بروتوكولنا يسمح بقياس معدل نشاط الأوتوفاجي والبروتيسوم في أنسجة الماوس وحساسة بما يكفي للكشف عن الاختلافات circadian داخل هذه الأنشطة. يمكن استخدام هذه التقنية في الجسم الحي لتقييم تقويض البروتين في الخلايا والأنسجة والمواد المطلوبة هي منخفضة التقنية نسبيا ويمكن الوصول إليها من قبل أي مختبر البيولوجيا الجزيئية. (سيُظهر الإجراء أن (ميخائيل Ryzhikov ، بعد الدكتوراه من مختبري
لمدة خمسة عشر دقيقة قبل كل نقطة زمنية، وسخّن حلول الأسهم leupeptin وbortezomib لدرجة حرارة الغرفة وتمييع بورتزوميب المذاب في PBS العقيمة لتسفر عن 50 ملليغرام في حل العمل المليلتر. بالنسبة لإدارة مثبطات البروتياز، يحقن داخل الصفاق 40 ملليغرام لكل كيلوغرام من الليبوبيتين أو 1.6 ميكروغرام لكل كيلوغرام من البورتيزميب في كل تجريبي. للسيطرة السلبية، حقن الفئران مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
عودة كل ماوس إلى أقفاص مجمعة حسب نوع العلاج الواردة كما يتم حقنها وتسجيل الوقت الذي يتم التعامل مع الفئران أو التلاعب بها في جدول موحد. بعد ساعتين من الحقن، غمر فص الكبد الأيسر الذي يتم حصاده من كل تجريبي تم التضحية به في سبعة ملليلترات من عازل التجانس البارد في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر على الجليد. عندما تم الحصول على جميع العينات، نقل العينة الأولى وكامل حجم التخزين المؤقت التجانس في 15 ملليلتر قدرة التجانس Dounce والتجانس العينة مع 10 السكتات الدماغية من المكبس فضفاضة و 15 السكتات الدماغية من المكبس ضيق.
العودة تجانس الخام الناتجة إلى أنبوب الأصلي والتجانس العينة التالية كما أظهرت للتو. عندما تم تجانس جميع العينات، رواسب النوى المتجانسة والحطام عن طريق الطرد المركزي ونقل المليلترات الأربعة العليا من كل عظمى بعد النووية إلى أنابيب جديدة 15 ملليلتر. تحديد تركيز البروتين من هذا الكسر فوق الأولية وفقا للبروتوكولات القياسية ومعادلة تركيزات جميع العينات إلى 2.1 ملليغرام لكل ملليلتر مع العازلة التجانس الطازجة حسب الضرورة.
لتحليل المصب وتحسين الجودة، aliquot 500 ميكرولترات من الكسور البروتينية الإجمالية تطبيع في أنابيب microcentuge 1.5 ملليلتر للتخزين ناقص 80 درجة مئوية. نقل 1.5 ملليلتر من كل من الكسور البروتينية الإجمالية المتبقية في أنابيب الطرد المجهري الفردية و بيليه عينات البروتين عن طريق الطرد المركزي. نقل ملليلتر واحد من عظمى الكسور الثانية الناتجة إلى أنابيب جديدة microcentrifuge على الجليد وpireate المتبقون من المواد الفوقية.
غسل الكريات 3K مرتين في 1.5 ملليلتر من عازلة التجانس الباردة الطازجة في غسل، ثم resuspend بيليه 3K في 200 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة SDS-PAGE وغلي العينات في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تدور الكسور الثانية supernatants لمدة 20 دقيقة في 20، 000 × ز وأربع درجات مئوية ونقل الكسور السيتوبلازمية الثالثة الناتجة عن ذلك إلى أنبوب جديد microcentrifuge. لتحليل SDS-PAGE، والجمع بين 150 ميكرولترات من الكسر السيتوبلازمي مع 50 ميكرولترات من 4x SDS-PAGE عينة العازلة وغلي عينات الكسر السيتوبلازمي في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
التعرق المتبقية من الكريات 20K وغسل العينات مرتين مع 1.5 ملليلتر من عازلة التجانس الباردة الطازجة في غسل. ثم إعادة تعليق بيليه 20K في 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت عينة SDS-PAGE للغليان في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتحليل البقعة الغربية، وتخفيف تسلسلي بروتينات منحنى القياسية واحد إلى ثلاثة في 1x عينة العازلة لما مجموعه ستة المخففات وتحميل 10 ميكرولترات من كل عينة منحنى القياسية في بئر واحد من 26 جيدا أربعة إلى 12٪ SDS-PAGE ميدي هلام، ثم تحميل معيار الوزن الجزيئي التجاري الملطخة.
لقياس التدفق الذاتي، قم بتحميل 12 ميكرولترات من كل عينة بيليه 3K في الآبار المناسبة. لقياس تدفق البروتيسوم، قم بتحميل 12 ميكرولترات من كل كسر سيتوبلازميك في الآبار المناسبة. عندما تم تحميل جميع العينات التحكم والتجريبية، وفصل عينات البروتين من قبل SDS-PAGE قبل نقل البروتينات إلى أغشية فلوريد بوليفينيدين وفقا للبروتوكولات القياسية.
لتحليل تدفق macroautophagic، أغشية لطخة تحتوي على عينات بيليه 3K مع الأجسام المضادة المضادة p62 أو LcB بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. لتحليل تدفق البروتيسوم، أغشية لطخة تحتوي على عينات الكسر السيتوبلازمي مع المضادة للليسين 48-محددة بولي أوبيكيتين الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. ثم صورة البقع الغربية باستخدام الأجسام المضادة الثانوية القياسية وأجهزة التصوير.
لإجراء قياسات كثافة على النطاقات ذات الأهمية لكل من المنحنى القياسي والعينات التجريبية، افتح برنامج تحليل الصور المناسب وارسم مستطيلًا طويلًا يشمل مونومر البروتين من الفائدة في الجزء السفلي من الصورة التي تمتد إلى أعلى الغشاء. نسخ ولصق لنقل المستطيل إلى العينات المتبقية، مع الحفاظ على المستطيل متناسقة بين العينات. حفظ القياس الكمي إلى جدول بيانات وإنشاء منحنى قياسي كثافة داخل جدول البيانات باستخدام عينة قياسية مخففة تسلسليا في الانحدار خطية أو متعددة الحدود للحصول على أفضل معادلة منحنى قياسي.
باستخدام هذه المعادلة، استقراء كمية مونومرات الفائدة داخل العينات التجريبية. للحصول على قياسات تدفق، طرح كمية البروتين استقراء كل عينة المعالجة المانع من متوسط قيمة العينات برنامج تلفزيوني من نفس النقطة الزمنية. ثم تقييم الأهمية الإحصائية للتغير الزمني في دوران البروتين باستخدام ANOVA في اتجاه واحد.
القراءة الأولية لتدفق autophagic في أي نقطة زمنية معينة هو الفرق في كمية علامات محددة macroautophagy بين leupeptin المعالجة مقابل عينات صورية في 3K lysosome المخصب 3K كسور بيليه مقسومة على اثنين. عادةً ما يتم تطبيع النتائج إلى الوسط الذي يبسط المقارنة عبر التجارب المستقلة. يعتمد إجراءنا لقياس التدفق البروتيالي على قدرة ليوبيتين أو بورتيزميب على التسبب في تراكم ركائز autophagy وproteasome ، وهي عملية تعتمد على الوقت.
وقد سمحت هذه التقنية استكشاف كيفية الإيقاعات البيولوجية برنامج هدم بروتين الكبد. ونأمل أن يمهد الطريق للتحقيق في آثار المرض على وظائف التدبير المنزلي الخلوي.
