这项工作是由加州大学洛杉矶分校的治疗中心，克罗恩病和结肠炎基金会美国职业发展奖（2691）和国立卫生研究院NIDDK K01（DK084256）的资金就围冠试点和可行性研究的资助。 伯纳德·莱文和Scott厨房加州大学洛杉矶分校艾滋病研究鼠/人嵌合体的核心设施中心的协助下照射骨髓操作。流式细胞仪操作协助加州大学洛杉矶分校矢量的核心设施。

1。在你启动技术注意事项<ol><li>我们建议同时使用C57/BL6野生型小鼠和基因敲除小鼠可以购买相应的CD分子的小鼠实验，因为从各大鼠标厂商。 </li><li>因为它是难以跟踪的野生型小鼠和衍生的基因敲除小鼠骨髓移植后的供体细胞，它是必要使用CD45.1代表野生型小鼠的小鼠。 （CD45.1 C57/SJL WT小鼠杰克逊实验室的股票002014）。 </li><li>大多数鼠标的菌落CD45.2。我们的基因敲除小鼠属于CD45.2的基因型（或者一个CD45.2 WT小鼠来源：杰克逊实验室的股票＃000664）。本协议第7条中提到的，可以使用流式细胞仪检测骨髓和外周血的CD45.1和CD45.2基因型的测定。 </li><li>照射后小鼠免疫力下降。养老鼠在无病原体设施。 </li><li>操作辐照需要特殊安全clearance和培训。为了节省时间，在培训和审批程序，最好是与一个合格的技术人员能够操作辐照实验室。 </li><li>许多机构都流式细胞仪检测实验室，拥有经验丰富的技术人员。为了尽量减少用流式细胞仪操作的问题，最好是经验丰富的技术人员，然后再开始讨论流式细胞仪检测实验计划。 </li><li>小鼠（每组10只小鼠）以这种方式被分配： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 组 </td><td></td><td> 到收件人的骨髓捐赠者 </td><td> 治疗 </td></tr><tr><td>一</td><td> BM交流</td><td> CD45.1 WT CD45.2 KO </td><td> DSS结肠炎</td></tr><tr><td>乙</td><td></td><td></td><td>水正常对照</td></tr><tr><td> Ç </td><td> BM交流</td><td> CD45.2 KO CD45.1 WT </td><td> DS性结肠炎</td></tr><tr><td> ð </td><td></td><td></td><td>水正常对照</td></tr><tr><td> Ë </td><td>假</td><td> CD45.1 WT CD45.1 WT </td><td> DSS结肠炎</td></tr><tr><td> F </td><td></td><td></td><td>水正常对照</td></tr><tr><td> ĝ </td><td>假</td><td> CD45.2 KO KO CD45.2 </td><td> DSS结肠炎</td></tr><tr><td> Ĥ </td><td></td><td></td><td>水正常对照</td></tr></tbody></table> *简要说明的实验方案如图1所示。 2。受体小鼠照射<ol><li>小鼠繁殖，并保持在无病原体的设施。将灭菌照射小鼠饼过滤器。将一个鼠标在每个插槽的照射馅饼。将饼进入辐照装置和，确保转盘和饼转向。 </li><li>打开空气泵用于通风。辐照门关闭并锁定。 </li><li>照射的小鼠千拉德（这是相当于10戈瑞）为10分钟左右（根据辐射源和半衰期）。从这个时间点，照射小鼠是免疫能力受损，对感染的抵抗力弱。照射后，采取的馅饼，并将其放置在无菌容器中，动物运输生物安全柜设施。避免暴露小鼠的外部环境，以减少感染的机会。 </li><li>在生物安全柜中，将只小老鼠变成的蒸压鼠标笼，用无菌床上用品（每笼4只。添加新的无菌水与sulfatrim暂停 - 3.12毫升，每100毫升水）。 </li><li>瓶用铝箔包裹的水作为抗生素是光敏感的。摇动混合的sulfatrim解决方案瓶，以及在加载它的笼子前。 </li></ol> 3。捐赠者的骨髓提取<ol><li>与二氧化碳或isoflur的牺牲小鼠ANCE，然后浸泡在1:200的来苏尔溶液。喷洒的小鼠用70％乙醇润湿的皮肤和解剖开放的骨骼。 </li><li>在70％的乙醇消毒浸泡解剖工具。 </li><li>在生物安全柜中进行解剖。使用无菌暴露肱骨，股骨，胫骨和腓骨骨，附着的肌肉和韧带的解剖工具。 </li><li>显示红色的骨髓，剖开两端的骨头。用钳子按住骨头。红骨髓，用冷PBS冲洗3毫升注射器和25G的针头培养皿中。两端的骨头冲​​洗，以产生更多的骨髓细胞。 </li><li>使用6毫升注射器和18G1 / 2针的红骨髓插头的反复抽吸和弹射打破。用50ml Falcon管中，骨髓转移。 </li><li>向下自旋骨髓在转速为1,800 rpm，5分钟，在4℃下涡旋5-10秒，弃上清，重悬沉淀。 </li><li>用无菌水稀释10X红细胞裂解缓冲液。广告ð1X红细胞裂解缓冲液（5毫升，每供体小鼠），旋涡，持续5秒，并再次保持恰好3分钟在室温下。 </li><li> 3分钟后，填写管，用20毫升冷PBS停止裂解和组合。倒入到一个新的50毫升Falcon管中的内容直接通过40μm的细胞过滤网。 </li><li>用5ml的PBS中，并转移到细胞过滤网，以及冲洗原始管。补足至50毫升PBS和组合。 </li></ol> 4。骨髓供体细胞计数<ol><li>加入100μl的台盼蓝到Eppendorf管中骨髓悬浮液和100μl到Eppendorf管中，混合。染色的细胞混合物移液器血细胞计数。 </li><li>生活总骨髓细胞计数=未染色的细胞数在16个正方形×2（由于台盼蓝稀释）×10,000×50毫升Falcon管中的细胞的量的计算方法是</li><li>降速的骨髓细胞在50ml Falcon管中以2,000 rpm在4℃下5分钟</li><li>除去上清液。基于的总细胞计数，将沉淀重悬于用PBS至1×10 8个细胞每毫升</li></ol> 5。输液受体小鼠<ol><li>热烈的受体小鼠热板和下一个变暖的灯。将受体小鼠中限制器。在100-200微升静脉注射1×10 7细胞，每只小鼠。 </li><li>必须注入捐赠者的骨髓照射后4-24小时之间。 </li><li>随时掌握每笼的小鼠注射。第4周在无病原体的动物设施的抗生素处理后的水注入受体小鼠在蒸压笼，保持和让老鼠恢复免疫力。更改笼子里，抗生素处理过的水和食物，每4天，以保持卫生。 </li></ol> 6。结肠炎诱导结肠炎和评价<ol><li>照射和骨髓移植4周后，切换到普通水，无抗生素，并保持2个星期的小鼠，以恢复其正常肠道菌群。 </li><li>骨髓注射6周后，测定初始体重。饮水自由采食诱导结肠炎小鼠给予5％硫酸葡聚糖。一些老鼠经常饮用的水只作为正常对照组。 </li><li> 5天后，提取外周血，转移到肝素涂层管（真空采血管），并保存在冰中。池的血从4只到1管。结合用300μl的细胞染色缓冲液= 600微升300微升血液。血液除以5 Eppendorf管中，每个用100μl。 </li><li>牺牲的老鼠与二氧化碳或异氟醚。评估宏观损伤评分（的详细信息，请参阅视频发布到另一个JOVE）。测量体重变化。用游标卡尺测量肠管长度和厚度。观察大便的质地（硬，软或带血）。确定与Hemooccult大便潜血。解剖结肠组织和固定在福尔马林H＆E染色。 </li><li>解剖1股骨博定义每鼠标，提取骨髓，用冷PBS冲洗骨髓，通过25G针和1毫升注射器。游泳池4骨髓插一管，并保存在冰中。 </li><li>骨髓倒入陪替氏培养皿，剪切骨髓插头用18G注射针和5毫升注射器数次直到没有骨髓插件是本。 </li><li>自旋向下的5分钟1500转，在4°C去除上清，重悬于600μL细胞染色缓冲液。再悬浮的骨髓除以5 Eppendorf管中，每个用100μl。 </li></ol> 7。流式细胞仪检测骨髓移植的质量检验<ol><li>标记每个样品管中的血液或骨髓＃1-5： </li><li>制备抗体混合物在黑暗中为每个各自的管。 </li></ol> ＃1抗体 ＃2 30μLFITC同型对照+ 30μLPE同型对照+ 15微升CD16/32阻塞 ＃3 30μLFITC CD45.1 AB + 15微升CD16/32阻塞 4月30日微升PECD45.2 AB + 15微升CD16/32阻塞 ＃5 30μLFITC CD45.1抗体+ 30微升PE的CD45.2抗体+ 15微升CD16/32阻塞<table border="1"><tbody><tr><td>没有血液或骨髓样本＃1 </td></tr><tr><td>加入5μl的抗体混合物＃2＃2每个血液或骨髓样本</td></tr><tr><td> 3微升的抗体混合物＃3，每个血或骨髓样本＃3 </td></tr><tr><td>每个血液或骨髓样本＃4中加入3μl抗体混合物＃4 </td></tr><tr><td>加入5μl的抗体混合物第5到每一个血液或骨髓样本＃5 </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li>查看在黑暗中30分钟，在冰中。 </li><li>每管加入2 ml 1X红细胞裂解液。查看在黑暗中在冰上15分钟。 </li><li>降速的细胞以1,500 rpm，在4℃下5分钟（GH 3.8转子，1500转= 350 XG）除去上清液。重悬沉淀用500μl细胞染色缓冲液在黑暗中，当时的涡简要。 </李&gt; <li>检查CD45.1（代表WT），CD45.2（即KO）的免疫染色的血液和骨髓样本，通过流式细胞仪检测。选择FITC代表WT CD45.1，PE的代表KO CD45.2。 </li><li> FlowJo软件分析流式细胞仪检测结果。计算的比例FITC：市盈率PE：FITC比，以确定是否在血液和骨髓捐助者的基因型是优势基因型。 </li></ol>

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	<li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+Intestinal+Inflammation+in+DSS-induced+Model+of+IBD.">Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD.</a> J. Vis. Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Ungaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Toll-like+receptor+4+antagonist+antibody+ameliorates+inflammation+but+impairs+mucosal+healing+in+murine+colitis.">A novel Toll-like receptor 4 antagonist antibody ameliorates inflammation but impairs mucosal healing in murine colitis.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 1167-1179 (2009).</li><li>Castagliuolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+neurokinin-1+receptor+during+colitis+in+mice:+role+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">Protective effects of neurokinin-1 receptor during colitis in mice: role of the epidermal growth factor receptor.</a> Br. J. Pharmacol. 136, 271-279 (2002).</li><li>Koon, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cathelicidin+signaling+via+the+Toll-like+receptor+protects+against+colitis+in+mice.">Cathelicidin signaling via the Toll-like receptor protects against colitis in mice.</a> Gastroenterology. 141, 1852-1863 (2011).</li><li>Lee, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow+cells+in+murine+colitis:+multi-signal+analysis+confirms+pericryptal+myofibroblast+engraftment+without+epithelial+involvement.">marrow cells in murine colitis: multi-signal analysis confirms pericryptal myofibroblast engraftment without epithelial involvement.</a> PLoS One. 6, e11 (2011).</li><li>Deng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+therapy+using+bone+marrow-derived+stem+cells/endothelial+progenitor+cells+to+accelerate+neovascularization+in+healing+of+experimental+ulcerative+colitis.">New cell therapy using bone marrow-derived stem cells/endothelial progenitor cells to accelerate neovascularization in healing of experimental ulcerative colitis.</a> Curr. Pharm. Des. 17, 1643-1651 (2011).</li><li>Valcz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphoid+aggregates+may+contribute+to+the+migration+and+epithelial+commitment+of+bone+marrow-derived+cells+in+colonic+mucosa.">Lymphoid aggregates may contribute to the migration and epithelial commitment of bone marrow-derived cells in colonic mucosa.</a> J. Clin. Pathol. 64, 771-775 (2011).</li><li>Takaba, J., Mishima, Y., Hatake, K., Kasahara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+bone+marrow-derived+monocytes/macrophages+in+the+repair+of+mucosal+damage+caused+by+irradiation+and/or+anticancer+drugs+in+colitis+model.">Role of bone marrow-derived monocytes/macrophages in the repair of mucosal damage caused by irradiation and/or anticancer drugs in colitis model.</a> Mediators Inflamm. 2010, 634145 (2010).</li><li>Bakhautdin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+role+of+macrophage-derived+ceruloplasmin+in+inflammatory+bowel+disease.+.">Protective role of macrophage-derived ceruloplasmin in inflammatory bowel disease. .</a> Gut. , (2012).</li><li>Seta, N., Kuwana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+multipotent+progenitors+from+human+circulating+CD14++monocytes.">Derivation of multipotent progenitors from human circulating CD14+ monocytes.</a> Exp. Hematol. 38, 557-563 (2010).</li><li>Crain, B. J., Tran, S. D., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+human+bone+marrow+cells+generate+new+brain+cells.">Transplanted human bone marrow cells generate new brain cells.</a> J. Neurol. Sci. 233, 121-123 (2005).</li><li>Finnberg, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+and+antitumor+effects+of+GFP(+)+bone+marrow-derived+cells+homing+to+syngeneic+mouse+colon+tumors.">High-resolution imaging and antitumor effects of GFP(+) bone marrow-derived cells homing to syngeneic mouse colon tumors.</a> Am. J. Pathol. 179, 2169-2176 (2011).</li><li>Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+bone+marrow+transplantation+(BMT):+providing+optimal+veterinary+and+husbandry+care+to+irradiated+mice+in+BMT+studies.">Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies.</a> J. Am. Assoc. Lab Anim. Sci. 48, 11-22 (2009).</li><li>Chen, B. J., Cui, X., Sempowski, G. D., Domen, J., Chao, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+dose+correlates+with+the+speed+of+immune+reconstitution+after+stem+cell+transplantation.">Hematopoietic stem cell dose correlates with the speed of immune reconstitution after stem cell transplantation.</a> Blood. 103, 4344-4352 (2004).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

骨髓移植的方法是适用于免疫学研究的结肠炎，感染，癌症，肥胖症和其他疾病的。基因的利益时，需要在两个骨髓来源的和非骨髓来源的细胞和基因的利益被怀疑由细胞介导疾病无论从人口表示这骨髓移植实验。例如，抗菌肽抗菌肽调节急性结肠炎。但是，它是表示在两个上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞）。然后，我们用骨移植来定义人口的细胞调节小鼠急性肠炎。结肠炎的严重程度显着改?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 的试剂的名称 </td><td> 公司 </td><td> 目录编号 </td></tr><tr><td>细胞染色缓冲液</td><td> Biolegend </td><td> ＃420201 </td></tr><tr><td> 10X红细胞裂解缓冲液</td><td> Biolegend </td><td> ＃420301 </td></tr><tr><td> FITC同型对照鼠</td><td> Biolegend </td><td> ＃400207 </td></tr><tr><td> PE同型对照鼠</td><td> Biolegend </td><td> ＃400211 </td></tr><tr><td> PE抗鼠CD45.2 </td><td> Biolegend </td><td> ＃109807 </td></tr><tr><td> FITC标记的抗小鼠CD45.1 </td><td> Biolegend </td><td> ＃110705 </td></tr><tr><td>抗小鼠CD16/32阻塞</td><td> Biolegend </td><td> ＃101301 </td></tr><tr><td> 40微米的细胞过滤器</td><td> Fisherbrand </td><td> ＃22363547 </td></tr><tr><td> PBS 1X </td><tD&gt; MP biomedicals </td><td> ＃1860454 </td></tr><tr><td>肝素</td><td> Fisherbrand </td><td> ＃BP2425 </td></tr><tr><td> Sulfatrim（SMZ） </td><td> Qualitest </td><td> NC9242720（费舍尔） </td></tr><tr><td>来苏儿IC </td><td> Andwin科学</td><td> NC9745686（费舍尔） </td></tr><tr><td> Vaccutainer </td><td> BD </td><td> ＃8000813 </td></tr><tr><td>鼠标阻挡</td><td>布伦特里科学</td><td> ＃TV-150 </td></tr><tr><td>照射器</td><td> JL牧羊犬和联营公司</td><td> Mark我68A </td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td> BD </td><td> BD FACSCanto II </td></tr><tr><td>流式细胞仪检测管</td><td>鹰</td><td> ＃352052 </td></tr><tr><td>数显卡尺</td><td> Fisherbrand </td><td> 14-648-17 </td></tr><tr><td>大便潜血信息和通信技术</td><td> Beckman Coulter公司</td><td> G0328QW </td></tR&gt; </tbody></table>

differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation

要了解结肠炎的发展中的一个基因的作用，我们比较了野生型小鼠的反应和兴趣基因缺陷的基因敲除小鼠结肠炎。如果该基因的利益是表示在两个骨髓来源的细胞和非骨髓来源的细胞的主机，但是，它是可能的感兴趣的基因的骨髓来源的细胞和非骨髓分化的作用衍生骨髓细胞​​移植技术。要改变的骨髓细胞基因型的小鼠，原来的受体小鼠的骨髓被破坏的照射，然后更换新的捐赠者的骨髓不同基因型。当野生型小鼠供体骨髓移植到基因敲除小鼠中，我们可以产生与野生型的骨髓来源的细胞中的基因表达的基因敲除小鼠。或者，基因敲除小鼠时，供体骨髓移植到无利益基因表达的野生型受体小鼠，野生型小鼠从骨髓衍生细胞。然而，骨髓移植可能不是100％完成。因此，我们利用集群的分化（CD）分子（CD45.1和CD45.2）作为供体和受体细胞的标记，跟踪捐赠者的骨髓来源细胞在受体小鼠的骨髓移植成功的比例。 CD45.1 CD45.2基因型的基因型和基因敲除小鼠与野生型小鼠。受体小鼠的照射后，供体骨髓细胞注入受体小鼠不同基因型。当新的骨髓再生接管其免疫，将小鼠用化学剂（硫酸葡聚糖钠，DSS 5％）的挑战，以诱发大肠炎。在这里，我们还表明，该方法诱导结肠炎的小鼠的骨髓来源的细胞从表达感兴趣的基因的作用的评价。如果该基因的利益从骨来源的细胞的疾病的发展中起着重要的作用（如大肠杆菌炎），骨髓移植的受体小鼠的表型可以显着改变。结肠炎实验结束时，骨髓来源的血液和骨髓中的细胞进行标记与抗CD45.1和CD45.2和其定量的存在比例可用于骨髓移植的成功，通过流式细胞术评价。应显示成功的骨髓移植供体基因型在长期的CD分子标记对收件人基因型的受体小鼠的骨髓和血液中的绝大多数。

如果该基因的利益结肠炎的开发过程中，起到了重要的作用的免疫细胞，通过骨髓移植（WT KO KO，以WT）小鼠骨髓不同基因型，DSS结肠炎应该有一个改变的响应。用于确定的结肠炎的严重程度的最重要的参数之一是结肠组织的H＆E染色。结肠组织结构的变化和炎症的迹象，H＆E组织学评分系统，可以定量评估。 H＆E组织学得分DSS结肠炎模型的标准可以在这里找到2。另外，也可诱发化学诱导?...

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Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

骨髓移植提供了一种方法来改变的骨髓衍生细胞的基因型。如果感兴趣的基因的表达在两个骨髓来源的细胞和非骨髓来源的细胞，骨髓移植可以改变到一个不同的基因型的骨髓来源的细胞，不改变非骨髓来源的细胞的基因型。

区分功能基因表达的作用，通过骨髓移植免疫和非免疫细胞在小鼠结肠炎

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

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Immunology and Infection

17.3K 次观看.  The University of California Los Angeles, Los Angeles. 骨髓移植提供了一种方法来改变的骨髓衍生细胞的基因型。如果感兴趣的基因的表达在两个骨髓来源的细胞和非骨髓来源的细胞，骨髓移植可以改变到一个不同的基因型的骨髓来源的细胞，不改变非骨髓来源的细胞的基因型。