We appreciate and would like to thank the Howard Hughes Medical Institute for the HHMI Professor award to U.B. which made this project possible. We thank the college at the University of California, Los Angeles for providing facilities and teaching infrastructure support for this work. The work was also supported with funding from Midwestern University and a generous donation from the Charity Fidelity Gift Fund. We thank John VandenBrooks for comments on the manuscript and Krista Pearman for her technical assistance.

هذا الإجراء هو إجراء 2 يوم. يوم 1 (2 ساعة + تشريح الوقت) 1. العذراء القرص تشريح العين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خادرة للتشريح. ملاحظة: عمر خادرة أن تشريح ستحدده الاحتياجات التجريبية. ومع ذلك، إذا فحص مورفولوجيا الخلية، وهذا كثيرا ما يتم في 42 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) عند 25 درجة مئوية، وهو عمر الشرانق يظهر في شريط الفيديو. جمع الشرانق الأبيض (APF اعتبر 0 ساعة) مع الفرشاة المبللة وترتيبها حسب التسلسل الزمني (على أساس جمع الوقت) في جديدة قارورة ذبابة المواد الغذائية حافظت على 25 درجة مئوية. تشريح الشرانق العمر في نفس هذا الترتيب الزمني للحفاظ على فروق التوقيت بين الشرانق في أقرب وقت ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل خادرة إلى قطرة من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4، انظر المواد للصفة) على لوحة سيليكون تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد الجزء العلوي من حالة العذراء مع ملقط وبيرس وفتح لOWER جزء من حالة العذراء مع زوج من ملقط حادة. إزالة خادرة من الحال في حفرة تشكلت حديثا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اجراء خفض قطري مع مقص، منتصف الصدر، في خادرة. إزالة الحطام أو نقل رئيس خادرة إلى انخفاض جديد من برنامج تلفزيوني. نظيف باستخدام ماصة أنبوب منفاخ (انظر المواد والشكل 1 لمزيد من التفاصيل) وإضافة برنامج تلفزيوني إضافية حسب الحاجة. تأكد لتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبضة آمن الجزء العلوي من رأسه إهاب العذراء مع زوج من ملقط. باستخدام غيض من أنبوب منفاخ، ودفع بلطف على حالة العذراء لبثق المخ والأنسجة الأخرى، بما في ذلك أقراص العين، للخروج من حالة العذراء. تأكد من تجنب الاستيلاء على أي نوع من الأنسجة داخل بشرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أنبوب منفاخ مليئة PBS، ضربة بلطف أنسجة الجسم الدهون وغيرها من الحطام للخروج من حالة الرأس لفصل بوضوح والتعرف على أقراص الدماغ والعين. ملاحظة: سيتم الحفاظ على الدماغ تعلق على حالة رئيس العذراء يسمح الباحث لانه يستخدمحالة الإعلان بأنه &quot;مقبض&quot; للتلاعب في المستقبل من الأنسجة دون الإضرار أقراص العين أو الدماغ. ومع ذلك، فإنه من الشائع لإزاحة أقراص الدماغ والعين من الرأس وهذه الحالة ليست ضارة لإجراء الشامل والنتائج. وعادة ما يستغرق عدة محاولات للنفخ ودفع لاستخراج بنجاح الأقراص العين والدماغ من داخل حالة رئيس العذراء وبحيث تكون منفصلة عن الأنسجة المحيطة بوضوح. وأنظف وأكثر واحد منفصل يمكن الحصول على أقراص العين من الأنسجة المحيطة بها سوف تساعد على منع الأنسجة الغريبة من تحديد إلى أقراص العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التشريح، ونقل على الفور إلى الأنسجة طبق زجاج 3 جيدا على الجليد مع 0.5 مل من محلول فيكس (انظر المواد). تطفو على الأنسجة على السطح من الحل فيكس لبضع دقائق (عادة الوقت الذي يستغرقه لتشريح المجموعة التالية من أقراص العين). ملاحظة: إذا لم يكن هذا أول قرص العين ليتم تشريح في هذه الجولة من تشريح، completelذ غمر القرص العين السابق في حل فيكس. إن القيام بإجراءات تلطيخ الخاصة (على سبيل المثال، أنواع الاكسجين التفاعلية، الجسيمات الحالة، الخ) يجب أن يتم ذلك قبل التثبيت. من أجل القيام بذلك، تخزين أقراص تشريح العين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة قبل الاستمرار مع بروتوكول تلطيخ المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد تشريح وغمر جميع أقراص يجري تشريح العين، تحريك الطبق الزجاجي 3 بالإضافة إلى الروك والروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li></ol> 2. المناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية الحل فيكس وإضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني مع 0.3٪ تريتون X-100 (0.3٪ PBT، انظر المواد) وغسل الأنسجة على الكرسي الهزاز لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما). ملاحظة: إزالة بعناية من الحل من البئر يمكن إجراء تشريح تحت المجهر لمنع تلف الأنسجة أو الخسارة. يمكن أن يستنشق الحل بعناية مع الماصة. نحن نفضل-tippe غرامةد، يمكن التخلص منها نقل الماصة التي تمت زيارتها فتح بالارض لتقليل فرصة الشفط الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية غسل 4، وإزالة غسل وإضافة 0.5 مل من محلول كتلة (انظر المواد) إلى البئر واحتضان لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يمكن تمديد هذا الإطار الزمني وفقا لاحتياجاتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الوقت كتلة 30 دقيقة، الماصة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الحل الابتدائية (مخففة في حل بلوك) إلى العدد المناسب من الآبار في لوحة microwell. ملاحظة: سيكون أحد بئر من لوحة microwell تستوعب حوالي 4 أزواج من أقراص العين التي تعلق على حالة العذراء أو 8 أزواج منعزلة من أقراص العين مع العقول المرفقة. الأجسام المضادة الأولية المستخدمة في هذا البروتوكول لبيانات تمثيلية هي مكافحة فسفوتيروزين (1: 500 تمييع) ومضادة للقطع (1: 200 تمييع). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة تشريح في الآبار لوحة microwell مليئة الجسم المضاد الحل الأساسي من الطبق الزجاجي 3 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكانلوحة microwell على منشفة ورقية مبللة (لمنع الجفاف) في علبة فارغة طرف الماصة (أو حاوية أخرى مماثلة) وتخزينها في 4 درجات مئوية خلال الليل. </li></ol> يوم 2 (4 + ساعة الوقت التركيب) <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة من لوحة microwell إلى 3 جيدا طبق زجاج جديد مع 0.3٪ PBT (≈0.5 مل)، وغسل الأنسجة لمدة 10 دقيقة على الروك. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أكثر ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غسل الماضي وإضافة 0.5 مل من محلول بلوك إلى البئر. منع لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: يمكن تمديد هذا الإطار الزمني وفقا لاحتياجاتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة كتلة الحل وإضافة 0.5 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية (مصنوعة من الأجسام المضادة fluorescently المسمى المناسبة لالضد الخاص الابتدائي والطول الموجي الفلورسنت، مخففة في حل بلوك) إلى البئر وحماية طبق زجاج 3 جيدا من الضوء مع غطاء أو الألومنيوم احباط واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة في غرفةدرجة الحرارة. ملاحظة: جميع الخطوات اللاحقة ينبغي حماية بالمثل من التعرض للضوء. هذه الحضانة يمكن تمديدها ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية، في الإعداد مماثل للحضانة الأجسام المضادة الأولية، ولكن يمكن أيضا أن يؤديها في طبق زجاج 3 جيدا مغطاة فيلم المختبر، أو لوحة microwell إذا كان المطلوب المحافظة على الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية الحضانة الضد، وإزالة الأجسام المضادة الثانوية الحل وإضافة 0.5 مل من 0.3٪ PBT إلى البئر وتغسل على الروك لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة ليصبح المجموع 4 يغسل (10 دقيقة لكل منهما). ملاحظة: إذا كان المطلوب تلوين دابي، قبل البدء في غسل الأولى، إضافة 0.5 ميكرولتر من محلول المخزون دابي (انظر المواد) إلى 500 ميكرولتر من PBT التي سيتم استخدامها لغسل الأولى (1: 1،000 التخفيف). </li></ol> 3. تركيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نهاية غسل الماضي، تركيب أقراص antennal / العين على شريحة باستخدام 70٪ الجلسرين أو برنامج تلفزيوني كوسيلة لإزالة رعين والأنسجة الأخرى غير المرغوب فيها في بركة على جانب واحد من الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرك بحذر الأنسجة باستخدام الضغط الهيدروليكي بين ملقط، أو بلطف شديد مع طرف الملقط، ويصطف على أقراص العين في عمود نحو وسط الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جميع الجلسرين دخيلة أو برنامج تلفزيوني من جميع أنحاء الأنسجة (باستخدام إجراءات فتل مختبر مسح أو ملقط لهذا العمل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع كمية صغيرة (≈10 ميكرولتر) من تصاعد المتوسطة على طول جانب واحد من العمود قرص العين ووضع ساترة على الأنسجة وذلك لنشر المتوسطة المتزايدة على أقراص العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الجلوس الشريحة من 1 إلى 2 دقيقة للسماح للأنسجة / متوسطة متزايدة لتنتشر بشكل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمسح أي وسيلة إضافية متصاعدة خارج من حول حواف ساترة وختم ذلك مع طلاء الأظافر واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور الفلورسنت من أقراص العين باستخدام متحد البؤر المجهري. </li></ol>

<ol>
	<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+Drosophila+retina,+a+neurocrystalline+lattice.">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye:+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave.">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113 (3), 841-850 (1991).</li><li>Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye.">Pattern formation in the Drosophila eye.</a> Curr Opin Genet Dev. 17 (4), 309-313 (2007).</li><li>Bao, S., Cagan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+adhesion+mediated+by+Hibris+and+Roughest+regulates+morphogenesis+and+patterning+in+the+Drosophila+eye.">Preferential adhesion mediated by Hibris and Roughest regulates morphogenesis and patterning in the Drosophila eye.</a> Dev cell. 8 (6), 925-935 (2005).</li><li>Grzeschik, N. A., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IrreC/rst-mediated+cell+sorting+during+Drosophila+pupal+eye+development+depends+on+proper+localisation+of+DE-cadherin.">IrreC/rst-mediated cell sorting during Drosophila pupal eye development depends on proper localisation of DE-cadherin.</a> Development. 132 (9), 2035-2045 (2005).</li><li>Sprecher, S. G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch+of+rhodopsin+expression+in+terminally+differentiated+Drosophila+sensory+neurons.">Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons.</a> Nature. 454 (7203), 533-537 (2008).</li><li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster.">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40 (4), 851-858 (1985).</li><li>Voas, M. G., Rebay, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+integration+during+development:+insights+from+the+Drosophila+eye.">Signal integration during development: insights from the Drosophila eye.</a> Dev Dyn. 229 (1), 162-175 (2004).</li><li>Hsiao, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunohistochemistry+of+larval,+pupal+and+adult+Drosophila+retinas.">Dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult Drosophila retinas.</a> J Vis Exp. , 4347 (2012).</li><li>Call, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomewide+clonal+analysis+of+lethal+mutations+in+the+Drosophila+melanogaster+eye:+comparison+of+the+X+chromosome+and+autosomes.">Genomewide clonal analysis of lethal mutations in the Drosophila melanogaster eye: comparison of the X chromosome and autosomes.</a> Genetics. 177 (2), 689-697 (2007).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery-based+science+education:+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers.">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3 (2), 59 (2005).</li><li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes.">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. 37, 1936 (2010).</li><li>Xu, T., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+genetic+mosaics+in+developing+and+adult+Drosophila+tissues.">Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues.</a> Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).</li><li>Duffy, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAL4+system+in+Drosophila:+a+fly+geneticist's+Swiss+army+knife.">GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife.</a> Genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

While it appears that the process is simple and easy to perform, in reality, this technique requires a great deal of practice to master. Routinely, we start students off by learning to dissect and mount third instar eye discs12, which are much easier to work with. This practice helps to develop an appropriate dissection position of the arms, hands and fingers13 so that manipulation of the forceps under the dissecting microscope is stable, easy and experienced. In essence, the practice period shou...

مجالات البيولوجيا التطورية والخلايا قد تأثرت إلى حد كبير من قبل كائن نموذج: ذبابة الفاكهة السوداء البطن. ضمن هذا النموذج، وقد ساهمت الدراسات القرص العين على قدر كبير من المعرفة فيما يتعلق الإشارات، بيولوجيا الخلية وغيرها من المناطق. وقد درس الراحل ثالث اليرقات القرص الطور العين وعلى نطاق واسع هو نموذج قوي للاستفادة، كما أنه يعطي لمحة عن سلسلة من الفترات التنموية، مع كل جزيئاته الإشارات الفريدة الخاصة والعمليات، كما تقدم ثلم المخلق عبر القرص العين 8. ومع ذلك، هناك حاجة إلى توسيع فهمنا للعمليات التنموية في مرحلة العذراء للتنمية. في حين كانت هناك دراسات على القرص عين العذراء 3-7 والمعرفة لدينا لا تقترب من اتساع نطاق العمل الذي تم القيام بها على القرص الثالث الطور العين. ويرجع ذلك، في جزء منه، إلى صعوبة أكبر في تشريح العين القرص العذراء. لذا، عرضا للالأسلوب السليم للتشريح يمكن أن يتوسع كثيرا من البحوث في هذا المجال. في حين أن هناك مراحل في تطوير القرص عين العذراء التي يتم تشريح بسهولة، وخاصة حول فترة منتصف العذراء، وفترات زمنية أخرى هي أكثر تحديا لتشريح. هذا البروتوكول يمثل طريقة واحدة لتشريح أقراص عين العذراء التي يمكن استخدامها عالميا لجميع الأطر العذراء الوقت التنموية. هذا البروتوكول يمكن استخدامها كبديل للبروتوكول آخر 9 يبين طريقة أسهل وأسرع لتشريح أقراص العين من النقاط الزمنية midpupal. تم تصوير هذا البروتوكول أصلا وضعت لتدريب طلاب المرحلة الجامعية المتقدمة في جامعة كاليفورنيا الجامعية اتحاد البحوث في علم الجينوم الوظيفي (URCFG) 10،11 في تقنية العذراء تشريح العين. كانوا قادرين على الاستفادة من هذا الفيديو وطريقة لتعلم هذه التقنية الصعبة العديد من الطلاب الجامعيين.

<table><tbody><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4)</td><td></td><td></td><td>80 g NaCl, 2g&amp;nbsp; KCl, 14.4 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO4, 2.4 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Bring volume to 1 &amp;#956;l, adjust the pH to 7.4, autoclave or filter sterilize, dilute to 1x PBS with autoclaved ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O before using.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td>Caution: Irritant! Wear gloves.</td></tr><tr><td>0.3% PBT</td><td></td><td></td><td>1.5 ml of Triton X-100, 500 ml 1X PBS.</td></tr><tr><td>37% formaldehyde solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P1GAL</td><td>Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fix Solution</td><td></td><td></td><td>(&amp;asymp;4% Formaldehyde in PBS) 50 &amp;mu;l of 37% Formaldehyde, 450 &amp;mu;l 1x PBS, make fresh before use</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Rockland antibodies &amp;amp; assays</td><td>B304</td><td>Aliquot in 1 ml volumes and store at -80 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Block Solution</td><td></td><td></td><td>10% NGS in PBT.&amp;nbsp; This can be made and stored at 4 &amp;deg;C for a few days prior to use.</td></tr><tr><td>DAPI stock solution</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>For coutnerstaining nuclei. Prepare a 1 mg/ml solution with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>VectaShield Mounting Medium</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td>Mounting medium</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>For mounting. Prepare 70% dilution with ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nutating mixer</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td>Used to rock tissue in 3 well glass dish</td></tr><tr><td>SylGard 182 Silicone Elastomer Kit</td><td>Krayden</td><td>NC9897184</td><td>Used to make silicone dissection dish</td></tr><tr><td>Silicone dissecting dish</td><td></td><td></td><td>Mix Sylgard elastomer kit (above) according to directions gently (to avoid bubbles). Pour mixture into Petri dish (any size). Allow SylGard to cure overnight in 37 &amp;deg;C incubator.</td></tr><tr><td>3 well glass dish</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td>The 3 well variety of these are no longer available, this is the 9 well product.</td></tr><tr><td>72 well microwell minitray</td><td>Nunc</td><td>438733</td><td></td></tr><tr><td>Sharp forceps (Dumont #55)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-type Micro Scissors, Straight, 5mm blade</td><td>Ted Pella</td><td>1346</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Borosilicate glass capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td>Pull with needle puller to make fine point tip that allows a small stream of PBS to flow.</td></tr><tr><td>Disposable Transfer Pipets, Fine Tip</td><td>Samco Scientific</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Tubing dimensions given are inner diameter (ID) x outer diameter (OD) x wall thickness in inches</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVC tubing (1/8 x 3/16 x 1/32)</td><td>Nalgene</td><td>8000-0010</td><td>Use these with pulled needle to assemble the blower tube as shown in Figure 2.</td></tr><tr><td>Tygon Silicone tubing (3/32 x 5/32 x 1/32)</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>ABW00004</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Silicone tubing (1/32 x 3/32 x 1/32)</td><td>Saint Gobain Performance Plastics</td><td>ABW00001</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection and mounting of drosophila pupal eye discs

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes. It contains approximately 800 separate eye units, termed ommatidia1. Each ommatidium contains eight neuronal photoreceptors that develop from undifferentiated cells following the passage of the morphogenetic furrow in the third larval instar2. Following the sequential differentiation of the photoreceptors, non-neuronal cells develop, including cone and pigment cells, along with mechanosensory bristle cells3. Final differentiation processes, including the structured arrangement of all the ommatidial cell types, programmed cell death of undifferentiated cell types and rhodopsin expression, occurs through the pupal phase4-7. This technique focuses on manipulating the pupal eye disc, providing insight and instruction on how to dissect the eye disc during the pupal phase, which is inherently more difficult to perform than the commonly dissected third instar eye disc. This technique also provides details on immunostaining to allow the visualization of various proteins and other cell components.

كمثال لاستخدام هذا البروتوكول، توضح النتائج midpupal (42 ساعة APF عند 25 درجة مئوية) أقراص العين immunostained مع الأجسام المضادة المختلفة ترد في الشكل 2. باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد بقايا فسفوتيروزين، غشاء الخلايا يمكن أن يكون الملاحظ (الشكل 2A). وهذا يمكن أن تستخد...

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs at JoVE.com

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

تشريح وتركيب<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء أقراص العين

The Drosophila melanogaster eye disc is a powerful system that can be used to study many different biological processes.  It contains approximately 800 ...

dissection-and-mounting-of-drosophila-pupal-eye-discs

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

12.1K Views.  University of California at Los Angeles (UCLA). The goal of this technique is to enable researchers to perform dissection, immunostaining and mounting of pupal eye discs from Drosophila melanogaster of any age.

Video: Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

يعيش التصوير لل<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; العذراء العين

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Developmental Biology

Dissection of Imaginal Discs from 3rd Instar Drosophila Larvae

This protocol demonstrates the dissection technique used for isolating imaginal discs from drosophila larvae at the 3rd instar stage. Methods for fixing the tissue after saying and removing the wing, leg, and eye discs are demonstrated directly on a microscope slide for subsequent visualization.

تشريح أقراص تخيلي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي 3

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

طويلة الأجل تصوير لايف<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; القرص العين

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including lens-secreting cone cells, pigment cells, a bristle cell and eight photoreceptors (PRs) R1-R8 2. The PRs have specialized microvillar structures, the rhabdomeres, which contain light-sensitive pigments, the Rhodopsins (Rhs). The rhabdomeres of six PRs (R1-R6) form a trapezoid and contain Rh1 3 4. The rhabdomeres of R7 and R8 are positioned in tandem in the center of the trapezoid and share the same path of light. R7 and R8 PRs stochastically express different combinations of Rhs in two main subtypes5: In the 'p' subtype, Rh3 in pR7s is coupled with Rh5 in pR8s, whereas in the 'y' subtype, Rh4 in yR7s is associated with Rh6 in yR8s 6 7 8.
Early specification of PRs and development of ommatidia begins in the larval eye-antennal imaginal disc, a monolayer of epithelial cells. A wave of differentiation sweeps across the disc9 and initiates the assembly of undifferentiated cells into ommatidia10-11. The 'founder cell' R8 is specified first and recruits R1-6 and then R7 12-14. Subsequently, during pupal development, PR differentiation leads to extensive morphological changes 15, including rhabdomere formation, synaptogenesis and eventually rh expression.
In this protocol, we describe methods for retinal dissections and immunohistochemistry at three defined periods of retina development, which can be applied to address a variety of questions concerning retinal formation and developmental pathways. Here, we use these methods to visualize the stepwise PR differentiation at the single-cell level in whole mount larval, midpupal and adult retinas (Figure 1).

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

The Drosophila retina is a crystal-like lattice composed of a small number of cell types that are generated in a stereotyped manner 1. Its amenability to sophisticated genetic analysis allows the study of complex developmental programs. This protocol describes dissections and immunohistochemistry of retinas at three discrete developmental stages, with a focus on photoreceptor differentiation.

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; شبكية العين

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

Neuroscience

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries made using this system have taken advantage of the spatiotemporal nature of photoreceptor differentiation in the developing eye imaginal disc. To use this system it is first necessary for the researcher to learn to identify and dissect the eye disc. We describe a novel RFP reporter to aid in the identification of the eye disc and the visualization of specific cell types in the developing eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc from third instar larvae and describe how the eye-RFP reporter can aid in this dissection. This eye-RFP reporter is only expressed in the eye and can be visualized using fluorescence microscopy either in live tissue or after fixation without the need for signal amplification. We also show how this reporter can be used to identify specific cells types within the eye disc. This protocol and the use of the eye-RFP reporter will aid researchers using the Drosophila eye to address fundamentally important biological questions.

A Novel RFP Reporter to Aid in the Visualization of the Eye Imaginal Disc in Drosophila

We describe a novel red fluorescent protein (RFP) reporter that is expressed specifically in the Drosophila eye. We detail a methodology for dissection of the eye imaginal disc and how this reporter can be used to aid in the dissection and identification of specific cell types in the developing eye.

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة</em

The Drosophila eye is a powerful model system for studying areas such as neurogenesis, signal transduction and neurodegeneration. Many of the discoveries ...

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a plethora of mutant strains and technical tricks have been developed to allow sophisticated questions to be asked and answered in a reasonable amount of time. Fundamental insight into the interplay of components of all known major signaling pathways has been obtained in forward and reverse genetic Drosophila studies. The fly eye has proven to be exceptionally well suited for mutational analysis, since, under laboratory conditions, flies can survive without functional eyes. Furthermore, the surface of the insect eye is composed of some 800 individual unit eyes (facets or ommatidia) that form a regular, smooth surface when looked at under a dissecting microscope. Thus, it is easy to see whether a mutation might affect eye development or growth by externally looking for the loss of the smooth surface ('rough eye' phenotype; Fig. 1) or overall eye size, respectively (for examples of screens based on external eye morphology see e.g.1). Subsequent detailed analyses of eye phenotypes require fixation, plastic embedding and thin-sectioning of adult eyes.
The Drosophila eye develops from the so-called eye imaginal disc, a bag of epithelial cells that proliferate and differentiate during larval and pupal stages (for review see e.g. 2). Each ommatidium consists of 20 cells, including eight photoreceptors (PR or R-cells; Fig. 2), four lens-secreting cone cells, pigment cells ('hexagon' around R-cell cluster) and a bristle. The photoreceptors of each ommatidium, most easily identified by their light sensitive organelles, the rhabdomeres, are organized in a trapezoid made up of the six "outer" (R1-6) and two "inner" photoreceptors (R7/8; R8 [Fig. 2] is underneath R7 and thus only seen in sections from deeper areas of the eye). The trapezoid of each facet is precisely aligned with those of its neighbors and the overall anteroposterior and dorsoventral axes of the eye (Fig. 3A). In particular, the ommatidia of the dorsal and ventral (black and red arrows, respectively) halves of the eye are mirror images of each other and correspond to two chiral forms established during planar cell polarity signaling (for review see e.g. 3).
The method to generate semi-thin eye sections (such as those presented in Fig. 3) described here is slightly modified from the one originally described by Tomlinson and Ready4. It allows the morphological analysis of all cells except for the transparent cone cells. In addition, the pigment of R-cells (blue arrowheads in Fig. 2 and 3) can be used as a cell-autonomous marker for the genotype of a R-cell, thus genetic requirements of genes in a subset of R-cells can readily be determined5,6.

Preparation of Adult Drosophila Eyes for Thin Sectioning and Microscopic Analysis

A standard approach to prepare adult Drosophila eyes for semi-thin sectioning and light microscopic analysis is presented here. The protocol can be used for gross morphological analysis of eye defects, or with the indicated adjustments can be used to determine genetic requirements of genes in specific cell types of the eye (e.g. clonal analysis of photoreceptors) or for electron microscopic analysis.

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

Drosophila has long been used as model system to study development, mainly due to the ease with which it is genetically tractable. Over the years, a ...

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called imaginal discs. These discs give rise to a high percentage of adult structures that are found within the adult fly. Here we describe a protocol that has been optimized to recover these discs and prepare them for analysis with antibodies, transcriptional reporters and protein traps. This procedure is best suited for thin tissues like imaginal discs, but can be easily modified for use with thicker tissues such as the larval brain and adult ovary. The written protocol and accompanying video will guide the reader/viewer through the dissection of third instar larvae, fixation of tissue, and treatment of imaginal discs with antibodies. The protocol can be used to dissect imaginal discs from younger first and second instar larvae as well. The advantage of this protocol is that it is relatively short and it has been optimized for the high quality preservation of the dissected tissue. Another advantage is that the fixation procedure that is employed works well with the overwhelming number of antibodies that recognize Drosophila proteins. In our experience, there is a very small number of sensitive antibodies that do not work well with this procedure. In these situations, the remedy appears to be to use an alternate fixation cocktail while continuing to follow the guidelines that we have set forth for the dissection steps and antibody incubations.

Dissection and Immunostaining of Imaginal Discs from Drosophila melanogaster

The adult structures of Drosophila are derived from sac-like structures called imaginal discs. Analysis of these discs provides insight into many developmental processes including tissue determination, compartment boundary establishment, cell proliferation, cell fate specification, and planar cell polarity. This protocol is used to prepare imaginal discs for light/fluorescent microscopy.

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من<em&gt; ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

A significant portion of post-embryonic development in the fruit fly, Drosophila melanogaster, takes place within a set of sac-like structures called ...

Dissection of the Eye-Brain Complex from Fly Pupae: A Method to Isolate Retinal Tissue

Source: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. <a href="https://www.jove.com/video/59299/" target="_blank">Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation</a>. J. Vis. Exp.&#160;(2019).
This video describes how to dissect and isolate the eye-brain complex from Drosophila pupae. The featured protocol demonstrates the procedure yielding high-quality tissue, compatible with, for example, immunostaining, as well as, other gene expression experiments.

تشريح مركب العين والدماغ من شرانق الذباب: طريقة لعزل أنسجة الشبكية

Source: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. ...

تشريح وتركيب

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

يعيش التصوير لل

تشريح أقراص تخيلي من يرقات ذبابة الفاكهة طور مرحلي 3

طويلة الأجل تصوير لايف

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

تشريح والمناعية من اليرقات، العذراء وتعليم الكبار

تشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، وعزل الحمض النووي الريبي

مراسل RFP رواية للمساعدة في التصور من القرص في العين تخيلي ذبابة الفاكهة

إعداد الكبار ذبابة الفاكهة لعيون Sectioning رقيقة والتحليل المجهري

تشريح والمناعية من تخيلي أقراص من

تشريح مركب العين والدماغ من شرانق الذباب: طريقة لعزل أنسجة الشبكية