نود أن نشكر مانويلا بوداك، Marinkovi ليليانا وWullimann كريستينا للمساعدة التقنية الممتازة. نشكر W. ماكلين لتقديم حزب العمال التقدمي-GFP الفئران. ويدعم TM من قبل معهد الدراسات المتقدمة (جامعة ميونخ التقني)، من قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG؛ Sonderforschungsbereich SFB 596)، من قبل الكسندر فون همبولت، ومؤسسة، وكالة التمويل الوطني (&quot;Bundesministerium FÜR Bildung اوند Forschung&quot; ) في إطار ERA-الصافي &quot;iPSoALS&quot; الخلايا العصبيه و&quot;الفوتون التصوير 2-&quot;. ويتم دعم TM MB من قبل مركز علوم البروتين المتكامل (ميونيخ). وأيد PM بواسطة كلية الدراسات العليا للجامعة ميونخ التقني (TUM-GS).

1. المثلثية القص يزدرع (الشكل 1) التوقيت: 15 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأدوات الجراحية: 2 أزواج من ملقط، 1 زوج من مقص، 1 زوج من مقص الربيع، 1 صحن زراعة الأنسجة (10 سم). فقاعات مسبقا (حد أدنى لمدة 15 دقيقة) تبريد (4 ° C) حل رينغر مع 5٪ CO 2/95٪ O 2. ملء طبق 15-سم زراعة الأنسجة مع الثلج وتغطية ذلك مع لوحة معدنية. إعداد المجهر تشريح ووضع طبق 15-سم مع الجليد ضمن نطاق تشريح من أجل تبريد يزدرع خلال تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قاتل تخدير الماوس عن طريق جرعة زائدة isoflurane (أو أي وسيلة أخرى يوافق التضحية). رش الفأر مع الايثانول 70٪ لمنع التلوث من الفراء يزدرع. لتبيض SC، استخدمنا حزب العمال التقدمي-GFP الفئران، والتي يمكن أن عبرت OFP3-Thy1 أو Thy1 Membow13 مقابل التصور في وقت واحد من محور عصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من مقص كبير، وجعل شق خط الوسط منالجلد فوق القص واثنين من شقوق موازية للالحافة السفلية من القفص الصدري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من مقص كبير، وإزالة الجلد، وفتح جدار البطن، وجعل شقوق موازية للالقفص الصدري كل في طريق العودة إلى العمود الفقري. ثم تشريح قبالة العضلات الصدرية بجعل شقوق بالقرب من الإدراج في العضلات القص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الحجاب الحاجز مفتوح أسفل الغضروف الخنجري وتشريح قبالة الحجاب الحاجز على طول الإدراج في الساحلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد القفص الصدري بواسطة عملية الخنجري مع مجموعة من الملقط، بدء خفض الأضلاع قبالة العمود الفقري، في أقرب وقت ممكن إلى الإدراج الخاصة بهم. وينبغي خفض اليمين واليسار فوق القلب تتلاقى نحو القص قبضة. في محاولة لتجنب قطع الأوعية الدموية الرئيسية (وخاصة الأوردة تحت الترقوة). ويتحقق من خلال رفع رؤية أفضل بلطف إعداد متمسكا عملية الخنجري بالملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل خفض عرضية أسفل القص قبضةونقل يزدرع في صحن 10-سم مع تبريد 5٪ CO 2/95٪ O 2-فقاعات رينغر الحل. وضع صحن 10 سم على لوحة معدنية تغطي زراعة الأنسجة 15-سم طبق مليئة الجليد. وينبغي أن يتم كل خطوات أخرى تحت المجهر تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص صغير الربيع إزالة بقايا الغدة الصعترية، غشاء الجنب، والحجاب الحاجز (في الداخل) والعضلات الصدرية (خارج؛ الشكل 1B-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتناسب يزدرع إلى الطبق 3.5 سم، تشريح من جميع الأضلاع التي لا تضاف إلى القص. من الأفضل القيام بذلك باستخدام مقص الربيع الصغيرة وقطع الأنسجة في الأضلاع بين (الشكل 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعلقون عليه المثلثية القص العصبي العضلي في يزدرع Sylgard المغلفة 3.5 سم الأنسجة باستخدام دبابيس طبق الثقافة minutien (تقصير لمم 4 &lt;؛ الشكل 1G). يجب أن تذهب من خلال اثنين من المسامير قطع (أبيض) الغضروفية من القص. إدراج ما لا يقل عن اثنين من المسامير من خلال أضلاعه على حد سواء على الجانب الأيسر والأيمن من اليزدرع ه تهدف لقطع ليونة الغضروفية وتجنب الأضلاع تحت أو بالقرب من العضلات المثلثية. يتم استخدام أكثر دبابيس، كان ذلك أفضل (ونحن عادة استخدام 8-10). كما كنت أحدد إعداد، تأكد من أن تنتشر إلى حد ما الأضلاع، وتحديد العضلات في موقف امتدت قليلا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: تصور المواقع التي تحتوي على مستقبلات أستيل متشابك عن طريق إضافة بنغاروتوكسين بالإضافة إلى الأصباغ اليكسا (تركيز 0.8 ميكروغرام / مل في 5٪ CO 2 / O 95٪ 2-فقاعات رينغر الحل). احتضان يزدرع معقود في طبق Sylgard المغلفة لل15-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم يغسل عدة مرات مع 5٪ CO 2/95٪ O 2-فقاعات رينغر الحل. </li></ol> 2. تبيض الطوائف المنبوذة والاختياري الزمن الفاصل بين المجهري (الشكل 2) توقيت: 30 - 45 دقيقة + اختياري 1-5 ساعة لمرور الوقت. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 3.5 سم Sylgard المغلفة طبق إلى الطرافة المجهر متحد البؤر مجهزةح الأرجون ليزر (488 نانومتر الطول الموجي) والأهداف الغمر بالماء (4X، 0.13 NA؛ 20X، 0.5 NA و100X، 1.0 NA أو 60X، 0.9 NA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري لمرور الزمن المجهر: 3.5 سم إدراج Sylgard المغلفة طبق في حلقة التدفئة، نظام تثبيت superfusion وتحقيق درجة الحرارة (الشكل 2A). تأكد من أن أيا منها لا تلمس يزدرع، حافة الطبق أو طلاء Sylgard. تسخين العينة ل33-35 ° C. لتبيض SC دون مرور الزمن، درجة حرارة الغرفة هو أفضل، كما تظهر خلايا أقل ديناميكية بين الخطوات التبييض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع مراعاة الهدف الهواء 4X نمط تعصيب من العضلات القص المثلثية والمثلثية تجد الفرقة endplate القص. التبديل إلى الهدف غمس المخروطية 20X والبدء في البحث عن المناطق السطحية داخل الفرقة endplate (الأضلاع المغطي المناطق المرشحة جيدة). تغيير الهدف إلى هدف غمس-100X مخروط أو 60X للاطمئنان على NMJs الفردية. هو مثالي NMJ التي تغطيها عدة الطوائف المنبوذة ويقع superfic جداially (الشكل 2B). إذا كنت تنفذ الوقت الفاصل بين التصوير بعد التبييض، وتحديد ما يصل إلى 3 NMJs التي هي قريبة نسبيا معا لزيادة الغلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة مبائر من قبل اللجان الدائمة NMJ الصورة تبيض الفردية (الشكل 2B). (للتصوير كامل القرار، على سبيل المثال على مجهر FV1000 أوليمبوس، استخدم 100X، الهدف NA 1.0 و التكبير 2.5، مما يؤدي إلى نايكست محدودة عينة من 0.1 ~ ميكرومتر لكل بكسل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;بارك&quot; ليزر 488 نانومتر شعاع مركزيا على نواة لاستخدام القوة القصوى SC لمدة 5 ثوان (بدلا من نمط المسح كفاءة في منطقة صغيرة من الفائدة يمكن استخدامها، مثل وظيفة &quot;المسح الضوئي تورنادو&quot; على مجهر أوليمبوس؛ كما نستخدم المجهر متحد البؤر، ويركز الليزر في الصورة طائرات، المتقارن، وبالتالي، في 488 نانومتر مع هدف NA 1.0، &lt;0.5 ميكرومتر في القطر). على الخلية والقاضي تبيض نتيجة إعادة التركيز. إذا كرر الخطوة الضرورية تبيض مرة أخرى حتى مستويات GFP هي الحدد لشبه خلفية المستويات. الحصول على صورة بعد التبييض (الشكل 2C). من الأهمية بمكان التأكد من أن المنطقة هي خارج المبيض أي تداخل بين خليتين - إذا كان هناك تداخل، وسوف تبيض في الخلية الثانية يكون واضحا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة السابقة حتى جميع ولكن يتم تبييض SC 1 (الشكل 2D-E). و&quot;غير مقصورة&quot; مشاركة SC مناسبة للفحص المجهري متحد البؤر الوقت الفاصل بين. إعادة بناء الخلايا واحد من الطرح من الصور، على سبيل المثال باستخدام برنامج فوتوشوب، واحد لتحديد SC الصرف والأراضي (الشكل 2F). تكون على علم بأن طرح اثنين السحراء يضيف ضوضاء (مثلا عن طريق استيرادها في &quot;طبقات&quot; على التوالي في فوتوشوب ثم تحديد القناة لأعلى &quot;الاختلاف&quot; في القائمة المنسدلة في أعلى علامة التبويب قنوات). يمكن هذا التحايل باستخدام &quot;تمويه داخلي&quot; وظيفة على القنوات قبل الطرح والاقتصاص من أي الخلفية التي من الواضح أنها لا تنبع منابيض الخلية. لتحسين النقيض من ذلك، يمكن أن يكون من الضروري ضبط سطوع القناتين في إطار &quot;المستويات&quot;. الصورة الناتجة من الخلية ابيض هو فرضه على الصورة الأصلية من المشبك، شبه الملونة في هوى فريدة وجعلها شفافة للون أراضي الخلية ابيض في الصورة الأصلية (من فعل هذا لجميع ابيض والأخيرة والخلايا غير مقصورة الصورة هو مبين في الشكل نتائج 2F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: قم بتشغيل مبائر الوقت الفاصل بين المجهري بعد التبييض لكن كل واحد الطوائف المنبوذة. تأخذ صورة في فترات زمنية محددة (على سبيل المثال كل 5 دقائق إلى 10). استخدام الليزر والطاقة أقل قدر ممكن. ولا يمكن تصوير ما يصل إلى 3 NMJs في الدورة نفسها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عمل خريطة للNMJs الوقت انقضى من خلال اتخاذ صورة في 100X بدون تكبير، ثم صور للمنطقة باستخدام 20X والأهداف 4X (الشكل 2G-I). هناك حاجة لذلك &quot;خارطة&quot; للعثور على NMJs بعد المناعية في عضلة الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لصورةتجهيز وتحويل الصور الفردية إلى أقصى كثافة التوقعات وحفظ بتنسيق TIFF. الجمع بين جميع Z-المتوقعة الوقت نقطة في كومة ومحاذاة في XY، على سبيل المثال باستخدام &quot;stackreg&quot; المساعد 10 في فيجي (حزمة استنادا إلى مصدر يماغيج البرمجيات مفتوحة؛ المعاهد الوطنية للصحة). </li></ol> 3. تثبيت والمناعية (الشكل 3) التوقيت: بين عشية وضحاها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل يزدرع في أنبوب مل رد فعل 50-التي تحتوي على ما لا يقل عن 15 مل PFA 4٪ عن طريق إزالة بعناية الدبابيس. بعد إصلاح الجدار الأمامي الصدري الذي يحتوي على العضلات القص المثلثية لل1 ساعة على الجليد. شطف الأنسجة الثابتة مع جليكاين M 0.1 في PBS (لإرواء مثبت المتبقية، وبالتالي تقليل الخلفية) لا يقل عن 10 دقيقة. ويمكن تخزين العينات في هذه المرحلة ومعالجتها في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل يزدرع الثابتة إلى 10 سم Sylgard المغلفة النسيج طبق ثقافة مليئة PBS M 0.01. قطع على شكل شبه منحرف واحد SIدي موازية لعظمة القص والآخر من خلال التحولات العظام إلى الغضروف - وهذا يحتوي على العضلات المثلثية على سطحه. إزالة الأضلاع أقل مع قطع (أي عبر القصية) الأفقي بحيث يمكن في نهاية الذيلية من العضلات المثلثية الوصول بحرية (الشكل 3A-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضافة الى وجود إبرة تحت الجلد ودبوس في الجزء العلوي من شبه منحرف (الشكل 3E). استخدام إبرة تحت الجلد تعلق على حقنة 1 مل وملقط لإزالة العضلات المثلثية على سطح من خلال عقد بلطف على زاوية الذيلية من العضلات وباستخدام إبرة ومشرط الصغيرة. تأكد من أن يتم إجراء تخفيضات موازية لطائرة من الجدار الصدري. مرة واحدة يتم تحرير جزء من عضلة الذيلية، إدراج آخر إبرة تحت الجلد ودبوس تحت العضلات من خلال جدار الصدر - وهذا يشل إعداد ويسمح بممارسة سحب لطيف على العضلات باستخدام ملقط (الشكل 3F). كما كنت قطع TISS الضامالإدراج UE، &quot;قشر&quot; بعيدا العضلات من الصدر. قطع المرفقات الذيلية مشاركة مع مقص الربيع. إزالة بقايا سفينة الدهون والدم باستخدام ملقط. يجب الحرص على عدم التمزق بعيدا الأعصاب ملاحظة: استخدام مجموعات منفصلة من الأدوات والأطباق للعمل مع الأنسجة الحية والثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء المناعية (باستخدام بروتوكول قياسي) عن طريق نقل عينات الأنسجة إلى حل للحظر 1 ساعة على شاكر في درجة حرارة الغرفة. حجم أصغر ممكن لتلطيخ هو 200 ميكرولتر باستخدام لوحة 96-أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الأولية مخففة تطبيق في حل حجب، 200 ميكرولتر لكل بئر، بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في 0.01 M 3 مرات لمدة 10 دقيقة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1-2 ساعة مناسبة في درجة حرارة الغرفة مخففة في عرقلة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل في 0.01 M 3 مرات لمدة 10 دقيقة PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل في مكافحة يتلاشى المتوسطة (مثل Vectashield) وساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشريحة مكان على لوحة معدنية المغناطيسي، المغناطيس مكان على رأسمن العينة للشد لبضع ساعات أو بين عشية وضحاها في C. ° 4 ختم بطلاء الأظافر. </li></ol>

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة تبيض SC المعروضة هنا هي بسيطة وسريعة وتنوعا: (ط) إنه يمكن الكشف عن واحدة SC مورفولوجيا وديناميات بواسطة المجهر متحد البؤر بناء على التحوير واحدة - وهي ميزة كبيرة عندما الجمع بين نهج سبيل المثال مع نماذج المرض التي تتطلب الأليلات إضافية . (الثاني) والطريقة السر?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة (مثال) </td><td> كتالوج رقم </td><td> التعليقات (اختياري) </td></tr><tr><td> 70٪ (المجلد / المجلد) الإيثانول الحل </td><td> روث </td><td> T913.1 </td><td> في زجاجة رذاذ </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene، ابوت </td><td></td><td> ويمكن استخدام أي مخدر أخرى يوافق قاتلة للتخدير </td></tr><tr><td> الفئران المعدلة وراثيا (حزب العمال التقدمي-GFP) </td><td></td><td></td><td> التي يمكن الحصول عليها من المصادر المشار اليها </td></tr><tr><td> المجهر تشريح مع الإضاءة الخفيفة الباردة </td><td> OLYMPUS SZ51 </td><td></td><td> مجهزة مع 1500 شوت LCD KL </td></tr><tr><td> ملقط #2 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> ملقط # 5 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> مقص، والطبية الكبيرة </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> مقص، ربيع الزاوية الصغيرة </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> في خط سخان </td><td> وارنر الصكوك </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> التدفئة الدائري ل3.5 سم الأطباق </td><td> وارنر الصكوك </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 2 التحكم في درجة الحرارة قناة النظام </td><td> وارنر الصكوك </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusion مضخة نظام </td><td></td><td></td><td> مبنية خصيصا </td></tr><tr><td> 15-سم طبق زراعة الأنسجة </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> مليئة الجليد والتي تغطيها لوحة معدنية </td></tr><tr><td> 10-سم طبق زراعة الأنسجة </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> مع حل رينغر الاوكسيجين في </td></tr><tr><td> 3.5 سم طبق زراعة الأنسجة </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> مليئة البوليمر Sylgard </td></tr><tr><td> Sylgard البوليمر </td><td> داو كورنينج </td><td> Sylgard إلاستومر سيليكون 184 كيت </td><td></td></tr><tr><td> مبائر المجهر </td><td> OLYMPUS </td><td> FV1000 </td><td> مع الأرجون ليزر </td></tr><tr><td> 50-مل أنبوب رد فعل </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4 PFA٪ في برنامج تلفزيوني </td><td> سيجما </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> قنية 0.5 مم × 25 مم </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> حقنة 1 مل </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> synaptophysin العصبية الأجسام المضادة </td><td> إينفيتروجن </td><td> 18-0130 </td><td> أرنب </td></tr><tr><td> الأجسام المضادة الثانوية </td><td> إينفيتروجن </td><td> A-11012 </td><td> الكسا 594 </td></tr><tr><td> 24 لوحة جيدا </td><td> Sarstedt </td><td> 83،1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01 متر PBS </td><td> سيجما </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0.1 M جليكاين في برنامج تلفزيوني </td><td> روث </td><td> 3790،1 </td><td></td></tr><tr><td> coverslips </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> الشرائح </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> ناقلات مختبرات </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> دبابيس minutien × 10 </td><td> أدوات العلوم الجميلة </td><td> 26002-20 </td><td> لتقصير مم 4 &lt; </td></tr><tr><td> α-بنغاروتوكسين بالإضافة إلى 594 اليكسا </td><td> إينفيتروجن (مجسات الجزيئية) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> منع الحل </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2٪ تريتون-X100 </td><td> روث </td><td> 3051،3 </td><td></td></tr><tr><td> 10٪ مصل الماعز العادي </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1٪ الأبقار مصل الزلال </td><td> سيجما </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> قارع الأجراس فقاعات مع 95٪ O 2/5٪ CO 2 </td></tr><tr><td> 125 مم كلوريد الصوديوم </td><td> سيجما </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 ملم بوكل </td><td> سيجما </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25 مم ناه 2 ص 4 </td><td> سيجما </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 مم 3 NaHCO </td><td> سيجما </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 مم CaCl 2 </td><td> سيجما </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ملم MgCl 2 </td><td> سيجما </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 ملي الجلوكوز </td><td> سيجما </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الجدول 1. الكواشف محددة والمعدات. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

متتابعة الصورة تبيض يوفر طريقة غير الغازية لتسمية اللجان الدائمة الفردية في NMJ. وNMJ هي أكبر المشبك الجهاز العصبي في الثدييات وكانت بمثابة توجيه نموذج لدراسة بنية ووظيفة متشابك. في NMJs محطات الماوس محور عصبي السيارات على شكل مواقع الاتصال المملح مع مثل ألياف العضلات. ومغلفة محور عصبي السيارات ومحطة من قبل اللجان الدائمة. على مدى العقود الماضية، وقد ولدت الفئران المعدلة وراثيا لتصور العديد من الخلايا العصبية الحركية والطوائف المنبوذة، على سبيل المثال Thy1-1 و XFP حزب العمال التقدمي-GFP الفئران 2، على التوالي. على طول محاور عصبية المحرك، يتم ترتيب الطوائف المنبوذة في محور عصبي myelinating السلاميات غير متداخلة، مفصولة العقد من رانفييه، لتمكين قفزي نشر إمكانات العمل. في المقابل، محطة الطوائف المنبوذة في المشبك هي خلايا الدبقية المتخصصة، والتي رصد وتعزيز العصبي، وهضم الحطام محاور عصبية دليل تجديد. وتغطي بإحكام NMJs بنسبة تصل إلى نصف دزينة غير myelinating الطوائف المنبوذة محطة - هذه، ولكن، لا يمكن أن تحل بشكل فردي عن طريق المجهر الضوئي، كما هي على اتصال مباشر الغشاء 3. توجد عدة أساليب لتصور فردي الطوائف المنبوذة المحطة الطرفية. أي من هذه لا تشوبه شائبة، وإن كان. على سبيل المثال، صبغ شغل، حيث مخوزق الخلايا واحدة ذات صبغة مسرى مكروي مملوءة، يتطلب تدمير خلية العلامات قبل ملء ثانية واحدة. هذا غير متوافق مع مرور الزمن التسجيلات اللاحقة 3. وقد تحقق متعددة الأطياف &quot;Brainbow&quot; توسيم الطوائف المنبوذة باستخدام التعبير اندماجي من البروتينات الفلورية 4. ومع ذلك، هذه التقنية يتطلب الجمع بين عدة جينات منقولة وتحد من نمط التعبير من المروجين المستخدمة. في المستقبل، قد التعبير عن البروتينات &quot;للتحويل الصور&quot; في الطوائف المنبوذة تكون بعد آخر 5 بديلة. هنا نقدم الصورة تبيض متتابعة، حيث يتم تبييض الخلايا واحدة، وصورتهم التي حصلت عليها الطرح. نعتقدأن هذا النهج - نظرا لسهولة وبراعة - يمثل إضافة دائم لوحة تكنولوجيا الأعصاب، وخاصة أنها يمكن أن تستخدم في الجسم الحي ونقل إلى أنواع الخلايا الأخرى، والمواقع التشريحية أو الأنواع 6. في البروتوكول التالية، ونحن من التفصيل تطبيق متتابعة تبيض واللاحقة الوقت الفاصل بين المجهري متحد البؤر لمحطة الطوائف المنبوذة في المثلثية إإكسبلنتس العضلات القص. وقد ثبت هذا رقيقة، وتشريح سطحي بسهولة العصبي العضلي إعداد دراسات مفيدة ل7،8 التنمية NMJ، علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض 9. وأخيرا، فإننا شرح كيفية إعداد العضلات القص بعد تثبيت المثلثية لأداء عالية الدقة ترتبط مبائر التصوير، أو الامتحانات التركيبية المناعية.

ويرد مثال على يزدرع القص المثلثية جاهزة للطبق التصوير في الشكل 1G. هذا هو مناسبة خاصة يزدرع لفيفو السابقين التصوير NMJs والعضلات المثلثة يتكون فقط من عدد قليل من طبقات من ألياف العضلات. هذا يسمح بالحصول على صور عالية الدقة من إإكسبلنتس المستمدة من خطوط الم...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

تصور الخلايا الفردية في أنسجة كثيفة معبأة، مثل خلايا شوان محطة (SCS) عند التقاطعات العصبي العضلي (NMJs)، يمثل تحديا. &quot;متتابع الصورة تبيض&quot; يسمح ترسيم الطوائف المنبوذة محطة واحدة، على سبيل المثال في يزدرع المثلثية العضلات القص، مريحة للأعصاب العضلات إعداد، حيث يمكن الجمع بين متتابعة تبيض مع الوقت الفاصل بين التصوير و<em&gt; ما بعد خاصة</em&gt; immunostainings.

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K Views.  Technische Universität München. تصور الخلايا الفردية في أنسجة كثيفة معبأة، مثل خلايا شوان محطة (SCS) عند التقاطعات العصبي العضلي (NMJs)، يمثل تحديا. "متتابع الصورة تبيض" يسمح ترسيم الطوائف المنبوذة محطة واحدة، على سبيل المثال في يزدرع المثلثية العضلات القص، مريحة للأعصاب العضلات إعداد، حيث ي?...

Video: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

في نقل فيفو جين لخلايا شوان في العصب القوارض وركي من Electroporation لل

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

تشريح والكيمياء المناعية من الساق الكبار Drosophila للكشف عن التغيرات في تقاطع العصبية والعضلية لخلية عصبية محركية محددة

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

تسجيل انتقالات الكالسيوم في الوصلة العصبية العضلية للفأر بدقة زمنية عالية باستخدام المجهر البؤري

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

تصور الخصائص المورفولوجية للوصلة العصبية العضلية في عضلة الجرذ الإنسية المعدية

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...