私たちは、優れた技術支援にマヌエラBudak、Ljiljana MarinkoviとクリスティーナWullimannに感謝したいと思います。我々は、PLP-GFPマウスを提供するためのW·マックリンに感謝します。アレクサンダー·フォン·フンボルト財団、国家助成機関（ &quot;エリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung&quot;により、TMはドイツ学術振興（Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG）による高等研究所（ミュンヘン工科大学）によってサポートされています）ERA-Netのニューロン &quot;iPSoALS&quot;と &quot;2光子イメージング&quot;の枠インチTMとMBが統合蛋白質科学研究センター（ミュンヘン）によってサポートされています。 PMは、ミュンヘン工科大学（TUM-GS）の大学院によってサポートされていました。

1。オトガイ三角胸骨外植片（ 図1） タイミング：15分。 <ol><li>鉗子の2ペア、はさみの1ペア、春のはさみの1ペア、1組織培養皿（10センチ）：手術器具を準備します。 （15分間以上）事前バブリング冷却（4℃）を5％CO 2/95％O 2でリンゲル液。氷で15cmの組織培養皿を記入し、金属板とそれをカバーしています。解剖顕微鏡を準備し、解剖時に外植片を冷却するために、解剖用スコープの下に氷で15 cmの皿を置きます。 </li><li>致死量のイソフルラン過剰摂取（または犠牲の他の承認された方法）によって、マウスを麻酔。外植片の毛皮の汚染を防止するために、70％エタノールでマウスを吹き付けます。 SCは漂白のために、我々は軸索の同時可視化のためTHY1-OFP3またはTHY1-Membow13には交雑可能PLP-GFPマウスを使用していました。 </li><li>大きなはさみのペアを使用して、の正中切開を作る胸骨と肋骨の下縁に平行な2つの切開の上の皮膚。 </li><li>大きなはさみのペアを使用すると、皮膚を除去腹壁を開き、脊柱に戻ってすべての道を胸郭に切開が平行する。その後、胸骨の筋肉の挿入に近い切開を行うことで、胸筋を切っ解剖。 </li><li>ただ剣状軟骨下オープン横隔膜をカットし、その沿岸に沿って挿入ダイアフラムをオフに解剖する。 </li><li>鉗子のセットと剣状突起によって胸郭を保持し、できるだけ近い彼らの挿入を可能な限り、脊柱から肋骨を切断開始。左と右のカットは胸骨柄に向かって心臓より収束する必要があります。主要な血管（特に鎖骨下静脈）切断避けるようにしてください。優れた視認性を鉗子で剣状突起上に保持しながら優しく準備を持ち上げることによって達成されます。 </li><li>ちょうど胸骨柄下に横カットを行うそして冷却した5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液と10cmの皿に植片を移す。氷で満たされた15cmの組織培養皿を覆う金属板の上に10cmの皿を置きます。すべてのさらなるステップは、解剖顕微鏡下で行われるべきである。 </li><li>小さ ​​な春のはさみを使用すると、胸腺、胸膜、横隔膜（内側）と胸筋（; 図1B-Dの外側）の残骸を削除。 </li><li> 3.5 cmのシャーレに植に合わせて、胸骨に挿入しないで全てのリブをオフに解剖する。これは、最高の小さな春のはさみを使用して、肋骨（ 図1E）の間に組織を切断する実行されます。 </li><li> minutienピンを使用して、シルガードコーティングされた3.5 cmの組織培養皿（; 図1G &lt;4ミリメートルに短縮）にオトガイ三角胸骨神経筋外植片をピン。 2つのピンは、胸骨の軟骨（白）部分を介して行く必要があります。両方の目の左側と右側の肋骨を介して、少なくとも2つのピンを挿入しますeの外植片は、柔らかい軟骨部分を狙ってと下の肋骨を回避またはオトガイ三角筋の近隣にあります。以上のピンが使用されている、より良い（我々は一般的に8月10日を使用します）。あなたが準備を突き止めるように、わずかに伸ばした位置に筋肉を固定し、リブがやや広がっていることを確認してください。 </li><li> オプション：Alexa色素（5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液では0.8μg/ mlの濃度）に結合ブンガロトキシンを追加することにより、アセチルコリン受容体を含有するシナプス部位を視覚化します。室温で15〜20分間シルガードコーティングされた皿の中で固定された外植片を培養するには、次いで、5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液で数回洗浄する。 </li></ol> 2。漂白SCとオプションタイムラプス顕微鏡（ 図2） タイミング：30から45分+オプション1 - 経過時間は5時間。 <ol><li>共焦点顕微鏡装備ウィットへの転送3.5-CMシルガードコーティングされた料理をhのアルゴンレーザー（488nmの波長）と水浸対物レンズ（4倍、0.13 NA; 20倍、0.5のNAと100倍、1.0 NAまたは60倍、0.9 NA）。 </li><li> タイムラプス顕微鏡用オプション ：インサート加熱リングに3.5 cmのシルガードコーティングされた皿、灌流システムおよび温度プローブ（ 図2A）をインストールします 。それらのどれもが植、皿またはシルガードコーティングのリムに触れないことを確認します。 ℃、33から35に試料を加熱細胞は漂白ステップ間の少ないダイナミクスを示すようにSCは時間経過せずに漂白するため、室温では、優れています。 </li><li> 4倍の空気を目的とオトガイ三角胸骨筋の神経支配のパターンを観察し、オトガイ三角胸骨終板帯を見つける。 20Xディッピングコーン客観的に切り替えて、終板帯（領域を覆うリブは良い候補である）内の表在領域を探し始める。個々NMJsをチェックするために100倍以上60倍ディッピングコーン目標に目的を変更します。理想的には、いくつかのSCで覆われていると非常にsuperfic位置していますNMJですially（ 図2B）。あなたが漂白後タイムラプスイメージングを実行する場合は、相対的に収量を増やすために一緒に閉じている3 NMJsまで選択。 </li><li>光退色、個々のSC（ 図2B）の前に、NMJの共焦点画像を取得する。 （フル分解能イメージング、オリンパスFV1000顕微鏡上などでは、100倍、1.0 NA対物およびピクセルあたり〜0.1μmのナイキスト限られたサンプリングをもたらす2.5ズームを使用しています。） </li><li> &quot;パーク&quot;集中5秒（あるいはそのようなオリンパスの顕微鏡の &quot;竜巻スキャン&quot;機能として使用することができます興味のある小さな領域での効率的なスキャンパターンのために最大限の電力を使用して、SCの核に488 nmのレーザービーム;我々は共焦点顕微鏡を使用するように、レーザーは1.0のNAを目的とし、488nmで、故に画像共役面に焦点を当てたとされる、直径&lt;0.5μm）である。セルと裁判官漂白結果に再フォーカス。 GFPのレベルが削減されるまで、必要に応じて繰り返し、再びステップを漂白する場合近いバックグラウンドレベルにd。 （ 図2C）漂白後の画像を取得する。それは漂白地域は、2つのセルのオーバラップの外側にあることを確認することが重要である - オーバーラップがある場合、2番目のセルに漂白することは明らかであろう。 </li><li>すべてが1つのSCが（ 図2D-E）が漂白されるまで、上記の手順を繰り返します。最後の &quot;無漂白&quot; SCは、共焦点タイムラプス顕微鏡観察に適しています。画像の減算により単一細胞を再構築する、 例えば 、単一のSC形態および領土（ 図2F）を記述するために、Photoshopソフトウェアを使用しています。 2メイジを減算すると、ノイズ（Photoshopでの連続した&quot;層&quot;でインポートしてから、チャンネルタブの上部にあるドロップダウンメニューで&quot; 差 &quot;を最チャンネルを設定することによって、 例えば ）が追加されますので注意してください。これは減算前のチャンネルで&quot; 輪郭以外をぼかす &quot;機能を使用して、明らかに由来しない任意のバックグラウンドを離れてトリミングすることによって回避できます漂白された細胞。コントラストを最適化するためには、 &quot; レベル &quot;ウィンドウには2つのチャンネルの明るさを調整する必要がある場合があります。漂白された細胞の結果のイメージは、シナプスの元の画像に重畳ユニーク色相の擬似色とすべての漂白、最後にこれをやってから元の画像（漂白におけるセルの領域を着色するために透明になります、無漂白の細胞図2F結果に示された画像）。 </li><li> オプション：すべてが1つのSCを漂白した後、共焦点タイムラプス顕微鏡スタート。一定の間隔（例えば、5〜10分）で画像を取る。できるだけ少ないレーザーパワーとして使用します。最大3 NMJsは、同じセッションで撮像することができる。 </li><li>その後、ズームなしで100倍で20倍、4倍の目標を（ 図2G-I）を用いて地域の画像を画像を撮影して、時間経過NMJsの地図を作る。この &quot;地図&quot;は、固定筋の免疫組織化学に続くNMJsを見つけるために必要とされる。 </li><li>イメージ用処理、最大強度の予測に個々の画像を変換してTIFF形式で保存します。スタックにすべてのz投影された時間のポイントを組み合わせるとxyに合わせ、 例えばフィジーの&quot;stackreg&quot;プラグイン10（オープンソースソフトウェアImageJのに基づいて、パッケージ、国立衛生研究所）を用いて行った。 </li></ol> 3。固定および免疫組織化学（ 図3） タイミング：宿泊。 <ol><li>慎重にピンを除去することにより、少なくとも15ミリリットル4％PFAを含む50mlの反応管に外植片を転送します。氷上で1時間オトガイ三角胸骨筋を含む前胸壁をポストフィックス。少なくとも10分間PBS中の0.1 Mグリシン（残留固定液を急冷し、それ故にバックグラウンドを減らすため）で固定した組織を洗浄します。サンプルはこの時点で保存され、後で処理することができます。 </li><li> 0.01MのPBSで満たされた10cmのシルガードコート組織培養皿に固定された外植片を転送します。 1 Siと台形形状を切り出す胸骨、骨と軟骨の遷移を介して他のデパラレル - これは、その表面上にオトガイ三角筋を含んでいます。水平方向（ すなわちトランス胸骨）オトガイ三角筋の尾側端は自由にアクセスできるようにカットして下部肋骨を取り外します（ 図3A-D）。 </li><li>台形の上部（ 図3E）にピンとして皮下注射針を挿入します。優しく筋肉の尾コーナーに保持し、マイクロメスと針を用いて表面にオトガイ三角筋を削除するには、1mlシリンジと鉗子に添付皮下注射針を使用します。カットは胸壁の面に平行に作られていることを確認してください。筋肉の尾の部分がリリースされたら、胸壁を通して筋肉以下のピンのような別の皮下注射針を挿入します-これは準備を固定し、鉗子（ 図3F）を使用して筋肉に優しいプルを発揮することができます。あなたは、コネTISSを切っているように、UEの挿入、 &quot;ピール&quot;離れて胸部の筋肉。春のはさみで最後尾添付ファイルをカットします。ピンセットを用いて、脂肪や血管の残骸を削除。神経を離れてリッピングしないように注意してください注：ライブと固定された組織で作業するためのツールや食器のセットを別々に使用してください。 </li><li>室温でシェーカーで1時間ブロッキング溶液中に組織サンプルを転送することによって、免疫組織化学（標準のプロトコルを使用して）を起動します。染色のための可能な限り最小の容積は、96ウェルプレートを用いて200μlです。 </li><li> 4℃で一晩ブロッキング溶液を1ウェルあたり200μlの、°シェーカー上でCで希釈した一次抗体を適用します。 </li><li> 0.01MのPBS中で10分間、3回洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液で希釈し、室温で1〜2時間に適した二次抗体を適用します。 </li><li> 0.01MのPBS中で10分間、3回洗浄します。 </li><li>退色防止媒体（ 例えば Vectashield）とカバースリップでマウントします。 </li><li>磁性金属板の上に置いてスライド上に場所の磁石4℃で数時間または一晩のために平らにするために、サンプルのマニキュアでシール。 </li></ol>

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示され、SC漂白方法は、簡単で高速かつ汎用性があります：（i）はそれは、単一の導入遺伝子をもとに共焦点顕微鏡によって、単一のSC形態とダイナミクスを明らかにすることができます-追加の対立を必要とする疾患モデルとアプローチなどを組み合わせたときに重要な利点である。解剖から固定には半日で行うことができるように（ii）の方法は、迅速である。それ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社（例） </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> 70％（vol / vol）のエタノール溶液</td><td>ロート</td><td> T913.1 </td><td>スプレーボトルで</td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td> Forene、アボット</td><td></td><td>他の承認された麻酔薬を致死量の麻酔に使用することができます</td></tr><tr><td>トランスジェニックマウス（PLP-GFP） </td><td></td><td></td><td>引用した情報源から得られる</td></tr><tr><td>冷光照明を用いた解剖顕微鏡</td><td>オリンパスSZ51 </td><td></td><td> Schott社KL 1500液晶搭載</td></tr><tr><td>鉗子＃2 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11233から20 </td><td></td></tr><tr><td>鉗子＃5 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11295から00 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ、大規模な医療</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14108から09 </td><td></td></tr><tr><td>はさみ、小さな角度の春</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15033から09 </td><td></td></tr><tr><td>インラインヒーター</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 cmの皿のために加熱リング</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から0110のDH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 2チャネルの温度制御システム</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td>灌流ポンプシステム</td><td></td><td></td><td>特注の</td></tr><tr><td> 15cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1803.003 </td><td>氷で満たされて、金属板で覆われて</td></tr><tr><td> 10cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1802.003 </td><td>酸素化リンゲル液と</td></tr><tr><td> 3.5 cmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1800.003 </td><td>シルガードポリマーを充填</td></tr><tr><td>シルガードポリマー</td><td>ダウコーニング</td><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV1000 </td><td>アルゴンレーザーと</td></tr><tr><td> 50mlの反応管</td><td>ザルスタット</td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS中4％PFA </td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>カニューレ0.5ミリメートルX 25ミリメートル</td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td>注射器1ミリリットル</td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td>シナプトフィジン抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> 18から0130 </td><td>ウサギ</td></tr><tr><td>二次抗体</td><td>インビトロジェン</td><td> - 11012 </td><td>アレクサ594 </td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01MのPBS </td><td>シグマ</td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS中の0.1 Mグリシン</td><td>ロート</td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td>ベクトルラボ</td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutienピン×10 </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から20 </td><td> &lt;4 mmに短縮</td></tr><tr><td> α-ブンガロトキシンアレクサ594に結合された</td><td> Invitrogen社（Molecular Probes社） </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ブロッキング溶液 </td></tr><tr><td> 0。01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2％トリトン-X100 </td><td>ロート</td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10％正常ヤギ血清</td><td>アブカム</td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1％ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> リンガー 95％O 2/5％CO 2でバブリング</td></tr><tr><td> 125 mMのNaCl </td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mMのKClを</td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25mMののNaH 2 PO 4 </td><td>シグマ</td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 MMのNaHCO 3 </td><td>シグマ</td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2mMのCaCl 2 </td><td>シグマ</td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> 1mMのMgCl 2 </td><td>シグマ</td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20mMグルコース</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1に特異的な試薬や機器。 </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

光退色シーケンシャルNMJで個々のSCにラベルを非侵襲的な方法を提供します。 NMJは、哺乳動物の中枢神経系の最大のシナプスで、シナプスの構造と機能を研究するためのモデルを導く務めている。マウスNMJsモーター軸索末端の筋肉の繊維とプレッツェル状の接触部位を形成する。モーター軸索とその端子は、SCSによって覆われている。過去数十年にわたって、いくつかのトランスジェニックマウスは、それぞれTHY1-XFP 1、PLP-GFPマウス2例えば、運動ニューロンおよびSCを可視化するために生成されています。 運動軸索に沿って、軸索のミエリンSCは跳躍活動電位の伝播を可能にするために、ランヴィエ絞輪で区切られた、非重複節間に配置されている。これとは対照的に、シナプスの端末SCは監視と神経伝達を促進し、破片やガイド再生軸索を消化する特殊なグリア細胞である。 NMJsはしっかり半ダース非myelまでで覆われているターミナルSCをinating -彼らが直接膜接触3にあるように、これらは、しかし、個々に、光学顕微鏡では解決できません。 いくつかのアプローチは、個別の端末SCを可視化するために存在しています。これらのどれとはいえ、完璧なありません。例えば、単一の細胞が色素充填微小電極で突き刺さアール染料充填は、2つ目を充填する前に標識した細胞を破壊する必要があります。これにより、その後の時間経過の録音3と互換性がありません。 SCのマルチスペクトル&quot;Brainbow&quot;標識は、蛍光タンパク質の組み合わせ式4を使用することによって達成されてきた。しかし、この手法にはいくつかの導入遺伝子を組み合わせることが必要であり、使用されるプロモーターの発現パターンによって制限されます。将来的には、SCの中で&quot;光切替可能な&quot;タンパク質の発現は、さらに別の代替5かもしれない。ここでは、順次、光退色単一の細胞が漂白されている場所、および減算によって得られたそれらのイメージを提示する。我々は信じているこのアプローチという-その使いやすさと汎用性に起因する-それがインビボで使用され、他の細胞型、解剖学的部位や種6に転送することができ、特にとして、神経科学者の技術パレットに恒久加算を表しています。 オトガイ三角胸骨筋の外植片で端末のSCに、以下のプロトコルでは、我々は詳細漂白シーケンシャルおよびその後の共焦点タイムラプス顕微鏡法の適用を。これは、薄い表面的で簡単に解剖神経筋標本7,8 NMJ開発学、生理学、病理学9の研究のために有用であることが証明されました。最後に、我々はオトガイ三角胸骨筋が相関の高分解能共焦点イメージング、免疫組織化学や超微細構造検査を実行するために固定した後に準備される方法を説明します。

イメージング皿の準備オトガイ三角胸骨植片の例を図1Gに示されている。オトガイ三角筋は筋線維のいくつかの層からのみ構成されていますので、この外植片は、イメージングNMJs エクスビボのために特に適している。これは、いずれかのSC（PLP-GFPの2）および/ ​​または軸索（THY1-XFP 1）を強調するトランスジェニックマウス系統由来の外植?...

Watch this Scientific Journal Video about Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction at JoVE.com

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。 &quot;シーケンシャル光退色&quot;漂白シーケンシャルはタイムラプスイメージングと組み合わせることができますオトガイ三角胸骨筋の外植片、便利な神経筋標本において、例えば、単一のターミナルSCを、輪郭を描くことができ、<em&gt;事後</em&gt;免疫染色。

シーケンシャル神経筋接合部におけるシングルシュワン細胞の輪郭を描くのにフォトブリーチング

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

sequential-photo-bleaching-to-delineate-single-schwann-cells-at

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K ビュー.  Technische Universität München. このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。 "シーケンシャル光退色"漂白シーケンシャルはタイムラプスイメージングと組み合わせることができますオトガイ三角胸骨筋の外植片、便利な神経筋標本において、例えば、単一のターミナルSCを、輪郭を描くことができ、事...

ビデオ: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

で、アクティブなゾーンの解剖とイメージングショウジョウバエ神経筋接合部

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

神経科学

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

全マウント神経筋接合解析のための トランス対アブドミン筋 の解剖

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

の検出<em&gt;その場で</emで&gt;タンパク質 - タンパク質複合体<em&gt;ショウジョウバエ</em近接ライゲーションアッセイの使用&gt;幼虫神経筋接合部

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

エレクトロポレーションによる齧歯類坐骨神経内のシュワン細胞へのインビボ遺伝子導入で

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

神経筋接合部機能を測定

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部のシナプス電流の焦点 Macropatch 録音

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...