يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم سلامة ومرونة التقاطع العصبي العضلي في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. هذه التقنية هي تسمية خلايا شوان المختبر قبل وبعد في وقت واحد على أقسام العضلات المفردة. بعد القتل الرحيم للفئران الذكور البالغة ، ضع الفئران في غطاء المحرك وافتح التجويف الصدري للوصول إلى القلب باستخدام المقص والملقط.
أدخل قسطرة وريدية من البطين القلبي الأيسر باتجاه الشريان الأورطي واقطع أوراكل الأيمن. بعد ذلك ، ابدأ التروية ب 100 ملليلتر من محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪ حتى يصبح الدم الخارج من أوراكل الأيمن واضحا. ثم استمر في التعمق مع 250 إلى 300 ملليلتر من 4٪ بارافورمالديهايد في 0.1 مخزن مؤقت للفوسفات المولي أو PB pH 7.4 لمدة 10 دقائق.
بعد التروية ، قم بإزالة جلد الطرف الخلفي الثنائي باستخدام شفرة جراحية وفضح العصب الوركي الثنائي وعضلة المعدة الإنسية. تشريح عضلة المعدة الإنسية الثنائية بعناية من الطرف الخلفي باستخدام شفرة وتثبيت العضلة بأكملها في 10 ملليلتر من 4٪ بارافورمالديهايد. بعد ساعتين ، قم بإزالة العضلات من المحلول وقم بحمايتها بالتبريد في 10 ملليلتر من 25٪ من السكروز في 0.1 PB مولاري لمدة يوم واحد عند أربع درجات مئوية.
بمجرد غمر الأنسجة العضلية في محلول السكروز ، قم بتثبيته على مرحلة التجميد لنظام microtome المنزلق باستخدام وسط مقطع مجمد. قم بتقطيع العضلة أفقيا على طول المحور الطويل للعضلة بسماكة 80 ميكرون. باستخدام فرشاة ، ضع سبعة أقسام تبريد لكل بئر بطريقة منظمة في لوحة زراعة ستة آبار مع 10 ملليلتر من 0.1 PB المولي. لتلطيخ الفلورسنت ، احتضن أربعة أقسام لكل بئر مع 1.5 ملليلتر من 0.1 PB المولي الذي يحتوي على 75 ميكرولتر من 10٪ Triton X 100 و 45 ميكرولتر من مصل الحمير العادي على شاكر مداري عند 20 دورة في الدقيقة.
بعد 30 دقيقة ، انقل الأقسام إلى 1.5 ملليلتر من محلول مختلط من الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على خيوط أرنب مضادة للأعصاب 200 ، ونقل أستيل كولين مضاد للحويصلات في 0.1 مللي بايت ، في مصل الحمير الطبيعي بنسبة 1٪ ، و 0.5٪ Triton X 100 واحتضان بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في 0.1 PB مولية في الاهتزاز المداري عند 20 دورة في الدقيقة. بعد الغسيل الأخير ، احتضن القسم في محلول مختلط من الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الحمار المضاد للأرانب AF 488 والحمار المضاد للماعز AF 546 ، بالإضافة إلى المؤشرات الحيوية لتوكسين ألفا بونغارو AF 647 و phalloidin 350 التي تحتوي على 0.1 M PB تحتوي على 1٪ مصل الحمير العادي و 0.5 Triton x 100 لمدة ساعة واحدة ، حمايتهم من الضوء.
بعد الحضانة ، اغسل الأقسام في PB وقم بتركيبها على شريحة مجهرية. ضع زجاج الغطاء على القسم باستخدام 50٪ من الجلسرين في الماء المقطر. راقب العينة وصورها باستخدام نظام تصوير بؤري مخدع مجهز بعدسة ذاتية 20 × مع فتحة رقمية 0.75 وعدسة 40 × بفتحة عددية تبلغ 0.95.
بالنسبة للتصوير الفلوري المتعدد ، قم بتعيين الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لكل علامة حيوية كما هو موضح في مخطوطة النص. اضبط دقة التقاط الصور على 640 × 640 بكسل. بعد ذلك ، قم بتعيين المستوى البؤري للبداية والنهاية.
اضبط حجم الخطوة على ميكرون واحد أو ميكرون. ثم اختر نمط العمق والتقاط الصور وسلسلة Z. بالنسبة لصور التكبير الأقل عند 20 X، التقط صور مكدسة بحجم 40 Z بحجم خطوتين ميكرون باستخدام ثقب 105 ميكرون.
اختر وضع الإسقاط أو الطبوغرافيا وإسقاط الكثافة على محور Z لدمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد. للحصول على صور تكبير أعلى بمعدل 40 X، يمكنك التقاط صور مكدسة بحجم 80 Z بحجم خطوة ميكرون واحد مع ضبط التكبير/التصغير على اثنين وثقب 105 ميكرون. دمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد.
أعد بناء الصور في النمط ثلاثي الأبعاد باستخدام نظام معالجة الصور. يتم توضيح العلاقة المكانية التمثيلية لعضلة المعدة الإنسية مع الخيوط العصبية 200 الألياف العصبية الإيجابية ، وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي الإيجابي قبل المشبكي ، ومستقبلات الأسيتيل كولين الإيجابية لسموم ألفا بونغارو الإيجابية بعد المشبكي ، وخلايا شوان الإيجابية حول المشبكي S100 ، والألياف العضلية الإيجابية الفيلويدين ، والنوى الخلوية المسماة DAPI هنا. تم تشغيل الخيوط العصبية 200 من الألياف العصبية الإيجابية في حزمة.
أعطت هذه الألياف العصبية فروعا لمحطات الأسيتيل كولين الحويصلية الناقلة الإيجابية قبل المشبكي ، والتي شكلت علاقة مرآة مع مستقبلات الأستيل كولين الإيجابية لسم ألفا بونغارو بعد المشبكي. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن خلايا شوان الإيجابية حول المشبكية S100 حول الخيوط العصبية 200 الألياف العصبية الإيجابية بالقرب من المحطات الطرفية قبل المشبكي. تم عرض الارتباط المكاني بشكل أكبر في نمط ثلاثي الأبعاد يوضح الخصائص المورفولوجية التفصيلية للتقاطع العصبي العضلي من وجهات نظر مختلفة.
من أجل مراقبة المزيد من التصوير في الأقسام العضلية ، من الأهمية بمكان تقطيع العضلات أفقيا على طول المحور الطويل بسماكة 80 ميكرون.
