">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. .</a> Gut. , (2012).</li><li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14++monocytes.">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li><li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells.">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li><li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP(+)+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors.">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li><li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

هذا زرع نخاع العظم نهج مناسبة للبحوث المناعة التهاب القولون، والعدوى، والسرطان، والسمنة وأمراض أخرى. هناك حاجة لذلك زرع نخاع العظم عند تجربة أعرب عن الجينات في المصالح في كل من نخاع العظم والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير ويشتبه الجين في المصالح للتوسط المر...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> خلية تلطيخ العازلة </td><td> Biolegend </td><td> # 420201 </td></tr><tr><td> 10X العازلة تحلل RBC </td><td> Biolegend </td><td> # 420301 </td></tr><tr><td> FITC الماوس نمط إسوي السيطرة </td><td> Biolegend </td><td> # 400207 </td></tr><tr><td> PE الماوس نمط إسوي السيطرة </td><td> Biolegend </td><td> # 400211 </td></tr><tr><td> PE مكافحة الماوس CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> # 109807 </td></tr><tr><td> FITC مكافحة الماوس CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> # 110705 </td></tr><tr><td> مكافحة الماوس CD16/32 حظر </td><td> Biolegend </td><td> # 101301 </td></tr><tr><td> 40 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> Fisherbrand </td><td> # 22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><tد&gt; النائب Biomedicals </td><td> # 1860454 </td></tr><tr><td> الهيبارين </td><td> Fisherbrand </td><td> # BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim (SMZ) </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720 (فيشر) </td></tr><tr><td> اللايسول IC </td><td> Andwin العلمية </td><td> NC9745686 (فيشر) </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> # 8000813 </td></tr><tr><td> الماوس restrainer </td><td> برينتري العلمية </td><td> # TV-150 </td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> JL الراعي والمنتسبين </td><td> بمناسبة I 68A </td></tr><tr><td> تدفق عداد الكريات </td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td> أنبوب تدفق عداد الكريات اختبار </td><td> صقر </td><td> # 352052 </td></tr><tr><td> الفرجار الرقمية </td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td> Hemoccult تكنولوجيا المعلومات والاتصالات </td><td> بيكمان كولتر </td><td> G0328QW </td></tص&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

لفهم دور الجينات في تطوير التهاب القولون، قارنا ردود البرية من نوع الفئران والجينات في المصالح الفئران خروج المغلوب لنقص التهاب القولون. إذا يعبر عن الجينات في المصالح في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظام المستمدة غير للمضيف، ولكن من الممكن التفريق بين دور الجينات في المصالح في خلايا نخاع العظام ونخاع المستمدة غير العظام مشتقة من خلايا نخاع العظام تقنية الزرع. لتغيير التركيب الوراثي نخاع العظام المستمدة من الفئران الخلية، تم تدمير النخاع العظمي الأصلي من الفئران المتلقية من قبل التشعيع وبعد ذلك استبدال نخاع العظام المانحة الجديدة من النمط الجيني مختلفة. عندما تم زرع العظام من النوع البري المانحة الفئران الفئران خروج المغلوب لنخاع، يمكن أن تولد الفئران خروج المغلوب مع التعبير الجيني من النوع البري في خلايا نخاع العظام المستمدة. بدلا من ذلك، تم زرعها عند الفئران خروج المغلوب المانحة نخاع العظم للفئران المستفيدة من النوع البري والبرية من نوع الفئران دون الجينات في المصالح معربا عنمن نخاع العظم تم إنتاج الخلايا المشتقة. ومع ذلك، قد زرع نخاع العظم لا يكون 100٪ كاملة. ولذلك، تستخدم مجموعة من الجزيئات نحن (CD) التمايز (CD45.1 وCD45.2) كعلامات من الخلايا المانحة والمتلقية لتتبع نسبة من الخلايا المانحة نخاع العظام في الفئران المستمدة المستفيدة ونجاح زرع نخاع العظام. واستخدمت البرية من نوع الفئران مع الفئران خروج المغلوب وراثى CD45.1 مع CD45.2 الوراثي. بعد التشعيع من الفئران المتلقية، وغرست في خلايا نخاع العظام من المانحين الأنماط الوراثية في الفئران المتلقية. وعندما نخاع العظام الجديدة المجددة للاستيلاء على حصانتها، تحدى الفئران عن طريق وكيل الكيميائية (ديكستران كبريتات الصوديوم، 5٪ DSS) للحث على التهاب القولون. نحن هنا كما أظهرت طريقة للحث على التهاب القولون في الفئران وتقييم دور الجينات في المصالح وأعرب عن خلايا نقي العظم المشتقة. إذا كان الجين في المصالح من خلايا العظام المستمدة تلعب دورا هاما في تطور هذا المرض (مثل القولونيةTIS)، يمكن النمط الظاهري من الفئران المتلقية مع زرع نخاع العظام غيرت بشكل كبير. في نهاية التجارب التهاب القولون، ونخاع العظام المستمدة وصفت الخلايا في الدم ونخاع العظام مع الأجسام المضادة ضد CD45.1 وCD45.2، ويمكن استخدامها على نسبة الكمية من وجودها لتقييم نجاح زرع نخاع العظام بواسطة التدفق الخلوي. يجب ناجحة زرع نخاع العظام تظهر الغالبية العظمى من النمط الجيني المانحة (في فترة من علامة جزيء CD) على النمط الجيني المستلم في كل من نخاع العظام والدم من الفئران المتلقية.

يجب إذا كان الجين في المصالح تلعب دورا هاما في الخلايا المناعية خلال تطوير التهاب القولون، والفئران تلقي نخاع العظم من النمط الجيني المختلفة من خلال زرع نخاع العظم (WT إلى KO KO أو لWT) لديها تغيير في الاستجابة للالتهاب القولون DSS. واحدة من أهم المعايير لتحديد شدة التهاب ا...

Watch this Scientific Journal Video about Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation at JoVE.com

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

زرع نخاع العظام يوفر وسيلة لتغيير التركيب الوراثي للخلايا نخاع العظام المستمدة. إذا يعبر عن الجينات ذات الأهمية في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظم غير المشتقة، يمكن زرع نخاع العظام تغيير خلايا نخاع العظام المستمدة إلى التركيب الوراثي مختلفة دون تغيير التركيب الوراثي غير العظام نخاع الخلية مشتقة.

التفريق الأدوار الوظيفية في التعبير الجيني من الخلايا المناعية وغير المناعية في التهاب القولون الماوس عن طريق زرع نخاع العظم

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

differentiating-functional-roles-gene-expression-from-immune-non

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.3K Views.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. زرع نخاع العظام يوفر وسيلة لتغيير التركيب الوراثي للخلايا نخاع العظام المستمدة. إذا يعبر عن الجينات ذات الأهمية في كل من خلايا نخاع العظام والخلايا المشتقة نخاع العظم غير المشتقة، يمكن زرع نخاع العظام تغيير خلايا نخاع العظام المستمدة إلى التركيب الوراثي مختلف?...

Video: Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

عزل خلايا المناعة وظيفية القلب

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

العزلة وتنقية وصفها من العظام بالنسبة للفئران العدلات نخاع للدراسات الفنية والتجارب نقل بالتبني

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

تتبع الماوس نخاع العظم وحيدات<em&gt; في فيفو</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

جيل وتحديد GM-CSF المشتقة مثل السنخية الضامة والخلايا الجذعية من الفأر نخاع العظم

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

مضان تنشيط الفرز الخليوي لتنقية الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل من الفأر نخاع العظم

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for hematological and immunological analyses. For example, studies of the cellular and molecular properties of myeloid progenitor populations can reveal mechanisms underlying leukemic transformation, or demonstrate how the immune system responds to pathogen exposure. Previously described flow cytometry strategies for myeloid progenitor identification have enabled significant advances in many fields, but the fractions they identify are very heterogeneous. The most commonly used gating strategies define bone marrow fractions that are enriched for the desired populations, but also contain large numbers of &#34;contaminating&#34; progenitors. Our recent studies have resolved much of this heterogeneity, and the protocol we present here permits the isolation of 6 subpopulations of oligopotent and lineage-committed myeloid progenitors from 2 previously described bone marrow fractions. The protocol describes 3 stages: 1) isolation of bone marrow cells, 2) enrichment for hematopoietic progenitors by magnetic-activated cell sorting (lineage depletion by MACS), and 3) identification of myeloid progenitor subsets by flow cytometry (including fluorescence-activated cell sorting, FACS, if desired). This approach permits progenitor quantification and isolation for a variety of in vitro and in vivo applications, and has already yielded novel insight into pathways and mechanisms of neutrophil, monocyte, and DC differentiation.

We demonstrate how to identify and isolate 6 subsets of myeloid progenitors from murine bone marrow using a combination of magnetic and fluorescence sorting (MACS and FACS). This protocol can be used for in vitro culture assays (methylcellulose or liquid cultures), in vivo adoptive transfer experiments, and RNA/protein analyses.

تحديد وعزل أوليجوبوتينت والنسب التي ارتكبت النقوي موروث من نخاع العظام الماوس

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

عزل الخلايا أحادية اللامينا بروبريا أحادية النونافة من القولون المورين باستخدام Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to eradicate tumors. However, its application is limited by the development of graft-versus-host disease (GVHD), a major complication of BMT. GVHD is evoked when T-cells in the donor grafts recognizealloantigen expressed by recipient cells and mount unwanted immunological attacks against recipient healthy tissues. Thus, traditional therapies are designed to suppress donor T-cell alloreactivity. However, these approaches substantially impair the GVL effect so that the recipient&#39;s survival is not improved. Understanding the effects of therapeutic approaches on BMT, GVL, and GVHD, is thus essential. Due to the antigen-presenting and cytokine-secreting capacities to stimulate donor T-cells, recipient dendritic cells (DCs) play a significant role in the induction of GVHD. Therefore, targeting recipient DCs becomes a potential approach for controlling GVHD. This work provides a description of a novel BMT platform to investigate how host DCs regulate GVH and GVL responses after transplantation. Also presented is an effective BMT model to study the biology of GVHD and GVL after transplantation.

Graft-versus-host disease is a major complication after allogeneic bone marrow transplantation. Dendritic cells play a critical role in the pathogenesis of graft-versus-host disease. The current article describes a novel bone marrow transplantation platform to investigate the role of dendritic cells in the development of graft-versus-host disease and the graft-versus-leukemia effect.

منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف

Allogeneic bone marrow transplantation (BMT) is an effective therapy for hematological malignancies due to the graft-versus-leukemia (GVL) effect to ...

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

إجراءات زرع نخاع العظم في الفئران لدراسة الهيماتوبويز الكلونية

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to proteins of interest. Identification of gene functions in cell line models is important for gene discovery and exploration of cell-intrinsic mechanisms. However, genetic manipulations of immune cells such as T cells and macrophage cell lines using CRISPR/Cas9-mediated knock-in are difficult because of the low transfection efficiency of these cells, especially in a quiescent state. To modify genes in immune cells, drug-resistance selection and viral vectors are typically used to enrich for cells expressing the CRIPSR/Cas9 system, which inevitably results in undesirable intervention of the cells. In a previous study, we designed dual fluorescent reporters coupled to CRISPR/Cas9 that were transiently expressed after electroporation. This technical solution leads to rapid gene deletion in immune cells; however, gene knock-in in immune cells such as T cells and macrophages without the use of drug-resistance selection or viral vectors is even more challenging. In this article, we show that by using cell sorting to aid selection of cells transiently expressing CRISPR/Cas9 constructs targeting the Rosa26 locus in combination with a donor plasmid, gene knock-in can be achieved in both T cells and macrophages without drug-resistance enrichment. As an example, we show how to express human ACE2, a receptor of SARS-Cov-2, which is responsible for the current Covid-19 pandemic, in RAW264.7 macrophages by performing knock-in experiments. Such gene knock-in cells can be widely used for mechanistic studies.

This protocol uses fluorescent reporters and cell sorting to simplify knock-in experiments in macrophage and T cell lines. Two plasmids are used for these simplified knock-in experiments, namely a CRISPR/Cas9- and DsRed2-expressing plasmid and a homologous recombination donor plasmid expressing EBFP2, which is permanently integrated at the Rosa26 locus in immune cells.

الجينات تدق في كريسبر / Cas9 وفرز الخلايا في خطوط الخلايا الماكروفاج و تي

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...