تشريح ألياف العضلات الهيكل العظمي واحد للتحليلات immunofluorescent ومورفومتري من تقاطعات العصبية والعضلية جبل كامل. هذا الفيديو سوف تظهر بروتوكولا لتشريح فعال وآمن EDL وعضلات سولوس مع نهج قابل للتكرار. هذا الفيديو سوف يعلم أيضا كيفية الحصول على كامل جبل تقاطعات العصبية والعضلية بهدف التعرف على مكونات متشابك مع سلامة 3D للسماح لتحليل مورفومتري دقيقة.
لتشريح العضلات، هناك حاجة إلى هذه الأدوات الجراحية. لبدء العملية، ضع الحيوان مع البطن التي تواجه صعودا. إجراء شق الأولي باستخدام شفرة الجراحية بين أصابع الساقين نحو الأطراف الخلفية.
قشر قبالة الجلد، وسحب صعودا حتى يتعرض الركبة اليمنى. للعثور على EDL، اتبع أوتار القدم إلى الرباط الحلقي. هذا الرباط يدور حول وترين.
قطع الرباط مع مقص Uniband بين الأوتار اثنين. تحديد وتر EDL عن طريق رفع كليهما ورؤية أي واحد يجعل أصابع قدم التحرك صعودا. قطع الوتر مع مقص.
أثناء الإمساك بالوتر باستخدام ملاقط بيولوجية ، ابدأ في فصل عضلة EDL ببطء عن عضلات الأطراف الخلفية الأخرى. يمكن فصل العضلات دون التسبب في تلف عن طريق إجراء تخفيضات مختلفة على بقية العضلات الجانبية لفتح مسار بينهما، في حين عقد ورفع العضلات من قسم تقسيم وتر EDL. لعزل العضلات تماما، وقطع الوتر الذي تعلق على ركبة الفئران باستخدام مقص Uniband.
تزج العضلات تشريح في الحل التثبيتي، وترك الأمر لمدة 24 ساعة في أربع درجات مئوية. بشكل عام، من المفيد أن يكون لديك عضلة ممدود. للقيام بذلك، استخدم الورق المقوى والمواد الغذائية لإرفاق العضلات لتثبيت.
لعزل العضلة الوحيدة، الوجه الحيوان. من خلال الجلد، وقطع وتر كالكانيكال باستخدام شفرة الجراحية. مع مساعدة من ملاقط البيولوجية ومقص Uniband، فصل عضلة المعدة والأمعاء من العظام، وخلق غطاء العضلات.
سوف يكون الوحيد على الجانب الداخلي من الغطاء العضلي. ويمكن التعرف عليه لأنه أحمر ومسطح. مع زوج من الملاقط البيولوجية، والوصول إلى ورفع وتر الوحيد الذي يقع فوق الجهاز الهضمي أعلاه.
قطع الوتر مع مقص Uniband. رفع العضلات كلها في حين قطع بعض نقاط التعلق ضعيفة. وأخيرا، لتحرير العضلات الوحيدة تماما، وقطع الحوييلة الوحيدة التي تشكل وتر كالكانيال.
كرر خطوة التثبيت كما فعلت مع عضلة EDL. لاستخدام هذه الطريقة، من المهم لتأمين المواد الغذائية الأساسية إلى الأوتار وليس إلى العضلات. مرة واحدة في فترة 24 ساعة من التثبيت قد مرت، شطف العضلات في حل DPBS قبل البدء في عزل ألياف العضلات.
من أجل عزل الألياف، عقد بلطف واحدة من الأوتار مع زوج واحد من الملاقط البيولوجية. ثم مع الزوج الآخر من الملاقط البيولوجية، تبدأ قرصة ببطء وتر لفصل ألياف العضلات. لعزل الألياف، سحب ببطء صعودا نحو وتر العضلات المعاكس.
سيكون من الضروري تكرار هذا الإجراء عدة مرات حتى الحصول على حزم متعددة وصغيرة ومعزولة. بمجرد فصلها في حزم معزولة صغيرة ، ضعها بعناية في شريحة silanized المعالجة مسبقا. فمن الضروري للحفاظ على جميع الألياف منظم بحيث لا تتداخل.
عند هذه النقطة، يمكن ترك الألياف للهواء الجاف لمدة 24 ساعة. بعد 24 ساعة، تبدأ في الحصول على المناعة. لإنشاء حاجز مقاوم للماء، استخدم قلم PAP لتطويق ألياف العضلات المعزولة في الشريحة المعالجة مسبقا.
هذا مثال على صورة confocal عالية الدقة التي يمكن الحصول عليها بعد البروتوكول الموضح هنا. في أعلى اليسار، يظهر عنصر ما بعد متشابك، وعلى أعلى اليمين، عنصر ما قبل متشابك، في حين أن الصور السفلية تظهر مكونات متشابك المخطط من أجل توضيح المعلمات التي سيتم استخدامها لتحليل مورفومتري. تظهر الشريحة الثانية دمج الإشارات قبل وبعد متشابك مع وصمة عار نواة API.
الاختلافات بين التقاطعات العصبية والعضلية للحيوانات المعدلة وراثيا والحيوانات غير المعدلة وراثيا واضحة للعيان. يظهر التحليل المورفومتري للتقاطعات العصبية والعضلية أدلة على الإشارة ما بعد المتشابكة في الحيوانات المعدلة وراثيا ويبدو أنه أكثر إحكاما ، ويرجع ذلك بشكل رئيسي إلى انخفاض المساحة الإجمالية للتقاطع العصبي العضلي. كما هو موضح هنا ، يتم تقليل منطقة التقاطع العصبي العضلي قبل المتشابك للحيوان المعدل وراثيا.
وكان أصغر ما تم اكتشافه هو الذي عثر عليه مع إشارة السمية العصبية المضادة للفوسفور، كما هو مبين في الصورة B، على سبيل المثال. تظهر الصورة الأخيرة النتائج المتعلقة بحالة الوصلات العصبية العضلية الكاملة. وباستخدام مؤشر التغطية، ثبت أن التقاطعات العصبية العضلية المعدلة وراثيا قد تم تفكيكها جزئيا.
أيضا، فإنه يمكن تحديد أن التغطية والعلاقة من الفوسفوريلات العصبية أقل مما تم الحصول عليها عندما يتم الكشف عن neurofilament غير الفوسفورية. يسمح البروتوكول المقترح بالحصول على مستحضرات تقاطع عصبية عضلية عالية الجودة من ألياف العضلات البطيئة والسريعة. تم تحديد مكونات التقاطع العصبي العضلي قبل وبعد متشابك من قبل تحقيقات محددة أو أجسام مضادة، ومن ثم صورت في المجهر confocal أو فائقة الدقة confocal، مما يتيح التحليل المورفومتري على مقياس ميكرومتري.
