עבודה זו נתמכה על ידי מלגת Ehrman לח.י.. ח&#39;, קרן ג&#39;יין קופין צ&#39;יילדס זיכרון למלגת דוקטורט מחקר רפואית לRJJ, NIH F32EY016309 גרנט לDV, מלגת ניו יורק של דיקן אוניברסיטה לעבודת דוקטור DJ, GrantR01 NIH EY13010 לתקליטור ואחוות DFG לJR (RI 2208/1- 1). אנו מודים לנינה וגט ופמלה Boodram להערות על כתב היד.

<html> 1. מבוא בסרטון הזה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות התפתחותיות מוגדרות: 3 instar הזחל, midpupal ושלב המבוגר. למרות שהפרוטוקול שלנו פועל גם עבור שלבי גלמים אחרים (לפרטים על שלבים מוקדמים יותר, ראה 16), בחר בשלב midpupal, כפי שהוא אופטימלי להדמיה כל הפורטוריקנים במישור מוקד אחד והגרעינים שלהם הם קל לזיהוי, המאפשר הדמיה של דפוסי ביטוי של גורמי שעתוק. הנתיחה של גלמי רשתיות מאוחר דומה מאוד לנתיחה של רשתית בוגרת. ראשית, אנו מדגימים כיצד לאסוף זחלים וגלמים בשלבים הרצויים. אז, תסבירו כיצד להשיג נתיחות אופטימליות של זחל 17-18, midpupal ורשתיות בוגרות. שנית, אנחנו מדגימים איך לדמיין פיתוח יחסי הציבור בשלבים אלה באמצעות מיקרוסקופיה confocal ואימונוהיסטוכימיה. s = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. בימוי ועריכת הדגימה תקופת ההתפתחות של חרקים היא טמפרטורה תלויה. כדי להקל על היערכות לשחזור של זחלים וגלמים, אנו ממליצים להעלות את כל המניות לטוס ב25 ° C במחזור 12 hr/12 שעתי אור / חושך. זחלים שלישי instar: כ 96 שעות לאחר הטלת ביצה (ב 25 ° C), האכלה מאוחר 3 instar זחלי תחנה ולשוטט על קירות בקבוקון המזון, שבו הם בסופו pupate. השתמש במברשת רכה או מלקחיים עדינים המסיר את זחל נדודים השלישי instar מקיר בקבוקון מזון. גלמי 50% (&#39;midpupae&#39;) הם נצפו כ 48 שעות לאחר התגלמות. לעיתוי מדויק, אתה יכול להקיף גלמים לבנים בנויים רק עם סמן על בקבוקון מזון. לחלופין, להעביר את כל הגלמים הלבנים לבקבוקון חדש לקבלת בקבוקון של בימוי אחיד (לבימוי של גלמים תוך שימוש בקריטריונים מורפולוגיים, ראה 19). לאחר 48 שעות, בזהירות remאובת midpupae מהבקבוקון שמשתמש במלקחיים. זבובים בוגרים: זבובים להרדים מבוגרים צעירים (2-5 ימים לאחר eclosion) על משטח CO 2. הסר את הראש באמצעותו מלקחיים ולאחסן אותם בכוס כן ​​קערה ובה הקר 1x PBS. 3. נוהל דיסקציה (1-2 שעות אודות לניסוי) לאחר איסוף הדגימה, למקם אותם בטיפה הקרה PBS על צלחת נתיחת Sylgard. לנתח על 10-15 רשתיות לגנוטיפ. נא להתייעץ את גיליונות בטיחות חומרי נתונים, כמו גם הבריאות והסביבה של המוסד שלך ומשרד ביטחון לטיפול הולם של החומרים כימיים והציוד (ראה טבלאות בסוף הפרוטוקול זה). 1. דיסקים דמותי Eye זחל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הקצה הקדמי של הזחל, המכיל את הקרסים בפה. השתמש במלקחיים כדי ללחוץ על החלק האמצעי של הזחל בעדינות בבסיס של מנת Sylgard. השתמש anothאה מלקחיים כדי לתפוס את קרסי הפה ומשוך בעדינות ובאיטיות מהגוף. השלך את החלק העיקרי של הגוף, ולהשתמש באיברי הפה כדי להחזיק את החלק הקדמי כדי להסיר רקמות מיותרות מהדיסקים הדמיוניים שנותרו צמוד למוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מוח עם דיסקים דמותי ידי תופס את קרסי פה עם מלקחיים ל1x PBS בצלחת זכוכית של שלוש טובה. לבצע שלב קיבעון (שלב 4.1.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, להסיר בלוטות רוק, רקמת שומן ומושך את המוח מהדיסק הדמיוני עיני המחושים. כדי לשפר את הנגישות של נוגדנים &#39;קשים&#39;, קרום peripodial, הנמצא על פני השטח של האפיתל, ניתן להסיר על ידי לחיצה רצופה על חלק המחושים של הדיסק וקילוף הקרום משם עם סיכה לנתח. בשלב בא, לבצע אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.). </li></ol> 2. התגלמות / Midpupal רשתיות 50% <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק קצה אחורי של מקרה גלמים עם מלקחיים.סור בעדינות את המשטח הקדמי של מקרה הגלמים שנאחז בציפורן עם מלקחיים עוד ולהתרחק באיטיות מpuparium. לקלף ציפורן שיורים לחשוף את הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעצות של המלקחיים כדי לדקור את השק הבסיסי, הרך באזור הקדמי הגבה. זה מספק גישה לראש. עדינות להפריד את הראש מבית החזה על ידי מציצה לאט את הראש עם פיפטה P20. לגרש את הראש מקצה פיפטה לתוך קר הטרי 1x PBS והסרת רקמה עודפת; לתפוס את הציפורן ולהסיר את ראש חוטם. המשך לצעד קיבעון (שלב 4.1.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פירס האונה האופטית עם סיכת ביתור 1 כדי לייצב את הרקמות. הכנס את הסיכה לנתח האחרת בין lamina והרשתית להיפרד מרשתית lamina / האונה אופטית. בצע אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.). </li></ol> 3. עיניים מבוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את מרכז כמוסת הראש האחורית עם מלקחיים ולהסיר חלקי פה (חוטם), tiss שומןue וtracheae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את הציפורן עם הראש הגבה 1 מלקחיים ולהשתמש בזה כדי להפריד את עיניים מרקמת המוח על ידי משייכתו בעדינות צידה. ברוב המקרים, lamina, נדן דק ושקוף של neuropil המוח, יישאר מחובר לרשתית. זה קל יותר להסיר את lamina לאחר קיבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת ציפורן בשולי העין, אבל להשאיר חתיכה קטנה מאחור כדי להקל על העברת רשתיות לפתרונות שונים. לבצע קיבוע (שלב 4.1.). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את lamina ידי תופס אותו בצד אחד עם מלקחיים ומושכים בעדינות צידה עם מלקחיים האחרים מבלי לפגוע ברשתית. הסרת ציפורן שיורים, כפי שאפשר לקפל לתוך הרשתית במהלך ההרכבה. שני צעדים אלה הם קריטיים להמחשת photoreceptors, שאחרת היה מוסתר על ידי lamina ושרידים של ציפורן במהלך תהליך ההדמיה. המשך אל אימונוהיסטוכימיה (שלב 5.1.). </li></ol> 4. קיבעון וwashing (אודות 1 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הרשתיות הגזורות ב1x PBS בכלי זכוכית גם שלושה מונחים על קרח בזמן הכנה טריה מקבעים (לדלל 40 microliters של 37% פתרון פורמלדהיד עם 360 μl של 1x PBS, מערבולת וחנות על קרח). אנו ממליצים להמשיך בפרוטוקול הקיבעון ולהימנע מזמני אחסון ארוכים על קרח (&gt; 15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף 1x PBS עם 200 μl של 3.7% פתרון פורמלדהיד. ודא הרקמה שקועה במקבע. זה קריטי, כפי שהוא עשוי אחרת לא ניתן לתקן כראוי. אם יש צורך, להסיר בועות אוויר וtracheae עם המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על ייקר במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף מקבעים עם 1x PBS ולשטוף פעמים עם 1x PBS. המשך כביסה ב PBS למשך 30 דקות (שבייקר, בטמפרטורת חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף PBS עם PBST. שטוף פעמים עם PBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בהסרת קרום peripodial מדיסקי זחל עיניים (3.1.3). וlaminas מרשתיות midpupal / מבוגר &lt;חזק&gt; (3.2.3., 3.3.4.). </li></ol> 5. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה: החלף PBS עם 200 μl של סרום הנורמלי של 5% בPBST ולדגור רשתיות במשך 20 דקות על שייקר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף פתרון חסימה עם פתרון נוגדן ראשוני. לאטום את הצלחת שלוש היטב עם parafilm ודגירת הלילה בייקר בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף פתרון עם PBST ולשטוף 3 פעמים. המשך כביסה עם PBST למינימום של 1 שעה שבייקרה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה בפתרון שני נוגדנים ולדגור בצלחת parafilm אטומה היטב בכוס שייקרו לילה בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף פתרון נוגדן עם PBST ולשטוף שלוש פעמים. המשך כביסה עם PBST למינימום של שעה אחת שבייקר בטמפרטורת חדר. הדגימות יכולות להיות כל זמן בPBST במשך כמה ימים, אבל זה קריטי להוסיף PBST טרי לפחות פעם ביום כדי למנוע מהם להתייבש. </li></ol> 6. Mounting <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכבת עדשות של זחל וmidpupal, השתמש P20 להעביר רשתיות למרכז שקופית זכוכית נקיה. הסר PBST העודף. השתמש במלקחיים כדי ליישר את הרשתיות כדי לאפשר הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של הרכבה בינונית על גבי הרשתית. לכסות אותם בעדינות עם פתק כיסוי 24x40-1 וחותם עם לק השקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למבוגרי רשתיות הרכבה, להכין &#39;הגשרים&#39; 20: להוסיף שתי טיפי μl 5 של גליצרול 50% בשני הקצוות של צד זכוכית ולכסות אותם בתלושי כיסוי 22x22-1 (0.13-0.17 מ&quot;מ עובי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBST עם פיפטה P20; לוודא שהרשתית לא תתייבש. הוסף 20 μl של הרכבה בינונית עד טוב. השתמש בינוני גובר להעביר רשתיות עם P20 לשקופית &#39;הגשר&#39; הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במלקחיים כדי לכוון (עדשות צריכות להתמודד שקופיות זכוכית) וליישר את הרשתיות כדי לאפשר הדמיה. אם יש צורך, להסיר בועות אוויר עם P20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטמקום להחליק כיסוי 24x40-1 (0.13-0.17 מ&quot;מ עובי) מצד אחד על גבי וקצוות חותמים עם לק השקוף או נייר דבק. דגימות חנות ב 4 ° C בתיבת שומר שקופית מיקרוסקופ (לשמור בחושך). </li></ol> 7. נציג תוצאות כדוגמה ליישום של פרוטוקול זה, אנו מראים תוצאות יציגות להמחשת בידול photoreceptor בשלושת שלבי ההתפתחות בוידאו. דיסק עיני מחושי זחל ורשתית midpupal הוכתמו נוגדנים מטביעים סוגי photoreceptor שונים במהלך התפתחותם (איור 1 א &#39;, ב&#39;) ורשתית מבוגר הייתה מוכתמת בשני נוגדני rhodopsin לדמיין שתי תת photoreceptor (התרשים 1C).

<ol>
	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li><li>Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+the+fly+retina.">Functional organization of the fly retina.</a> Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).</li><li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin.">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster.">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells.">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li><li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila:+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification.">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li><li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila:+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells.">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li><li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc.">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li><li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye.">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development:+sevenless,+bride+of+sevenless+and+rough.">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li><li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila.">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li><li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+fly+eye:+terminal+differentiation+events+of+the+retina,+corneal+lens,+and+pigmented+epithelia.">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li><li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system.">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li><li>Wolff, T., Sullivan, W. e. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histological+Techniques+for+the+Drosophila+Eye+Part+I:+Larva+and+Pupa.">Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).</li><li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li><li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development.">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging.">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).</li><li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype.">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina.">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).</li><li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye.">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li><li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin/NF2,+Kibra,+Lgl,+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate.">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li><li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors.">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li><li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time.">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

1. פתרון בעיות מניסיוננו, נתיחות דורשות תרגול (עד מספר שבועות) והם הקלו על ידי השגת עמדת יד נוחה של 21 על נח את המרפקים ואמות על השולחן ובאצבעות יצירת קשר עם צלחת הניתוח. אצבעות בדרך זו, רק אגודלים, אינדקס ובינוניים לבצע תנועות עד...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td></td><td></td><td> מגיב </td></tr><tr><td> פוספט נאגר מלוח (PBS1x, 7.4 pH) </td><td> סיגמא </td><td></td><td> הכן את פתרון המניות 10x 20. לדלל במים מזוקקים להשיג 1x PBS וחנות בטמפרטורת חדר. לקרר בקרח לפני הניתוחים. </td></tr><tr><td> טריטון X-100 </td><td> סיגמא </td><td> 9002-93-1 </td><td> זהירות:! גירוי ללבוש כפפות. הכן 50 המ&quot;ל 1xPBS עם 0.3% Triton X-100 (PBST). לאחסן בטמפרטורת חדר. </td></tr><tr><td> 37% תמיסת פורמלדהיד </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> F75P1GAL </td><td> זהירות:! מסרטן רעיל, צפוי אדם להשתמש בכפפות. לפני צעד הקיבעון, טרי להכין תמיסת 3.7% במנדף כימי על ידי דילול עם PBS, חנות על קרח. </td></tr><tr><td> 5% סרום סוס רגיל </td><td> ג&#39;קסון חיסוני מחקר </td><td> 008-000-001 </td><td> הכן 5% דילול v / v בPBST. אחסן בארבעה תארים. </td></tr><tr><td> נוגדנים ראשוניים ומשניים (לדוגמא דונקי אנטי כבשי Alexa פלואוריד 488, דונקי אנטי הארנב Alexa פלואוריד 555, דונקי אנטי עכבר Alexa פלואוריד 647) </td><td> בדיקות מולקולריות Invitrogen </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> דלל נוגדנים 1:800 בPBST וחנות בארבעה תארים משניים. </td></tr><tr><td> Alexa פלואוריד 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> דלל 1:100 בפתרון נוגדנים משני. </td></tr><tr><td> מגיב Antifade זהב Slowfade </td><td> בדיקות מולקולריות Invitrogen </td><td> S36936 </td><td> הרכבה בינונית. אחסן ב-20 מעלות. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> G31-1 </td><td> להרכבה. הכן 10 מ&quot;ל של דילול 50% במים, חנות מזוקקת בטמפ &#39;החדר. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> להרדמת זבובים בוגרים. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> שני מלקחיים חדים (דומון # 55) </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> ערכת אלסטומר Sylgard 184 סיליקון </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> הכן צלחת נתיחת Sylgard ידי מילוי צלחת פטרי פלסטיק עם תערובת Sylgard. </td></tr><tr><td> מנות נתיחת הזכוכית שלוש גם </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two minutien סיכות מבתרות (0.1 מ&quot;מ קוטר) ושתי pinholders (12 סנטימטר) </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 26002-10 </td><td> הכנס סיכה אחת minutien בכל אחד משני pinholders ולכופף את אחד מהפינים בצורת קרס. </td></tr><tr><td> תלושי כיסוי מיקרוסקופ (22x22-1 ו24x40-1) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות מיקרוסקופ (25x75x1.0 מ&quot;מ; precleaned) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 צינורות מ&quot;ל microcentrifuge </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> נקה לק או נייר דבק </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> אורביטל שייקר </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> תיבת מחזיק שקופיות </tד&gt; <td> הפישר סיינטיפיק </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> מכחול דק </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 וP200 micropipettes וטיפים </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ביתור מיקרוסקופ </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> דלי קטן עם קרח </td><td></td><td></td><td> לקירור לוחות הזכוכית, גם הרשתית גזורה והפתרונים. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

העין המורכבת של דרוזופילה melanogaster מורכב מכ 750 אומטידיה (עיני יחידה). כל אומטידיום מורכב מכ 20 תאים, כולל תאי מפרישי עדשה חרוט, תאי פיגמנט, תאי זיפים ושמונה photoreceptors (PRS) R1-R8 2. הפורטוריקנים יש מבנים מיוחדים, microvillar את rhabdomeres, המכילים פיגמנטים רגישים לאור, את Rhodopsins (RHS). את rhabdomeres של שישה הפורטוריקנים (R1-R6) בצורת טרפז ומכיל Rh1 3 4. את rhabdomeres של R7 ו R8 מוצב במקביל במרכז הטרפז ולשתף אותו הנתיב של אור. R7 והפורטוריקנים R8 stochastically להביע שילובים שונים של RHS בשני תתי סוגים עיקריים 5: בתת סוג &#39;P&#39;, בעמ &#39;Rh3 R7s היא בשילוב עם Rh5 בעמ R8s, ואילו בתת הסוג &quot;Y&quot;, בRh4 y R7s קשור RH6 בy R8s 6 7 8. מפרט מוקדם של הפורטוריקנים ופיתוח של אומטידיה מתחיל בדיסק זחל עיני מחושים הדמיוני monolayer של תאי האפיתל. גל של בידול חולף על פני הדיסק 9 ויוזם את ההרכבה של תאים לא עברו התמיינות לאומטידיה 10-11. &#39;תא המייסד&#39; R8 מצוין ראשון ומגייס R1-6 ולאחר מכן R7 12-14. לאחר מכן, במהלך התפתחות גלמים, בידול יחסי הציבור מוביל לשינויים נרחבים מורפולוגיים 15, כולל היווצרות rhabdomere, synaptogenesis וסופו של דבר ביטוי RH. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטות לניתוחים ואימונוהיסטוכימיה רשתית בשלוש תקופות מוגדרות של התפתחות רשתית, אשר יכול להיות מיושמות על מנת לטפל במגוון רחב של שאלות הנוגעות להיווצרות רשתית ומסלולי התפתחות. כאן, אנו משתמשים בשיטות אלה כדי להמחיש את בידול יחסי הציבור ההדרגתי ברמת התא בודד בכל הר זחל, midpupal ומבוגרות רשתיות ( <sטרונג&gt; איור 1).

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas at JoVE.com

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתית היא סריג הגבישי דמוי המורכבים ממספר קטן של סוגי תאים שנוצרים באופן סטריאוטיפי<sup&gt; 1</sup&gt;. amenability לניתוח גנטי מתוחכם מאפשר הלימוד של תוכניות התפתחותיות מורכבות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחים ואימונוהיסטוכימיה של רשתית בשלושה שלבי התפתחות נפרדים, עם דגש על בידול photoreceptor.

נתיחה ואימונוהיסטוכימיה של זחל, גלמים ומבוגרים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רשתיות

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

25.1K Views.  New York University.  דרוזופילה רשתית היא סריג הגבישי דמוי המורכבים ממספר קטן של סוגי תאים שנוצרים באופן סטריאוטיפי 1. amenability לניתוח גנטי מתוחכם מאפשר הלימוד של תוכניות התפתחותיות מורכבות. פרוטוקול זה מתאר ניתוחים ואימונוהיסטוכימיה של רשתית בשלושה שלבי התפתחות נפ?...

Video: Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

מיפוי יישומים הביטוי Flippase Enhancer-מלכודת הזחל וגם למבוגרים תסיסנית CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

דיסקציה של Utricle עכבר מבוגר adenovirus בתיווך זיהום המשנה תאים

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

הדמיה חיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; הזחל Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

רכישת באיכות גבוהה וידאו דיגיטלי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Behaviors הזחל ומבוגרים מנקודת מבט רוחבי

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

ההר שלם Dissection וImmunofluorescence של מבוגרי עכבר השבלול

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em&gt; תסיסנית</em&gt; התנהגות זחל זחילה

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em&gt; תסיסנית</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...