Nous tenons à remercier Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi et Kristina Wullimann d&#39;assistance technique excellente. Nous remercions W. Macklin pour fournir Plp-GFP souris. TM est soutenu par l&#39;Institut des hautes études (Technische Universität München), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), par la Alexander-von-Humboldt-Stiftung et par l&#39;organisme national de financement («Bundesministerium für Bildung und Forschung&quot; ) dans le cadre d&#39;ERA-NET NEURON &quot;iPSoALS» et «2-photons d&#39;imagerie». MC et MB sont pris en charge par le Center for Integrated Protein Science (Munich). PM a été soutenue par la Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).

1. Triangularis Sterni explantation (Figure 1) Timing: 15 min. <ol><li> Préparer les instruments chirurgicaux: 2 paires de pinces, 1 paire de ciseaux, 1 paire de ciseaux à ressort, 1 boîte de culture tissulaire (10 cm). Pré-bulles (minimum 15 min) refroidie (4 ° C) une solution de Ringer avec 5% de CO 2/95% O 2. Remplir 15 cm boîte de culture tissulaire avec de la glace et le couvrir avec une plaque métallique. Préparer microscope à dissection et placez le plat de 15 cm avec de la glace sous le coup de dissection afin de refroidir l&#39;explant lors de la dissection. </li><li> Lethally anesthésier la souris par une surdose d&#39;isoflurane (ou toute autre méthode approuvée du sacrifice). Vaporiser la souris avec de l&#39;éthanol à 70% pour prévenir la contamination de la fourrure de l&#39;explant. Pour le SC de blanchiment, nous avons utilisé des souris Plp-GFP, qui peuvent être croisées pour Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 pour la visualisation simultanée de l&#39;axone. </li><li> En utilisant la paire de grands ciseaux, faire une incision médiane dela peau de la poitrine et deux incisions parallèles à l&#39;arête inférieure de la cage thoracique. </li><li> En utilisant la paire de grands ciseaux, enlever la peau, ouvrir la paroi abdominale, et faire des incisions parallèles à la cage thoracique tout le chemin du retour à la colonne vertébrale. Puis hors disséquer les muscles pectoraux en faisant des incisions à proximité de l&#39;insertion du muscle au niveau du sternum. </li><li> Couper le diaphragme ouvert juste en dessous du cartilage xiphoïde et disséquer au large de la membrane le long de ses insertions costales. </li><li> De maintien de la cage thoracique par la pointe du sternum avec un ensemble de pinces, de commencer à couper les nervures de la colonne vertébrale, le plus près possible de leurs insertions. Les réductions de gauche et de droite devraient converger au-dessus du cœur vers le manubrium sternal. Essayez d&#39;éviter de couper les vaisseaux sanguins majeurs (en particulier les veines sous-clavières). Meilleure visibilité est obtenue en soulevant doucement la préparation tout en maintenant sur le processus xiphoïde avec une pince. </li><li> Faites une coupe transversale juste au-dessous du manubrium sternalet transférer l&#39;explant dans le plat de 10 cm avec 5% de CO refroidi 2/95% O 2-bulles solution de Ringer. Placer la capsule 10-cm sur la plaque métallique qui recouvre la cuvette 15-cm de culture de tissu rempli de glace. Toutes les autres étapes devraient se faire sous le microscope de dissection. </li><li> Avec des ciseaux petit ressort enlever les restes du thymus, de la plèvre, membrane (à l&#39;intérieur) et les muscles pectoraux (en dehors; figure 1B-D). </li><li> Pour monter l&#39;explant dans le plat de 3,5 cm, disséquer off toutes les nervures qui ne sont pas insérer au sternum. Le mieux est d&#39;utiliser des ciseaux à ressort petites et couper le tissu entre les nervures (figure 1E). </li><li> Epingler la triangularis sterni nerf-muscle explant dans le Sylgard enduit de 3,5 cm boîte de culture tissulaire en utilisant des épingles minuties (raccourci à &lt;4 mm; figure 1G). Deux broches doivent passer par cartilagineux (blanc) parties du sternum. Insérer au moins deux repères à travers les nervures à la fois sur le côté gauche et droit de la ièmee explant viser les parties molles cartilagineux et en évitant les nervures sous ou à proximité du muscle triangularis. Les broches sont plus utilisés, le mieux (nous utilisons habituellement 8-10). Comme vous coincer la préparation, assurez-vous que les nervures sont peu répandue, la fixation du muscle dans une position légèrement tendus. </li><li> En option: Visualisez les sites synaptiques contenant récepteurs de l&#39;acétylcholine en ajoutant bungarotoxine couplé à des colorants Alexa (concentration de 0,8 pg / ml dans 5% de CO 2/95% O 2-bulles solution de Ringer). Incuber explant coincé dans Sylgard plat couché pendant 15-20 min à température ambiante puis laver plusieurs fois avec 5% de CO 2/95% O 2-bulles solution de Ringer. </li></ol> 2. SC blanchir et option Time-lapse de microscopie (figure 2) Timing: 30 - 45 min + option 1 à 5 h pour le laps de temps. <ol><li> Transfert de 3,5 cm Sylgard enduit plat pour un esprit microscope confocal équipéh un laser argon (488 nm de longueur d&#39;onde) et les objectifs à immersion à eau (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA et 100x, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA). </li><li> En option pour la microscopie time-lapse: Insérer 3,5 cm Sylgard enduit plat dans l&#39;anneau de chauffage, installer un système de surfusion et la sonde de température (figure 2A). Assurez-vous qu&#39;aucun d&#39;entre eux touchent l&#39;explant, le bord de l&#39;assiette ou le revêtement Sylgard. Chauffer l&#39;échantillon à 33-35 ° C. Pour le SC blanchiment sans time-lapse, la température ambiante est meilleure, car les cellules afficher moins dynamique entre les étapes de blanchiment. </li><li> Avec un objectif 4x observer air modèle innervation du muscle sterni triangularis et trouver triangularis bande flasque manubrium. Mettez à tremper 20x-cône objectif et commencer à regarder pour les régions superficielles dans la bande de flasque (côtes zones sus-jacentes sont de bons candidats). Modifier l&#39;objectif 100x ou 60x trempage cône objectif de vérifier JNM individuels. Idéal est un NMJ qui est couvert par plusieurs SC et est situé très superficially (figure 2B). Si vous effectuez imagerie time-lapse après le blanchiment, sélectionnez jusqu&#39;à 3 JNM qui sont relativement proches les unes pour augmenter le rendement. </li><li> Acquérir une image confocale de la jonction neuromusculaire avant photo-blanchiment SC individuelles (figure 2B). (Pour l&#39;imagerie haute résolution, par exemple sur un microscope Olympus FV1000, utiliser un 100x, 1,0 NA objectif zoom et 2,5, ce qui conduit à de Nyquist-échantillonnage limité de ~ 0,1 um par pixel.) </li><li> &quot;Park&quot; le faisceau laser de 488 nm au centre sur le noyau d&#39;un SC en utilisant la puissance maximale pendant 5 secondes (encore un modèle de balayage efficace dans une petite région d&#39;intérêt peut être utilisé, tel que la &quot;tornade scan&quot; sur un microscope Olympus; car nous utilisons un microscope confocal, le laser est focalisé dans les plans image-conjugués et, par conséquent, à 488 nm avec un objectif de 1,0 NA, &lt;0,5 um de diamètre). Recentrer sur la cellule et le juge de blanchiment résultat. Si nécessaire, répétez étape de blanchiment à nouveau jusqu&#39;à ce que les niveaux de GFP sont de réduired à la quasi-fond les niveaux. Acquérir une image après le blanchiment (figure 2C). Il est essentiel de veiller à ce que la région blanchie est en dehors de tout chevauchement entre les deux cellules - s&#39;il ya chevauchement, de blanchiment dans une deuxième cellule sera évidente. </li><li> Répétez l&#39;étape ci-dessus jusqu&#39;à ce que tous sauf un sont blanchis SC (figure 2D-E). Le dernier «écrus» SC est adapté pour confocale microscopie time-lapse. Reconstruire des cellules individuelles par soustraction d&#39;images, par exemple en utilisant le logiciel Photoshop, pour délimiter seule morphologie SC et territoire (figure 2F). Soyez conscient du fait que la soustraction de deux mages ajoute du bruit (par exemple, en les important dans consécutifs &quot;couches&quot; dans Photoshop, puis définir le canal supérieur à la «différence» dans le menu déroulant en haut de l&#39;onglet canaux). Cela peut être contournée en utilisant le mode &quot;Dépoussiérer&quot; sur les canaux avant soustraction et de culture loin n&#39;importe quel fond qui ne veut évidemment pas provenir de lacellule blanchie. Pour optimiser le contraste, il peut être nécessaire d&#39;ajuster la luminosité des deux canaux dans le &quot;niveau&quot; fenêtre. L&#39;image résultante de la cellule blanchie est superposée à l&#39;image de l&#39;original d&#39;une synapse, pseudo-couleur dans une teinte unique et rendu transparent à la couleur sur le territoire de la cellule blanchie dans l&#39;image d&#39;origine (à partir de cela pendant toute la dernière blanchie et , les cellules écrus l&#39;image affichée dans les résultats 2F Figure). </li><li> En option: Démarrer confocale microscopie time-lapse après le blanchiment tous sauf un SC. Prendre une photo à des intervalles fixes (par exemple toutes les 5 min à 10). Utiliser en tant que puissance laser faible que possible. Jusqu&#39;à 3 JNM peuvent être visualisés à la même session. </li><li> Faire une carte des JNM temps expiré en prenant une image à 100x sans zoom, puis des images de la région en utilisant 20x et objectifs 4x (figure 2G-I). Cette «carte» est nécessaire pour trouver JNM après immunohistochimie d&#39;un muscle fixe. </li><li> Pour l&#39;imagede traitement, de convertir des images individuelles dans les projections d&#39;intensité maximale et enregistrer au format TIFF. Mélanger tous les z-projetées points temporels dans une pile et aligner en xy, par exemple en utilisant le &quot;stackreg&quot; plugin 10 en Fidji (un package basé sur le logiciel libre ImageJ, National Institutes of Health). </li></ol> 3. Fixation et immunohistochimie (Figure 3) Timing: Nuit. <ol><li> Transférer l&#39;explant dans un tube de réaction de 50 ml contenant au moins 15 ml PFA à 4% en prenant soin de retirer les broches. Post-fixer la paroi thoracique antérieure contenant le muscle triangularis sterni pendant 1 heure sur la glace. Rincer le tissu fixe avec 0,1 M de glycine dans du PBS (pour étancher fixateur résiduel et donc de réduire de fond) pendant au moins 10 min. Les échantillons peuvent être conservés à ce point et exécutée plus tard. </li><li> Transfert explant fixe à un 10-cm Sylgard tissu enduit boîte de culture rempli de PBS 0,01 M. Découpez une forme trapézoïdale avec une siparallèlement au sternum de l&#39;autre à travers les transitions os-cartilage - contient le muscle triangularis sur sa surface. Enlever la partie inférieure côtes avec une horizontale (trans-sternale) découpé de telle sorte que l&#39;extrémité caudale du muscle triangularis peut être librement accessibles (figure 3A-D). </li><li> Insérer une aiguille hypodermique comme une broche dans la partie supérieure du trapèze (figure 3E). Utilisez une aiguille hypodermique attachée à une seringue de 1 ml et une pince pour retirer le muscle triangularis sur la surface doucement en maintenant un coin caudale du muscle et en utilisant l&#39;aiguille comme un micro-scalpel. Assurez-vous que les coupes sont faites parallèlement au plan de la paroi thoracique. Une fois la partie caudale du muscle est relâché, insérez une autre aiguille hypodermique comme une épingle en dessous du muscle à travers la paroi thoracique - ce immobilise la préparation et permet d&#39;exercer une légère traction sur le muscle en utilisant une pince (figure 3F). Comme vous coupez tiss conjonctifinsertions ue, &quot;peler&quot; loin le muscle du thorax. Couper dernière pièce jointe caudale avec des ciseaux à ressort. Retirer les restes de graisse et le sang des vaisseaux à l&#39;aide de pinces. Veillez à ne pas déchirer loin les nerfs. Remarque: Utilisez des ensembles d&#39;outils distincts et des plats pour travailler avec des tissus vivants et fixe. </li><li> Début immunohistochimie (en utilisant un protocole standard) en transférant des échantillons de tissu dans une solution de blocage pendant 1 heure sur un agitateur à température ambiante. Plus petit volume possible pour la coloration est de 200 ul en utilisant une plaque de 96 puits. </li><li> Appliquer un anticorps primaire dilué dans une solution de blocage, 200 ul par puits, une nuit à 4 ° C sur un agitateur. </li><li> Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min. </li><li> Appliquer une anticorps secondaire pendant 1-2 heures à la température ambiante dilué dans une solution de blocage. </li><li> Laver dans du PBS 0,01 M à trois reprises pendant 10 min. </li><li> Montez dans la lutte anti-fading support (par exemple Vectashield) et la lamelle. </li><li> Placer la lame sur une plaque de métal magnétique, aimant placer sur le dessusde l&#39;échantillon pour aplatir pendant quelques heures ou toute la nuit à 4 ° C. Sceller avec du vernis à ongles. </li></ol>

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	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants.">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li><li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena.">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li><li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode de blanchiment SC présenté ici est simple, rapide et polyvalent: (i) Il permet de révéler la morphologie unique SC et la dynamique par microscopie confocale basée sur un seul transgène - ce qui est un avantage non négligeable lorsque l&#39;on combine l&#39;approche avec par exemple des modèles de maladies qui nécessitent des allèles supplémentaires . (Ii) Le procédé est rapide, à partir de dissection de fixation peut être effectuée en une demi-journée. (Iii) Le nombre de demandes es...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Société (exemple) </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Une solution d&#39;éthanol à 70% (vol / vol) </td><td> Roth </td><td> T913.1 </td><td> en vaporisateur </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene, Abbott </td><td></td><td> tout autre anesthésique approuvé peut être utilisé pour l&#39;anesthésie mortelle </td></tr><tr><td> des souris transgéniques (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> être obtenue à partir de sources citées </td></tr><tr><td> microscope à dissection avec lumière froide éclairage </td><td> Olympus SZ51 </td><td></td><td> équipé d&#39;Schott KL LCD 1500 </td></tr><tr><td> pince #2 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> forceps n ° 5 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux, grand médicaux </td><td> Outils Fine Science </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> ciseaux, petite coudée à ressort </td><td> Outils Fine Science </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> en ligne réchauffeur </td><td> Warner Instruments </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> chauffage anneau de 3,5 cm de plats </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> système à deux canaux de contrôle de température </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Système de pompe superfusion </td><td></td><td></td><td> custom-built </td></tr><tr><td> 15 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> rempli de glace et recouvert par une plaque métallique </td></tr><tr><td> 10 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> avec une solution de Ringer oxygénée de </td></tr><tr><td> 3,5 cm boîte de culture tissulaire </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> rempli avec du Sylgard polymère </td></tr><tr><td> Sylgard polymère </td><td> Dow Corning </td><td> Sylgard 184 Kit élastomère silicone </td><td></td></tr><tr><td> Microscope confocal </td><td> Olympe </td><td> FV1000 </td><td> avec de l&#39;argon laser </td></tr><tr><td> Tube de réaction de 50 ml </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> 4% dans du PBS PFA </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Canule 0,5 x mm 25 mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> seringue de 1 ml </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> anticorps synaptophysine </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> lapin </td></tr><tr><td> anticorps secondaire </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> Alexa 594 </td></tr><tr><td> Plaque de 24 puits </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> PBS 0,01 M </td><td> Sigma </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> 0,1 M glycine dans du PBS </td><td> Roth </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> lamelles </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> diapositives </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Laboratoires Vecteur </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> épingles minuties × 10 </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-20 </td><td> abrégée &lt;4 mm </td></tr><tr><td> α-bungarotoxine couplé à Alexa 594 </td><td> Invitrogen (Molecular Probes) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Blocking Solution </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2% de Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de sérum de chèvre normal </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1% de sérum albumine bovine </td><td> Sigma </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sonneur barboter avec 95% O 2/5% de CO 2 </td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2,5 mM KCl </td><td> Sigma </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1,25 mM de NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 mM NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mM de CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> 21114 </td><td></td></tr><tr><td> MgCl 2 1 mM </td><td> Sigma </td><td> 63020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 mM de glucose </td><td> Sigma </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs spécifiques et des équipements. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

Séquentielle photo-blanchiment constitue un moyen non invasif d&#39;étiqueter SC individuels à la jonction neuromusculaire. Le MNJ est le plus grand des synapses du système nerveux des mammifères et a servi comme directeur de modèle pour étudier la structure et la fonction synaptique. Dans souris terminaux JNM axone moteur former des sites de contact bretzel comme avec des fibres musculaires. L&#39;axone moteur et sa borne sont gainés par SC. Au cours des dernières décennies, plusieurs souris transgéniques ont été générés pour visualiser les neurones moteurs et de SC, par exemple Thy1-XFP 1 et PLP-GFP souris 2, respectivement. Le long des axones moteurs, myélinisantes SC axonales sont disposées en se chevauchant pas noeuds, séparés par des nœuds de Ranvier, afin de permettre la propagation saltatoire potentiel d&#39;action. En revanche, SC terminaux à la synapse sont spécialisés cellules gliales, qui surveiller et de promouvoir la neurotransmission, digérer les débris et les guides axones. JNM sont hermétique jusqu&#39;à une demi-douzaine non myelnaires SC terminaux - ceux-ci, cependant, ne peuvent pas être résolus individuellement par microscopie optique, car ils sont en contact direct de la membrane 3. Plusieurs approches existent pour visualiser individuellement SC terminaux. Aucun d&#39;entre eux sont impeccables, bien. Par exemple, le remplissage de colorant, où les cellules isolées sont empalé avec une micro-électrode de colorant remplie, nécessite détruire une cellule marqué avant de le remplir une seconde. Ce n&#39;est pas compatible avec la suite enregistrements time-lapse 3. Multi-spectrale &quot;Brainbow&quot; étiquetage des castes a été réalisé en utilisant l&#39;expression combinatoire des protéines fluorescentes 4. Cependant, cette technique nécessite la combinaison de plusieurs transgènes et est limitée par le profil d&#39;expression des promoteurs utilisés. À l&#39;avenir, l&#39;expression de &quot;photo-commutables&quot; protéines dans SC pourrait être encore un autre 5 alternative. Ici, nous présentons photo-blanchiment séquentiel, où les cellules individuelles sont blanchis, et leur image obtenue par soustraction. Nous croyonsque cette approche - en raison de sa facilité et la polyvalence - représente un ajout à la palette de technologies durables de la neuroscientifique, en particulier car il peut être utilisé in vivo et transférés à d&#39;autres types cellulaires, sites anatomiques ou des espèces 6. Dans le protocole suivant, nous détaillons l&#39;application de la séquence de blanchiment et après confocale time-lapse de microscopie à SC terminaux dans des explants musculaires triangularis manubrium. Cette fine, superficielle et facilement disséquée préparation nerf-muscle 7,8 s&#39;est avéré utile pour les études de NMJ développement, la physiologie et la pathologie 9. Enfin, nous expliquons comment le muscle triangularis manubrium est préparé après la fixation d&#39;effectuer une corrélation à haute résolution imagerie confocale, immunohistochimie ou examens ultrastructuraux.

Un exemple d&#39;un explant triangularis sterni prêt pour l&#39;imagerie plat est illustré à la figure 1G. Cette explant est particulièrement adapté pour l&#39;imagerie JNM ex vivo que le muscle triangularis composée uniquement de quelques couches de fibres musculaires. Ceci permet d&#39;obtenir des images haute définition à partir d&#39;explants issus de lignées de souris transgéniques qui supporte clou SC (PLP-GFP 2) et / ou des axones (Thy1-XFP 1)....

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Visualisation des cellules individuelles dans les tissus densément emballés, comme les cellules de Schwann terminales (SC) à jonctions neuromusculaires (JNM), est un défi. &quot;Sequential photo-blanchiment&quot; permet la délimitation SC seul terminal, par exemple dans le muscle explant sterni triangularis, une pratique nerf-muscle préparation, où séquentiel de blanchiment peut être combiné avec le temps écoulé et d&#39;imagerie<em&gt; Post-hoc</em&gt; Immunomarquages.

Séquentielle photo-blanchiment sur le tracé de cellules de Schwann simple à la jonction neuromusculaire

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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Neuroscience

10.5K vues.  Technische Universität München. Visualisation des cellules individuelles dans les tissus densément emballés, comme les cellules de Schwann terminales (SC) à jonctions neuromusculaires (JNM), est un défi. "Sequential photo-blanchiment" permet la délimitation SC seul terminal, par exemple dans le muscle explant sterni triangularis, une pratique nerf-muscle préparation, où séquentiel de blanchiment peut être combiné avec le temps écoulé et d'imagerie Post-hoc Immuno...

Vidéo: Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissection et l&#39;imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

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Neurosciences

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Dissection du muscle Transversus Abdominis pour l’analyse de jonction neuromusculaire à montage entier

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

Détection de<em&gt; In Situ</em&gt; complexes protéine-protéine à la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Pourquoi Quantification Matters: Caractérisation des phénotypes au<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire jonction neuromusculaire

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

In Vivo Transfert de gènes à des cellules de Schwann dans le nerf sciatique Rongeur par électroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Mesurer la fonctionnalité jonction neuromusculaire

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Focal Macropatch enregistrements de courants synaptiques de la jonction neuromusculaire larves de drosophile

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissection et immunohistochimie de la jambe adulte de la drosophile pour détecter les changements à la jonction neuromusculaire d’un motoneurone identifié

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Enregistrement des transitoires calciques dans la jonction neuromusculaire de souris à haute résolution temporelle par microscopie confocale

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

Visualiser les caractéristiques morphologiques de la jonction neuromusculaire dans le muscle gastrocnémien médian du rat

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...