وأيد هذا العمل من قبل الزمالة ايرمان لHY. H.، تابوت جين الصندوق التذكاري لزمالة تشايلدز البحوث الطبية ما بعد الدكتوراه لRJJ، NIH منح F32EY016309 إلى DV، زمالة جامعة ولاية نيويورك العميد أطروحة لDJ، NIH GrantR01 EY13010 إلى CD وزمالة DFG إلى JR (RI 2208/1- 1). نشكر نينا فوغت وBoodram باميلا للتعليقات على المخطوط.

<html> 1. مقدمة في هذا الفيديو، ونحن تصف أساليب تشريح الشبكية والمناعية في الفترات الثلاث التنموية المحددة: الطور اليرقي الثالث، midpupal ومرحلة الكبار. على الرغم من أن لدينا بروتوكول يعمل أيضا على مراحل أخرى العذراء (للاطلاع على تفاصيل المراحل السابقة، انظر 16)، اخترنا المرحلة midpupal، كما هو الأمثل لجميع المستفيدين الرئيسيين التصوير في طائرة واحدة والتنسيق النواة يمكن تمييزها بسهولة، مما يسهل تصور أنماط النسخ عامل التعبير. تشريح شبكية العين العذراء أواخر هي مشابهة جدا لتشريح شبكية العين الكبار. أولا، نحن لشرح كيفية جمع اليرقات والعذارى في المراحل المطلوب. ثم، نشرح كيفية الحصول على تشريح الأمثل للاليرقات 17-18، وشبكية العين midpupal الكبار. ثانيا، نحن لشرح كيفية تصور PR التنمية في هذه المراحل باستخدام المجهر متحد البؤر والمناعية. ق = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. التدريج وإعداد نموذج فترة التنموية من الحشرات التي تعتمد على درجة الحرارة هو. لتسهيل انطلاق استنساخه من اليرقات والشرانق، نوصي رفع جميع المخزونات الطيران عند درجة حرارة 25 مئوية تحت لمدة 12 hr/12 دورة الضوء / الظلام ساعة. الطور الثالث اليرقات: حول 96 ساعة وبعد وضع البيض (C ° في 25)، في وقت متأخر يرقات العمر 3 التغذية توقف والتجول على جدران القارورة الغذائية، حيث تخدر تصبح خادرة في نهاية المطاف. استخدام فرشاة ناعمة أو ملقط لإزالة بلطف يتجول يرقة الطور الثالث من جدار القارورة الغذاء. ويلاحظ الشرانق 50٪ (&#39;midpupae&#39;) حوالي 48 ساعة بعد التشرنق. التوقيت الدقيق ل، يمكنك وضع دائرة بيضاء فقط الشرانق التي شكلت مع علامة على القارورة الغذاء. بدلا من ذلك، نقل كافة الشرانق الأبيض إلى قارورة جديدة للحصول على قارورة من انطلاق موحدة (على التدريج من الشرانق باستخدام معايير شكلية، انظر 19). بعد 48 ساعة، REM بعنايةواوفه midpupae من القارورة باستخدام ملقط. الذباب الكبار: تخدير الذباب الشباب البالغين (2-5 أيام بعد eclosion) على لوحة 2 CO. إزالة باستخدام ملقط رؤساء وتخزينها في وعاء زجاجي يحتوي على البارد جيدا 1X PBS. 3. إجراء تشريح (حوالي 1-2 ساعة في التجربة) بعد جمع العينة، ووضعها في قطرة من PBS الباردة على طبق تشريح Sylgard. تشريح حوالي 10-15 شبكية العين في التركيب الوراثي. يرجى الرجوع إلى المواد صحائف بيانات السلامة والصحة مؤسستكم للبيئة ومكتب السلامة للتعامل بشكل صحيح مع الكواشف والمعدات (انظر الجداول في نهاية هذا البروتوكول). 1. أقراص العين اليرقات تخيلي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقع نهاية الأمامي من اليرقة، التي تتضمن خطاطيف الفم. استخدام ملقط للضغط على الجزء الأوسط من يرقة بلطف ضد قاعدة الطبق Sylgard. استخدام عنوتإيه ملقط للاستيلاء على خطاطيف الفم وسحب بلطف وببطء بعيدا عن الجسم. تجاهل الجزء الرئيسي من الجسم واستخدام فمها أن يعقد الجزء الأمامي من أجل إزالة الأنسجة الدخيلة من الأقراص التي لا تزال تعلق تخيلي إلى الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغ مع أقراص تخيلي عن طريق الاستيلاء على خطاطيف الفم مع ملقط لPBS 1X في صحن الزجاج ثلاثة أيضا. تنفيذ الخطوة التثبيت (الخطوة 4.1.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت، إزالة الغدد اللعابية والأنسجة الدهنية وسحب الدماغ بعيدا عن القرص العين antennal تخيلي. لتحسين إمكانية الحصول على الأجسام المضادة &#39;الصعب&#39;، يمكن إزالة الغشاء peripodial، والذي يقع على سطح الظهارة، من خلال الضغط باستمرار على جزء من القرص antennal وتقشير الغشاء بعيدا مع دبوس تشريح. المقبل، نفذ المناعية (الخطوة 5.1.). </li></ol> 2. 50٪ التشرنق / Midpupal شبكية العين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد نهاية الخلفي من حالة العذراء مع ملقط.إزالة بلطف السطح الأمامي للقضية عن طريق الاستيلاء العذراء إهاب مع آخر ملقط وسحب ببطء بعيدا عن puparium. قشر بعيدا بشرة المتبقية لفضح الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط النصائح &#39;لاختراق الأساسية، كيس لينة في المنطقة الأمامية الظهرية. هذا يوفر الوصول إلى الرأس. فصل الرأس بلطف من الصدر ويمتص ببطء في الرأس مع ماصة P20. طرد رئيس من طرف ماصة جديدة في 1X PBS الباردة وإزالة الأنسجة الزائدة؛ الاستيلاء على بشرة الرأس وإزالة خرطوم. انتقل إلى الخطوة التثبيت (الخطوة 4.1.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيرس الفص البصري مع واحد دبوس تشريح إلى النسيج ثابتة. إدراج دبوس الأخرى تشريح بين الصفيحة والشبكية لفصل الشبكية من الصفيحة / الفص البصري. أداء المناعية (الخطوة 5.1.). </li></ol> 3. الكبار العيون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على مركز الكبسولة الخلفية مع رئيس ملقط وإزالة أجزاء الفم (خرطوم)، TISS الدهونرق والقصبات الهوائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستيلاء على بشرة الرأس الظهرية واحد ملقط واستخدام أخرى لفصل العينين من أنسجة المخ عن طريق سحب بلطف جانبية. في معظم الحالات، تبقى متصلة الصفيحة، غمد رقيقة وشفافة من neuropil الدماغ، إلى شبكية العين. أنه من الأسهل لإزالة الصفيحة بعد التثبيت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة إهاب على هامش العين، ولكن ترك قطعة صغيرة خلف لتسهيل نقل شبكية العين إلى حلول مختلفة. أداء التثبيت (الخطوة 4.1.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الصفيحة عن طريق الاستيلاء عليه في جانب واحد مع ملقط وسحب بلطف جانبية مع ملقط الأخرى دون المساس شبكية العين. إزالة إهاب المتبقية، لأنه يمكن أن أضعاف على شبكية العين أثناء التركيب. هاتين الخطوتين هي الحاسمة لتصور خلايا مستقبلة للضوء، والتي لولاها أن تحجب من قبل الصفيحة وبقايا بشرة أثناء عملية التصوير. انتقل إلى المناعية (الخطوة 5.1.). </li></ol> 4. تثبيت واشينانوغرام (حوالي 1 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين شبكية العين في تشريح PBS 1X في طبق زجاج وضعت ثلاثة جيدا على الجليد في حين تستعد طازجة مثبت (40 microliters تخفيف من محلول الفورمالديهايد 37٪ مع 360 ميكرولتر من 1X PBS، دوامة ومتجر على الجليد). نوصي المضي قدما في تثبيت بروتوكول وتجنب أوقات طويلة على الجليد التخزين (&gt; 15 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال 1X PBS مع 200 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد 3.7٪. تأكد من النسيج المغمور في مثبت. هذا أمر بالغ الأهمية، وإلا فإنه قد لا تكون ثابتة بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، وإزالة فقاعات الهواء والقصبات الهوائية مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان شاكر على لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال مثبت مع 1X PBS وشطف مرتين مع PBS 1X. تواصل الغسيل في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة (على شاكر، في درجة حرارة الغرفة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال PBS مع PBST. شطف مرتين مع PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في إزالة الغشاء peripodial من الأقراص العين اليرقات (3.1.3.) وlaminas من midpupal / الكبار شبكية العين &lt;STRONG&gt; (3.2.3.، 3.3.4). </li></ol> 5. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حظر: استبدال PBS مع 200 ميكرولتر من الدم العادي 5٪ في شبكية العين وPBST احتضان لمدة 20 دقيقة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل مع حظر حل الأجسام المضادة الأولية. ختم طبق بشكل جيد مع ثلاثة parafilm واحتضان بين عشية وضحاها على شاكر في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل مع PBST وشطف 3 مرات. تواصل مع الغسيل PBST مدة لا تقل عن 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأجسام المضادة الثانوية في حل واحتضان في صحن الزجاج parafilm مختومة جيدا على شاكر بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل مع الأجسام المضادة PBST وشطف ثلاث مرات. تواصل مع الغسيل PBST لمدة لا تقل عن ساعة واحدة شاكر في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن تظل العينات في PBST لعدة أيام، ولكن من الأهمية بمكان إضافة PBST جديدة على الأقل مرة واحدة يوميا لمنعهم من الجفاف. </li></ol> 6. Mounting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتركيب شبكية العين اليرقات وmidpupal، استخدم P20 لنقل شبكية العين إلى وسط شريحة زجاجية نظيفة. إزالة PBST الزائدة. استخدام ملقط لمحاذاة شبكية العين من أجل تسهيل التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على رأس شبكية العين. تغطيتها بلطف مع زلة-1 24x40 الغطاء وختم مع طلاء الأظافر واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشبكية العين الكبار تصاعد مستمر، وإعداد &#39;الجسور&#39; 20: إضافة قطرات اثنين من 5 ميكرولتر من الجلسرين 50٪ على طرفي جانب الزجاج وغطاء لهم مع تغطية زلات 22x22-1 (0،13 حتي 0،17 مم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة PBST مع ماصة P20؛ تأكد من أن شبكية العين لا تجف. إضافة 20 ميكرولتر من تصاعد المتوسط ​​إلى البئر. استخدام المتوسطة المتزايدة لنقل شبكية العين مع P20 إلى الشريحة &#39;جسر&#39; الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ملقط لتوجيه (العدسات يجب أن تواجه شريحة زجاجية) ومحاذاة شبكية العين من أجل تسهيل التصوير. إذا لزم الأمر، وإزالة فقاعات الهواء مع P20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ببطءزلة مكان 24x40-1 الغطاء (0،13 حتي 0،17 مم) من جانب واحد على رأس وختم حواف مع طلاء الأظافر واضحة أو لاصق شفاف. عينات المحل في 4 درجات مئوية في مربع الشريحة التوقف المجهر (نضع في الظلام). </li></ol> 7. ممثل النتائج كمثال لتطبيق هذا البروتوكول، وتبين لنا نتائج ممثلة لتصور التمايز مبصرة في المراحل الثلاث التنموية في الفيديو. كانت ملطخة A اليرقات العين antennal القرص وشبكية العين مع الأجسام المضادة التي midpupal تسمية أنواع مختلفة مبصرة خلال تنميتها (الشكل 1A، B) وكانت ملطخة شبكية الكبار مع الأجسام المضادة رهودوبسن سنتين إلى تصور أنواع فرعية مبصرة اثنين (الشكل 1C).

<ol>
	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+fly+retina.">Functional organization of the fly retina.</a> Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).</li><li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin.">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster.">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells.">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila:+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification.">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li><li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila:+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells.">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc.">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li><li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye.">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development:+sevenless,+bride+of+sevenless+and+rough.">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li><li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila.">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li><li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+fly+eye:+terminal+differentiation+events+of+the+retina,+corneal+lens,+and+pigmented+epithelia.">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Wolff, T., Sullivan, W. e. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Techniques+for+the+Drosophila+Eye+Part+I:+Larva+and+Pupa.">Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development.">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li><li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype.">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina.">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).</li><li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye.">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li><li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin/NF2,+Kibra,+Lgl,+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate.">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li><li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors.">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

1. استكشاف الأخطاء وإصلاحها في تجربتنا، تتطلب تشريح الممارسة (تصل إلى عدة أسابيع) ويسر من خلال تحقيق موقف اليد مريحة القرن 21 يستريح المرفقين والساعدين على الطاولة ومع الأصابع إجراء اتصالات مع طبق تشريح. وبهذه الطريقة، الابها?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td></td><td></td><td> كاشف </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS1x، ودرجة الحموضة 7.4) </td><td> سيجما </td><td></td><td> إعداد محلول المخزون 10X 20. تمييع مع الماء المقطر للحصول على 1X PBS وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تبرد على الجليد قبل تشريح. </td></tr><tr><td> تريتون-X 100 </td><td> سيجما </td><td> 9002-93-1 </td><td> تنبيه:! مهيجة ارتداء قفازات. تجهيز 50 مل 1xPBS مع 0.3٪ تريتون X-100 (PBST). تخزين في درجة حرارة الغرفة. </td></tr><tr><td> 37٪ الفورمالديهايد الحل </td><td> فيشر العلمية </td><td> F75P1GAL </td><td> تنبيه:!، من المحتمل السامة مسرطن بشري ارتداء القفازات. قبل التثبيت الخطوة، إعداد طازجة حل 3.7٪ في غطاء الدخان الكيميائي عن طريق تمييع مع PBS، متجر على الجليد. </td></tr><tr><td> 5٪ مصل الحصان العادي </td><td> جاكسون المناعي بحوث </td><td> 008-000-001 </td><td> إعداد 5٪ V / V في التخفيف PBST. تخزين في أربع درجات. </td></tr><tr><td> الأجسام المضادة الأولية والثانوية (مثل حمار مكافحة الأغنام اليكسا فلور 488، حمار مكافحة الأرانب اليكسا فلور 555، المضادة للحمار الماوس اليكسا فلور 647) </td><td> مجسات إينفيتروجن الجزيئي </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> تخفيف الأجسام المضادة الثانوية 1:800 في PBST وتخزينها في أربع درجات. </td></tr><tr><td> الكسا فلور 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> تمييع 1:100 في حل الضد الثانوية. </td></tr><tr><td> كاشف الذهب Slowfade Antifade </td><td> مجسات إينفيتروجن الجزيئي </td><td> S36936 </td><td> تصاعد المتوسط. تخزين في -20 درجة. </td></tr><tr><td> Glyceرول </td><td> فيشر العلمية </td><td> G31-1 </td><td> للتركيب. إعداد 10 مل من 50٪ مع تخفيف المقطر متجر، والمياه في درجة حرارة الغرفة. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> لتخدير الذباب الكبار. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> معدات </td></tr><tr><td> اثنين ملقط حاد (دومون # 55) </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard إلاستومر سيليكون 184 كيت </td><td> داو كورنينج </td><td></td><td> إعداد طبق تشريح Sylgard عن طريق ملء طبق بتري البلاستيكية التي تحتوي على خليط Sylgard. </td></tr><tr><td> ثلاثة أطباق الزجاج جيدا تشريح </td><td> فيشر العلمية </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> TWس دبابيس تشريح minutien (0.1 مم) واثنين من pinholders (12 سم) </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 26002-10 </td><td> إدراج أحد minutien دبوس في كل من البلدين وpinholders ثني واحدة من دبابيس لتشكيل هوك. </td></tr><tr><td> تغطية زلات المجهر (22x22 24x40 و-1-1) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> الشرائح المجهر (25x75x1.0 مم؛ precleaned) </td><td> فيشر العلمية </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> مسح طلاء الأظافر أو لاصق شفاف </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> شاكر المداري </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> الشريحة حامل مربع </tد&gt; <td> فيشر العلمية </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> بيميس </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> رقيقة الرسام </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> وP20 P200 micropipettes ونصائح </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> تشريح المجهر </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> دلو الثلج الصغيرة مع </td><td></td><td></td><td> لتبريد ألواح الزجاج جيدا، تشريح شبكية العين والحلول. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

العين ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا مجمع يتكون من نحو 750 ommatidia (عيون وحدة). ويتألف كل مقيلة من حوالي 20 الخلايا، بما في ذلك الخلايا المخروطية عدسة إفراز، الخلايا الصبغية، خلية الشعر الخشن وثمانية خلايا مستقبلة للضوء (PRS) R1-R8 2. استراتيجية الحد من الفقر لديها هياكل متخصصة microvillar، وrhabdomeres، والتي تحتوي على أصباغ حساسة للضوء، وRhodopsins (RHS). وrhabdomeres ستة المستفيدين الرئيسيين (R1-R6) تشكيل شبه منحرف وتحتوي على RH1 3 4. يتم وضع rhabdomeres من R7 R8 وجنبا إلى جنب في وسط شبه منحرف، وتقاسم نفس المسار للضوء. R7 R8 والمستفيدين الرئيسيين التعبير عن عشوائيا مجموعات مختلفة من RHS في نوعين الرئيسي 5: في النوع الفرعي &#39;ع&#39;، ويقترن RH3 في R7s ف مع RH5 في R8s ف، في حين أنه في النمط الفرعي &#39;ذ&#39;، ويرتبط RH4 في R7s Y مع RH6 في ذ R8s 6 7 8. مواصفات الأولى من المستفيدين الرئيسيين وتطوير ommatidia يبدأ في القرص العين antennal اليرقات تخيلي، أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية. موجة من التمايز الاحتلالات عبر القرص 9 و يبدأ التجمع من خلايا غير متمايزة في ommatidia 10-11. ويتم تحديد R8 &#39;خلية مؤسس&#39; الأول وتجند R1-6 ثم R7 12-14. في وقت لاحق، خلال التنمية العذراء، PR التمايز يؤدي إلى تغيرات شكلية واسعة 15، بما في ذلك تشكيل rhabdomere، synaptogenesis والتعبير RH في نهاية المطاف. في هذا البروتوكول، ونحن تصف أساليب تشريح الشبكية والمناعية في ثلاث فترات محددة من التنمية شبكية العين، والتي يمكن تطبيقها لمعالجة مجموعة متنوعة من المسائل المتعلقة بتشكيل الشبكية ومسارات التنمية. هنا، ونحن نستخدم هذه الأساليب لتصور التمايز التدريجي PR على مستوى وحيدة الخلية في جبل اليرقات كله، وشبكية العين midpupal الكبار ( <sترونج&gt; الشكل 1).

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين هو الكريستال المشبك مثل تتألف من عدد صغير من أنواع الخلايا التي يتم إنشاؤها بطريقة نمطية<sup&gt; 1</sup&gt;. قابليته لالتحليل الجيني تطورا يسمح للدراسة البرامج التنموية المعقدة. يصف هذا البروتوكول تشريح والمناعية من شبكية العين في المراحل الثلاث المنفصلة التنموية، مع التركيز على التمايز مبصرة.

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

25.1K Views.  New York University. ال ذبابة الفاكهة شبكية العين هو الكريستال المشبك مثل تتألف من عدد صغير من أنواع الخلايا التي يتم إنشاؤها بطريقة نمطية 1. قابليته لالتحليل الجيني تطورا يسمح للدراسة البرامج التنموية المعقدة. يصف هذا البروتوكول تشريح والمناعية من شبكية العين في ?...

Video: Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

رسم الخرائط وتطبيق التعبير Flippase محسن شرك في اليرقات والكبار ذبابة الفاكهة CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

وحيد ذبابة الفاكهة Ommatidium تشريح والتصوير

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

التحليل الوظيفي للتغذية اليرقات الدائرة في ذبابة الفاكهة</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

التصوير المباشر ل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

شراء عالية الجودة الفيديو الرقمية<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; السلوكيات اليرقات والكبار من منظور الجانبي

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

جبل كله تشريح والمناعي من الكبار ماوس القوقعة

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

عن طريق القنوات الخطي الاغاروز لدراسة<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات الزحف السلوك

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

وبسيطة خطوة واحدة بروتوكول تشريح لجبل لالجامع إعداد الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; أدمغة

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

التحليل الأيضي اليرقات melanogaster المورفولوجية و "العقول الكبار"

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...